一種高效分離微藻種質(zhì)資源的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種高效分離微藻種質(zhì)資源的方法。它是將待分離樣品均勻地滴或噴在瓊脂培養(yǎng)基“槽紋”平板上，并使樣品流進(jìn)平板的“槽紋”中，將培養(yǎng)皿封口進(jìn)行培養(yǎng)，若上述“槽紋”平板中出現(xiàn)綠色、藍(lán)色、褐色或紫色的單藻落，即為待分離樣品中的微藻種類，挑出單藻落進(jìn)行進(jìn)一步的純化，即可獲得純化的微藻藻種；所述的瓊脂培養(yǎng)基“槽紋”平板是指在瓊脂培養(yǎng)基上具有許多的“槽紋”。本發(fā)明通過瓊脂培養(yǎng)基“槽紋”平板，實(shí)現(xiàn)高效分離微藻種質(zhì)資源的目的。“槽紋”接種避免涂布造成的細(xì)胞損傷，又能較長時(shí)間地為藻細(xì)胞提供相對(duì)穩(wěn)定的“微環(huán)境”，有利于細(xì)胞穩(wěn)定分裂增殖，在短時(shí)間內(nèi)獲得純化微藻種質(zhì)，容易獲得采用一般分離方法難以獲得的微藻種質(zhì)。
【專利說明】一種高效分離微藻種質(zhì)資源的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于微藻生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種從待分離樣品中高效分離微藻種質(zhì)資源的方法。

【背景技術(shù)】
[0002]微藻是一類能進(jìn)行光合作用的自養(yǎng)微生物，具有生長周期短、光合效率高、細(xì)胞代謝產(chǎn)物種類豐富等特點(diǎn)。同時(shí)，微藻細(xì)胞主要成分是多糖、蛋白質(zhì)、色素和脂肪酸等有應(yīng)用價(jià)值的活性物質(zhì)。因此，微藻在食品、醫(yī)藥、基因工程、液體燃料等領(lǐng)域都展現(xiàn)出很好的開發(fā)前景。
[0003]微藻分布廣泛，在陸地、海洋、淡水湖泊，雪山、森林、甚至一些比較極端的環(huán)境如高溫的溫泉中均有發(fā)現(xiàn)。微藻種類繁多，據(jù)估計(jì)全球超過5萬余種，然而，迄今已知的約3萬種，實(shí)現(xiàn)工業(yè)化應(yīng)用的不超過20種。其中，真正大規(guī)模產(chǎn)業(yè)開發(fā)的主要是螺旋藻、小球藻、鹽藻和雨生紅球藻等數(shù)種。這些藻類均具有以下的一個(gè)或數(shù)個(gè)特點(diǎn):對(duì)高堿和(或)高鹽的適應(yīng)性強(qiáng)、生長快速或富含高值化的活性物質(zhì)。因此，優(yōu)良的藻種是微藻實(shí)現(xiàn)工業(yè)化應(yīng)用的基礎(chǔ)和關(guān)鍵。利用基因工程手段針對(duì)性地改良微藻特性是微藻生物技術(shù)發(fā)展的一個(gè)方向，然而迄今對(duì)藻類的各種功能基因和代謝途徑等方面的了解還比較欠缺，遺傳改良的研宄工作開展得并不多。
[0004]從自然界中分離微藻種質(zhì)資源是篩選、獲得生產(chǎn)性狀穩(wěn)定、抗逆性好、活性物質(zhì)豐富的野生藻株的基礎(chǔ)工作。目前，用于微藻分離的技術(shù)方法有以下幾種:微細(xì)吸管(毛細(xì)管)分離法、水滴分離法、稀釋分離法、瓊脂平板法即固體培養(yǎng)基分離法。這些方法都存在一些不足:微細(xì)吸管(毛細(xì)管)分離法一般只適于分離個(gè)體較大的藻類，并對(duì)操作者要求有較高的技術(shù)熟練程度、需要足夠的細(xì)心和耐心；水滴分離法操作簡便，但比較適宜于分離預(yù)培養(yǎng)中出現(xiàn)的優(yōu)勢種類和受少量生物污染培養(yǎng)液中的藻類；稀釋分離法操作簡單易行，但有一定程度盲目性；水滴分離法和稀釋法要真正到達(dá)分離純化的時(shí)間比較長；瓊脂平板法包括涂布、劃線和噴霧三種方式。這方法操作簡單，適用于大部分藻種的分離，且效果最好，容易得到單一的純種藻落，是微藻分離的優(yōu)選方法。然而，這種方法仍存不足。其一，如:涂布法，涂布棒反復(fù)涂布均勻細(xì)胞時(shí)直接對(duì)藻細(xì)胞產(chǎn)生機(jī)械損傷，在這個(gè)過程中，一些細(xì)胞數(shù)量少、相對(duì)脆弱的細(xì)胞因受損而不容易分離得到；其二，固體平板分離微藻一般選擇一種或者數(shù)種培養(yǎng)基，適宜該培養(yǎng)基的微藻快速生長起來，成為優(yōu)勢種，然而有些不適宜該培養(yǎng)基或者“停滯期”較長的微藻需要經(jīng)過比較長時(shí)間的適應(yīng)才能進(jìn)行細(xì)胞分裂增殖，在培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)皿平板中的水分蒸發(fā)，鹽度改變、瓊脂平板的濕度逐漸降低，導(dǎo)致具有上述特性的這部分微藻細(xì)胞將很可能無法長成藻落。因此，采用目前這些技術(shù)方法，仍然有相當(dāng)一部分微藻種質(zhì)資源無法獲得，許多優(yōu)質(zhì)藻種未能為人所知。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有分離技術(shù)方法存在的不足，提供一種分離效果更為理想的高效分離微藻種質(zhì)資源的方法，從而提高微藻種質(zhì)資源分離效率。
[0006]本發(fā)明的高效分離微藻種質(zhì)資源的方法，其特征在于，包括以下步驟:
[0007]將待分離樣品均勻地滴或噴在瓊脂培養(yǎng)基“槽紋”平板上，并使樣品流進(jìn)平板的“槽紋”中，將培養(yǎng)皿封口進(jìn)行培養(yǎng)，若上述“槽紋”平板中出現(xiàn)綠色、藍(lán)色、褐色或紫色的單藻落，即為待分離樣品中的微藻種類，挑出單藻落進(jìn)行進(jìn)一步的純化，即可獲得純化的微藻藻種；
[0008]所述的瓊脂培養(yǎng)基“槽紋”平板是指在瓊脂培養(yǎng)基上具有許多的“槽紋”。
[0009]所述的將培養(yǎng)皿封口進(jìn)行培養(yǎng)是在溫度15-40 °C，光強(qiáng)10-40 μ mo I n^s—1條件下培養(yǎng)5-20天。
[0010]所述的瓊脂培養(yǎng)基“槽紋”平板優(yōu)選通過以下方法制備:瓊脂培養(yǎng)基經(jīng)高壓滅菌后，冷卻到40?60°C，倒入培養(yǎng)皿待凝固后，在瓊脂培養(yǎng)基上方放置一張稍小于培養(yǎng)皿的帶網(wǎng)眼的材料，繼續(xù)倒入培養(yǎng)基，將帶網(wǎng)眼的材料完全覆蓋，待培養(yǎng)基完全凝固后取下帶網(wǎng)眼的材料，固體培養(yǎng)基上留下“槽紋”，即得瓊脂培養(yǎng)基“槽紋”平板。
[0011]所述的帶網(wǎng)眼的材料優(yōu)選為帶網(wǎng)眼的布料、面料或不銹鋼材料。進(jìn)一步優(yōu)選為篩絹。
[0012]所述的瓊脂培養(yǎng)基為加入瓊脂的海水微藻培養(yǎng)基或淡水微藻培養(yǎng)基，根據(jù)所采集的待分離樣品而定，如樣品是淡水來源的，則用淡水微藻培養(yǎng)基，如果樣品是海水來源的，則用海水微藻培養(yǎng)基，這屬于本領(lǐng)域的常規(guī)知識(shí)。
[0013]所述的待分離樣品為野外采集的水樣、土壤樣、受污染的微藻培養(yǎng)液、經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)的水樣或土壤樣，經(jīng)過稀釋或者濃縮到合適的濃度后作為待分離樣品。
[0014]所述篩絹為有網(wǎng)眼的面料。
[0015]所述的挑出單藻落進(jìn)行進(jìn)一步的純化優(yōu)選是將挑出單藻落作為待分離樣品，經(jīng)培養(yǎng)基稀釋后，均勻地滴或噴在瓊脂培養(yǎng)基“槽紋”平板上，并使樣品流進(jìn)平板的“槽紋”中，將培養(yǎng)皿封口，倒置在溫度15-40°C，光強(qiáng)10-40 μ mol n^s—1條件下培養(yǎng)5_20天，出現(xiàn)單藻落，挑出單藻落，重復(fù)上述純化步驟若干次，即可獲得純化的微藻藻種。
[0016]本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)方法，具有如下的優(yōu)點(diǎn):
[0017]本發(fā)明僅通過簡單的瓊脂培養(yǎng)基“槽紋”平板，實(shí)現(xiàn)高效分離微藻種質(zhì)資源的目的?！安奂y”平板接種避免涂布造成的細(xì)胞損傷，“槽紋”又能較長時(shí)間地為藻細(xì)胞提供相對(duì)穩(wěn)定的“微環(huán)境”，有利于細(xì)胞穩(wěn)定分裂增殖，在短時(shí)間內(nèi)獲得純化微藻種質(zhì)，容易獲得采用一般分離方法難以獲得的微藻種質(zhì)。該方法適宜用于分離各種個(gè)體的微藻；對(duì)操作和設(shè)備要求低；分離時(shí)間短；實(shí)用性強(qiáng)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]圖1為本發(fā)明的瓊脂培養(yǎng)基“槽紋”平板上的“槽紋”；
[0019]圖2為常規(guī)的普通平板和瓊脂培養(yǎng)基“槽紋”平板分離淡水微藻藻種的效果比較；
[0020]圖3為常規(guī)的普通平板和瓊脂培養(yǎng)基“槽紋”平板分離海水微藻藻種的效果比較。

【具體實(shí)施方式】
[0021]以下實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說明，而不是對(duì)本發(fā)明的限制。
[0022]實(shí)施例1:
[0023]瓊脂培養(yǎng)基“槽紋”平板的制備:
[0024]BGll瓊脂培養(yǎng)基(即在BGll培養(yǎng)基中加入常量的瓊脂，如質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.5?2%的瓊脂)經(jīng)高壓滅菌后，冷卻到55?60°C，在9cm的培養(yǎng)皿中加入12ml BGll瓊脂培養(yǎng)基，待凝固后，在BGll瓊脂培養(yǎng)基上方放置一張平整的直徑稍微小于培養(yǎng)皿的400目尼龍篩絹，然后繼續(xù)倒入5ml培養(yǎng)基，待BGll瓊脂培養(yǎng)基完全凝固用鑷子輕輕將篩絹取下，BGll瓊脂培養(yǎng)基上留下篩絹條紋，即得BGll瓊脂培養(yǎng)基“槽紋”平板，“槽紋”如圖1所示。
[0025]樣品采自廣州海珠區(qū)濱江西路珠江邊的親水平臺(tái)，用經(jīng)過滅菌的50ml離心管取親水平臺(tái)底部的水樣，蓋緊蓋子，密封后帶回實(shí)驗(yàn)室置于弱光，27°C保存。取1ml樣品進(jìn)行離心(4000gX，3min)，去掉上清，加入新鮮的BGll培養(yǎng)基，稀釋到適中的細(xì)胞濃度作為待分離樣品，取100 μ I待分離樣品均勻滴到BGll瓊脂培養(yǎng)基“槽紋”平板上，輕輕的左右前后傾斜平板，讓樣品流進(jìn)平板的“槽紋”中，然后再用涂布棒將高于瓊脂平板的樣品液體推進(jìn)“槽紋”中。普通涂布平板(沒有“槽紋”的BGll瓊脂培養(yǎng)基平板，其他條件相同)作為對(duì)照。將接種了待分離樣品的平板封口倒置于光照培養(yǎng)架中于溫度25-28?，光強(qiáng)20 μπιο?HT2iT1條件下培養(yǎng)。第6天后BGll瓊脂培養(yǎng)基“槽紋”平板中央長出現(xiàn)褐色、藍(lán)色或綠色單藻落(見圖2-Β)，即為待分離樣品中微藻種類。BGll瓊脂培養(yǎng)基“槽紋”平板可觀察到藻落要早于普通瓊脂平板，第6天時(shí)藻落個(gè)體明顯大于普通平板的藻落，藻落分布比較均勻。通過顯微鏡檢查，在BGll瓊脂培養(yǎng)基“槽紋”平板上直接觀察藻細(xì)胞的形態(tài)，用牙簽挑出各種形態(tài)的單藻株進(jìn)一步進(jìn)行純化，如取單藻落加入新鮮的BGll培養(yǎng)基，稀釋到適中的細(xì)胞濃度作為待分離樣品，取100 μ I待分離樣品均勻滴到BGll瓊脂培養(yǎng)基“槽紋”平板上，輕輕的左右前后傾斜平板，讓樣品流進(jìn)平板的“槽紋”中，然后再用涂布棒將高于瓊脂平板的樣品液體推進(jìn)“槽紋”中。將接種了待分離樣品的平板封口倒置于光照培養(yǎng)架中于溫度25-280C，光強(qiáng)20 μ mol IrT2iT1條件下培養(yǎng)，得到單藻落，如此重復(fù)該純化步驟3_4個(gè)周期，即可得到該待分離樣品中的微藻種類。
[0026]實(shí)施例2
[0027]瓊脂培養(yǎng)基“槽紋”平板的制備:
[0028]Bf/2瓊脂培養(yǎng)基(即在m培養(yǎng)基中加入常量的瓊脂，如質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.5?2%的瓊脂)經(jīng)高壓滅菌后，冷卻到55?60°C，在9cm的培養(yǎng)皿中加入12ml f/2瓊脂培養(yǎng)基，待凝固后，在f/2瓊脂培養(yǎng)基上方放置一張平整的直徑稍微小于培養(yǎng)的400目尼龍篩絹，然后繼續(xù)倒入5mlf/2瓊脂培養(yǎng)基，待f/2瓊脂培養(yǎng)基完全凝固用鑷子輕輕將篩絹取下，f/2瓊脂培養(yǎng)基上留下篩絹條紋，即得f/2瓊脂培養(yǎng)基“槽紋”平板，“槽紋”如圖1所示。
[0029]樣品采自湛江港寶滿集裝箱碼頭，用礦泉水瓶采集水樣，蓋緊蓋子，密封后帶回實(shí)驗(yàn)室置于弱光，27°C保存。取100 μ I樣品作為待分離樣品均勻滴到f/2瓊脂培養(yǎng)基“槽紋”平板上，輕輕的左右前后傾斜平板，讓樣品流進(jìn)平板的“槽紋”中，然后再用涂布棒將高于瓊脂平板的樣品液體輕輕推進(jìn)“槽紋”中；普通涂布平板(沒有“槽紋”的f/2瓊脂培養(yǎng)基平板，其他條件相同)作為對(duì)照。將做好的平板封口倒置于光照培養(yǎng)架中25-28?，20μπιΟ1HT2s-1條件下培養(yǎng)。第15天，除了與普通的平板一樣出現(xiàn)了一種綠藻，一種絲狀藍(lán)藻和一種細(xì)桿狀藍(lán)藻外，“槽紋”平板上還長出一株鏈狀硅藻單藻落(見圖3-Β右上角小圖)。用牙簽挑出各種形態(tài)的單藻株進(jìn)一步進(jìn)行純化，如在新的m瓊脂培養(yǎng)基“槽紋”平板重復(fù)上述純化步驟3-4個(gè)周期，即可得到該待分離樣品中的微藻種類。
【權(quán)利要求】
1.一種高效分離微藻種質(zhì)資源的方法，其特征在于，包括以下步驟: 將待分離樣品均勻地滴或噴在瓊脂培養(yǎng)基“槽紋”平板上，并使樣品流進(jìn)平板的“槽紋”中，將培養(yǎng)皿封口進(jìn)行培養(yǎng)，若上述“槽紋”平板中出現(xiàn)綠色、藍(lán)色、褐色或紫色的單藻落，即為待分離樣品中的微藻種類，挑出單藻落進(jìn)行進(jìn)一步的純化，即可獲得純化的微藻藻種； 所述的瓊脂培養(yǎng)基“槽紋”平板是指在瓊脂培養(yǎng)基上具有許多的“槽紋”。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的將培養(yǎng)皿封口進(jìn)行培養(yǎng)是在溫度15-40 °C，光強(qiáng) 10-40 μ mo I m 2S 1 條件下培養(yǎng) 5-20 天。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的瓊脂培養(yǎng)基“槽紋”平板是通過以下方法制備:瓊脂培養(yǎng)基經(jīng)高壓滅菌后，冷卻到40?60°C，倒入培養(yǎng)皿待凝固后，在瓊脂培養(yǎng)基上方放置一張稍小于培養(yǎng)皿的帶網(wǎng)眼的材料，繼續(xù)倒入培養(yǎng)基，將帶網(wǎng)眼的材料完全覆蓋，待培養(yǎng)基完全凝固后取下帶網(wǎng)眼的材料，固體培養(yǎng)基上留下“槽紋”，即得瓊脂培養(yǎng)基“槽紋”平板。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述的帶網(wǎng)眼的材料為帶網(wǎng)眼的布料、面料或不銹鋼材料。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述的帶網(wǎng)眼的材料為篩絹。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的挑出單藻落進(jìn)行進(jìn)一步的純化是將挑出單藻落作為待分離樣品，經(jīng)培養(yǎng)基稀釋后，均勻地滴或噴在瓊脂培養(yǎng)基“槽紋”平板上，并使樣品流進(jìn)平板的“槽紋”中，將培養(yǎng)皿封口，倒置在溫度15-40 °C，光強(qiáng)10-40 μ mo IHT2iT1條件下培養(yǎng)5-20天，出現(xiàn)單藻落，挑出單藻落，重復(fù)上述純化步驟若干次，即可獲得純化的微藻藻種。
【文檔編號(hào)】C12N1/20GK104450526SQ201410649473
【公開日】2015年3月25日 申請(qǐng)日期:2014年11月14日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月14日
【發(fā)明者】吳華蓮, 向文洲, 李濤, 王廣華, 戴世鯤, 何慧, 范潔偉 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院南海海洋研究所