鑒定或輔助鑒定禽流感病毒及其h6n1亞型的引物對組合物與應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了鑒定或輔助鑒定禽流感病毒及其H6N1亞型的引物對組合物與應(yīng)用。本發(fā)明所提供的鑒定或輔助鑒定禽流感病毒及其H6N1亞型的引物對組合物與應(yīng)用為組合物1、組合物2或組合物3；組合物1由名稱為H6的PCR引物對、名稱為N1的PCR引物對和名稱為M的PCR引物對組成；H6由序列表中SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的兩條單鏈DNA組成；N1由序列表中SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示的兩條單鏈DNA組成；M由序列表中SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示的兩條單鏈DNA組成；組合物2由所述H6和所述M組成；組合物3由所述N1和所述M組成。
【專利說明】鑒定或輔助鑒定禽流感病毒及其H6N1亞型的引物對組合 物與應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中鑒定或輔助鑒定禽流感病毒及其H6N1亞型的引物對 組合物與應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 禽流感病毒（Avian Influenza Virus, AIV)根據(jù)表面糖蛋白（Hemagglutinin, HA) 和神經(jīng)氨酸酶（Neuraminidase, NA)抗原性差異分為不同的亞型，目前已發(fā)現(xiàn)有16種HA亞 型（H1-H16)和9種NA亞型（N1-N9)，HA和NA的組合可產(chǎn)生至少135種亞型，其中，H5和 H7亞型中的部分組合（H5N1、H7N7和H7N9等）稱為高致病性AIV，可感染人類并致死。低 致病性AIV感染雖然無任何癥狀或表現(xiàn)溫和的、輕微的不典型癥狀，對畜禽和人類的健康 不具威脅性，但當(dāng)不同亞型的低致病性AIV毒株混合感染畜禽時，可以在動物體內(nèi)互相交 換基因，從而產(chǎn)生無法預(yù)測致病性和傳染性的新變異株，這將對禽類和人類健康存在很大 的威脅。
[0003] H6亞型AIV屬于低致病性AIV，但有報道表明1997年在香港爆發(fā)感染人的高致病 性H5N1病毒，除HA基因外，其余7個基因片段都與A/teal/Hong Kong/W312/97(H6Nl)病 毒高度相似，因此H6亞型AIV很可能成為高致病性H5亞型AIV的基因供體。2013年6月， 臺灣發(fā)現(xiàn)了第一例人感染型H6N1亞型AIV，是一種低致病性禽流感病毒，其HA基因由臺灣 H6亞型AIV支內(nèi)進(jìn)化而來。
[0004] 雁形目（鴨子、鵝、天鵝）和鵒形目（岸禽類鳥、鷗、燕鷗、海雀）是AIV潛伏的主 要自然宿主，其中特別是水禽，是所有亞型AIV的儲存庫，并經(jīng)糞便排毒污染水系，通過直 接傳播或候鳥的南北遷徙將病毒進(jìn)一步散播開來，感染其它禽類和哺乳動物，因此水禽被 認(rèn)為是流感病毒的天然儲存庫和新毒株的重要來源，在流感病毒的遺傳進(jìn)化和生態(tài)分布中 具有重要作用。低致病性AIV在健康鴨群中潛伏、繁殖和排毒，也可通過基因重排導(dǎo)致高致 病性禽流感的爆發(fā)，危害養(yǎng)禽業(yè)的安全，亦可能進(jìn)化為可突破種間屏障的人禽流感病毒，危 害人類健康。
[0005] 病毒分離與鑒定是經(jīng)典的流感檢測方法，即先將樣品接種SPF雞胚增殖病毒2-5 天，再收集雞胚尿囊液進(jìn)行血凝試驗和血凝抑制試驗，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，但存在檢測周期長的 缺點。酶聯(lián)免疫吸附試驗可檢測禽流感的抗原，但需要特定的標(biāo)準(zhǔn)陽性血清。RT-PCR、實時 熒光定量RT-PCR和環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增等分子生物學(xué)方法廣泛應(yīng)用于禽流感病毒的檢測。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是如何鑒定禽流感病毒，并確定其HA亞型是否為H6 亞型及其NA亞型是否為Nl亞型。
[0007] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明首先提供了鑒定或輔助鑒定禽流感病毒的引物對組 合物。
[0008] 本發(fā)明所提供的鑒定或輔助鑒定禽流感病毒的引物對組合物，為組合物1、組合物 2或組合物3 ;
[0009] 所述組合物1由獨立包裝的三個引物對組成，即由名稱為H6的PCR引物對、名稱 為Nl的PCR引物對和名稱為M的PCR引物對組成；
[0010] 所述H6由序列表中SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所示的兩條單鏈DNA組成；所述 Nl由序列表中SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4所示的兩條單鏈DNA組成；所述M由序列表中 SEQ ID No. 5和SEQ ID No. 6所示的兩條單鏈DNA組成；
[0011] 所述組合物2由獨立包裝的兩個引物對組成，即由所述H6和所述M組成；
[0012] 所述組合物3由獨立包裝的兩個引物對組成，即由所述Nl和所述M組成。
[0013] 上述鑒定或輔助鑒定禽流感病毒的引物對組合物中，所述組合物1為鑒定或輔助 鑒定禽流感病毒及其H6N1亞型的引物對組合物，所述組合物2為鑒定或輔助鑒定禽流感病 毒及其H6亞型的引物對組合物，所述組合物3為鑒定或輔助鑒定禽流感病毒及其Nl亞型 的引物對組合物。
[0014] 上述鑒定或輔助鑒定禽流感病毒的引物對組合物中，所述H6、所述Nl和所述M均 可獨立包裝。
[0015] 其中，所述H6可以H6亞型禽流感病毒為模板進(jìn)行RT-PCR獲得447bp的DNA片段； 所述Nl可以Nl亞型禽流感病毒為模板進(jìn)行RT-PCR獲得325bp的DNA片段；所述M可以禽 流感病毒為模板進(jìn)行RT-PCR獲得669bp的DNA片段。
[0016] 上述鑒定或輔助鑒定禽流感病毒的引物對組合物中，所述H6、所述Nl和所述M這 三種引物對可以單獨使用分別進(jìn)行單獨的RT-PCR，也可以組合使用進(jìn)行多重RT-PCR。這三 種引物對組合使用的方式有多種，可以是其中任兩種引物對組合在一起使用，也可以是三 種引物對組合在一起使用。
[0017] 這三種引物對單獨使用時，本申請的鑒定或輔助鑒定禽流感病毒的引物對組合物 中這三種引物對的配比沒有要求。這三種引物對組合在一起使用時，所述H6、所述Nl和所 述M的摩爾比為2 :1 :1。如這三種引物對中的所述H6和所述M組合在一起使用時，所述H6 和所述M的摩爾比為2 :1 ;如這三種引物對中的所述Nl和所述M組合在一起使用時，所述 Nl和所述M的摩爾比為I : 1。
[0018] 本申請中，每種引物對中的兩條單鏈DNA的摩爾比均為1 :1。
[0019] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了鑒定或輔助鑒定禽流感病毒的PCR引物 對。
[0020] 本發(fā)明所提供的鑒定或輔助鑒定禽流感病毒的PCR引物對為上述M，所述M由序列 表中SEQ ID No. 5和SEQ ID No. 6所示的兩條單鏈DNA組成。
[0021] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了鑒定或輔助鑒定禽流感病毒的試劑或試劑 盒。
[0022] 本發(fā)明所提供的鑒定或輔助鑒定禽流感病毒的試劑或試劑盒為下述H或I或J或 K ：
[0023] H、含有所述組合物1的試劑或試劑盒；
[0024] I、含有所述組合物2的試劑或試劑盒；
[0025] J、含有所述組合物3的試劑或試劑盒；
[0026] K、含有所述M的試劑或試劑盒。
[0027] 上述試劑或試劑盒中，所述試劑或試劑盒還包括反轉(zhuǎn)錄酶。
[0028] 上述試劑或試劑盒中，所述試劑或試劑盒還包括2Χ ISt印Buffer和 PrimeScript IStep Enzyme Mix。
[0029] 上述試劑或試劑盒中，所述H還包括記載有下述HI)和H2)的說明書：
[0030] Hl)在同一個PCR反應(yīng)體系中，以待測生物樣品的核酸（RNA或DNA)為模板，選用 50-57°C的退火溫度，用所述組合物1進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到PCR產(chǎn)物；
[0031] H2)檢測步驟Hl)得到的PCR產(chǎn)物的大小，如果所述PCR產(chǎn)物中含有447bp和 669bp的DNA片段，所述待測樣品含有H6亞型的禽流感病毒或候選含有H6亞型的禽流感病 毒；如果所述PCR產(chǎn)物中不含有447bp的DNA片段，所述待測樣品不含有H6亞型的禽流感 病毒或候選不含有H6亞型的禽流感病毒；如果所述PCR產(chǎn)物中含有325bp和669bp的DNA 片段，所述待測樣品含有Nl亞型的禽流感病毒或候選含有Nl亞型的禽流感病毒；如果所述 PCR產(chǎn)物中不含有325bp的DNA片段，所述待測樣品不含有Nl亞型的禽流感病毒或候選不 含有Nl亞型的禽流感病毒；如果所述PCR產(chǎn)物中含有669bp的DNA片段，所述待測樣品含 有禽流感病毒或候選含有禽流感病毒；如果所述PCR產(chǎn)物中不含有669bp的DNA片段，所述 待測樣品不含禽流感病毒或候選不含禽流感病毒。
[0032] 上述試劑或試劑盒中，Hl)的RT-PCR體系中，每25 μ L RT-PCR反應(yīng)體系含有： 2 X IStep Buffer 12.5 μ L，PrimeScript IStep Enzyme Mix lyL，SEQ ID No. 1、3和 5所 示單鏈DNA，SEQ ID No. 2、4和6所示單鏈DNA，濃度為IOng/ μ L的待測病毒RNA 1 μ L，以 無 RNA酶的超純水補(bǔ)足25 μ L，使SEQ ID No. 1和2所示單鏈DNA的終濃度均為0. 4 μ Μ，使 SEQ ID No. 3和4所示單鏈DNA的終濃度均為0. 2 μ Μ，使SEQ ID No. 5和6所示單鏈DNA 的終濃度均為〇. 2 μ M。
[0033] 所述 RT-PCR 的反應(yīng)程序如下：50°C 30min，94 °C 2min ;94°C 30s，50-57 °C 30s， 72°C 30s，30 個循環(huán)；72°C 10min。
[0034] 上述試劑或試劑盒中，所述50_57°C具體可為52°C。
[0035] 上述試劑或試劑盒中，所述I還包括記載有下述II)和12)的說明書：
[0036] II)在同一個PCR反應(yīng)體系中，以待測生物樣品的核酸（RNA或DNA)為模板，選用 50-57°C的退火溫度，用所述組合物2進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到PCR產(chǎn)物；
[0037] 12)檢測步驟II)得到的PCR產(chǎn)物的大小，如果所述PCR產(chǎn)物中含有447bp和 669bp的DNA片段，所述待測樣品含有H6亞型的禽流感病毒或候選含有H6亞型的禽流感病 毒；如果所述PCR產(chǎn)物中不含有447bp的DNA片段，所述待測樣品不含有H6亞型的禽流感 病毒或候選不含有H6亞型的禽流感病毒；如果所述PCR產(chǎn)物中含有669bp的DNA片段，所 述待測樣品含有禽流感病毒或候選含有禽流感病毒；如果所述PCR產(chǎn)物中不含有669bp的 DNA片段，所述待測樣品不含禽流感病毒或候選不含禽流感病毒。
[0038] 上述試劑或試劑盒中，II)的RT-PCR體系中，每25 μ L RT-PCR反應(yīng)體系含有： 2 X IStep Buffer 12.5 μ L，PrimeScript IStep Enzyme Mix lyL，SEQ ID No. 1 和 5所不 單鏈DNA，SEQ ID No. 2和6所示單鏈DNA，濃度為IOng/ μ L的待測病毒RNA 1 μ L，以無 RNA 酶的超純水補(bǔ)足25 μ L，使SEQ ID No. 1和2所示單鏈DNA的終濃度均為0. 4 μ Μ，使SEQ ID No. 5和6所示單鏈DNA的終濃度均為0. 2 μ Μ。
[0039] 所述 RT-PCR 的反應(yīng)程序如下：50°C 30min，94 °C 2min ;94°C 30s，50-57 °C 30s， 72°C 30s，30 個循環(huán)；72°C lOmin。
[0040] 上述試劑或試劑盒中，所述50-57°C具體可為52°C。
[0041] 上述試劑或試劑盒中，所述J還包括記載有下述Jl)和J2)的說明書：
[0042] Jl)在同一個PCR反應(yīng)體系中，以待測生物樣品的核酸（RNA或DNA)為模板，選用 50-57°C的退火溫度，用所述組合物3進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到PCR產(chǎn)物；
[0043] J2)檢測步驟Jl)得到的PCR產(chǎn)物的大小，如果所述PCR產(chǎn)物中含有325bp和 669bp的DNA片段，所述待測樣品含有Nl亞型的禽流感病毒或候選含有Nl亞型的禽流感病 毒；如果所述PCR產(chǎn)物中不含有325bp的DNA片段，所述待測樣品不含有Nl亞型的禽流感 病毒或候選不含有Nl亞型的禽流感病毒；如果所述PCR產(chǎn)物中含有669bp的DNA片段，所 述待測樣品含有禽流感病毒或候選含有禽流感病毒；如果所述PCR產(chǎn)物中不含有669bp的 DNA片段，所述待測樣品不含禽流感病毒或候選不含禽流感病毒。
[0044] 上述試劑或試劑盒中，Jl)的RT-PCR體系中，每25 μ L RT-PCR反應(yīng)體系含有： 2 X IStep Buffer 12.5 μ L，PrimeScript IStep Enzyme Mix lyL，SEQ ID No. 3和 5所不 單鏈DNA，SEQ ID No. 4和6所示單鏈DNA，濃度為IOng/ μ L的待測病毒RNA 1 μ L，以無 RNA 酶的超純水補(bǔ)足25 μ L，使SEQ ID No. 3和4所示單鏈DNA的終濃度均為0. 2 μ Μ，使SEQ ID No. 5和6所示單鏈DNA的終濃度均為0. 2 μ Μ。
[0045] 所述 RT-PCR 的反應(yīng)程序如下：50°C 30min，94 °C 2min ;94°C 30s，50-57 °C 30s， 72°C 30s，30 個循環(huán)；72°C 10min。
[0046] 上述試劑或試劑盒中，所述50_57°C具體可為52°C。
[0047] 上述試劑或試劑盒中，所述K還包括記載有下述Kl)和K2)的說明書：
[0048] Kl)在同一個PCR反應(yīng)體系中，以待測生物樣品的核酸（RNA或DNA)為模板，選用 50-57°C的退火溫度，用所述M進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到PCR產(chǎn)物；
[0049] K2)檢測步驟Kl)得到的PCR產(chǎn)物的大小，如果所述PCR產(chǎn)物中含有669bp的DNA 片段，所述待測樣品含有禽流感病毒或候選含有禽流感病毒；如果所述PCR產(chǎn)物中不含有 669bp的DNA片段，所述待測樣品不含禽流感病毒或候選不含禽流感病毒。
[0050] 上述試劑或試劑盒中，Kl)的RT-PCR體系中，每25 μ L RT-PCR反應(yīng)體系含有： 2 X IStep Buffer 12.5 μ L，PrimeScript IStep Enzyme Mix 1 μ L，SEQ ID No. 5 所不單鏈 DNA，SEQ ID No. 6所示單鏈DNA，濃度為IOng/ μ L的待測病毒RNA 1 μ L，以無 RNA酶的超 純水補(bǔ)足25 μ L，使SEQ ID No. 5和6所示單鏈DNA的終濃度均為0. 2 μ Μ。
[0051] 所述 RT-PCR 的反應(yīng)程序如下：50°C 30min，94 °C 2min ;94°C 30s，50-57 °C 30s， 72°C 30s，30 個循環(huán)；72°C 10min。
[0052] 上述試劑或試劑盒中，所述50_57°C具體可為52°C。
[0053] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了引物對組合物或鑒定或輔助鑒定禽流感病 毒的試劑或試劑盒的制備方法。
[0054] 本發(fā)明所提供的引物對組合物或鑒定或輔助鑒定禽流感病毒的試劑或試劑盒的 制備方法中，所述引物對組合物為所述組合物1、所述組合物2或所述組合物3,所述鑒定或 輔助鑒定禽流感病毒的試劑或試劑盒為上述H或I或J ;所述引物對組合物或鑒定或輔助 鑒定禽流感病毒的試劑或試劑盒的制備方法包括將所述組合物1、所述組合物2或所述組 合物3中各引物對的所述兩條單鏈DNA分別單獨包裝的步驟。
[0055] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了 PCR引物對或鑒定或輔助鑒定禽流感病毒 的試劑或試劑盒的制備方法。
[0056] 本發(fā)明所提供的PCR引物對或鑒定或輔助鑒定禽流感病毒的試劑或試劑盒的制 備方法中，所述PCR引物對為所述M，所述鑒定或輔助鑒定禽流感病毒的試劑或試劑盒為上 述K ;所述PCR引物對或鑒定或輔助鑒定禽流感病毒的試劑或試劑盒的制備方法包括將所 述M的所述兩條單鏈DNA分別單獨包裝的步驟。
[0057] 本申請中的 2 X IStep Buffer 和 PrimeScript IStep Enzyme Mix 均為 PrimeScript One Step RT-PCR Kit Ver. 2 中試劑，PrimeScript One Step RT-PCR Kit Ver. 2為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品，貨號為RR055A。
[0058] 實驗證明，用本發(fā)明的引物對組合物1以H6N1亞型的禽流感病毒RNA為模板進(jìn)行 的RT-PCR，能擴(kuò)增出大小為447bp、325bp和669bp的條帶，用本發(fā)明的引物對組合物1以 H6Nx (X尹1)亞型的禽流感病毒RNA為模板進(jìn)行的RT-PCR，能擴(kuò)增出大小為447bp和669bp 的條帶，用本發(fā)明的引物對組合物1以HxNl (X尹6)亞型的禽流感病毒RNA為模板進(jìn)行的 RT-PCR，能擴(kuò)增出大小為325bp和669bp的條帶，用本發(fā)明的引物對組合物1以HxNy (X尹6， y尹1)亞型的禽流感病毒RNA為模板進(jìn)行的RT-PCR，能擴(kuò)增出大小為669bp的條帶，用本 發(fā)明的引物對組合物1以其他病毒核酸為模板進(jìn)行的三重RT-PCR，均不能擴(kuò)增出條帶，表 明本發(fā)明的引物對組合物可用來鑒定禽流感病毒及其H6亞型、Nl亞型。
[0059] 本發(fā)明的引物對組合物對H6N1亞型AIV具有較高的靈敏度和特異性：本發(fā)明的引 物對組合物1能檢測出500拷貝/25 μ L的H6N1亞型AIV ;本發(fā)明的引物對組合物1能特 異性地檢測禽流感病毒、Η6Ν1亞型禽流感病毒、Η6亞型禽流感病毒和Nl亞型禽流感病毒。
[0060] 相比傳統(tǒng)的病毒分離方法和序列測定方法，利用本發(fā)明的引物對組合物進(jìn)行三重 RT-PCR鑒定禽流感病毒的方法，節(jié)約了檢測試劑，簡化了反應(yīng)程序，且結(jié)果與病毒分離鑒定 和序列測定一致。因此，利用本發(fā)明的引物對組合物進(jìn)行三重RT-PCR鑒定禽流感病毒的方 法是一種簡便、快速、有效的檢測技術(shù)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0061] 圖1為本發(fā)明的引物對組合物的敏感性實驗結(jié)果。其中，泳道M為DL lOOOMarker， 泳道1為H6N1RNA終濃度為5X IO7拷貝/25 μ L，泳道2為H6N1RNA終濃度為5X IO6拷貝 /25 μ L，泳道3為H6N1RNA終濃度為5 X IO5拷貝/25 μ L，泳道4為H6N1RNA終濃度為5 X IO4 拷貝/25 μ L，泳道5為H6N1RNA終濃度為5 X IO3拷貝/25 μ L，泳道6為H6N1RNA終濃度為 500拷貝/25 μ L，泳道7為H6N1RNA終濃度為50拷貝/25 μ L，泳道8為陰性對照。
[0062] 圖2為本發(fā)明的引物對組合物的特異性實驗結(jié)果。其中，泳道M為DL lOOOMarker， 泳道1為H6N1，泳道2為H6N1，泳道3為H6N2,泳道4為H6N2,泳道5為H6N5,泳道6為 H6N6,泳道7為H6N6,泳道8為H6N8,泳道9為H1N1，泳道10為H2N3,泳道11為H3N2,泳 道12為H4N5,泳道13為H5N1，泳道14為H7N2,泳道15為H8N4,泳道16為H9N2,泳道17 為H10N3,泳道18為H11N9,泳道19為H12N5,泳道20為H13N5,泳道21為NDV，泳道22為 IBV，泳道23為ILTV，泳道24為陰性對照。
[0063] 圖3為本發(fā)明的引物對組合物和引物對組合物N的三重RT-PCR結(jié)果。其中，泳道 M為DL IOOOMarker ;泳道1-5為引物對組合物N的三重RT-PCR結(jié)果，其中泳道1-4的模板 均為H6N1RNA，泳道5為陰性對照；泳道6-10為本發(fā)明的引物對組合物的三重RT-PCR結(jié)果， 其中泳道6-9的模板均為H6N1RNA，泳道10為陰性對照。

【具體實施方式】
[0064] 下面結(jié)合【具體實施方式】對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)描述，給出的實施例僅為了闡 明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。
[0065] 下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0066] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0067] 下述實施例中的 MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction 試劑盒（MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver. 4.0)為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品，貨號為9766。
[0068] 下述實施例中的 2 X IStep Buffer 和 PrimeScript IStep Enzyme Mix 均為 PrimeScript One Step RT-PCR Kit Ver. 2 中試劑，PrimeScript One Step RT-PCR Kit Ver. 2為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品，貨號為RR055A。
[0069] 下述實施例中的H6N8亞型禽流感病毒、HlNl亞型禽流感病毒、H2N3亞型禽流感 病毒、H3N2亞型禽流感病毒、H5N1亞型禽流感病毒、H7N2亞型禽流感病毒、H8N4亞型禽 流感病毒、H9N2亞型禽流感病毒和H12N5亞型禽流感病毒、新城疫病毒（NDV)、雞傳染性 支氣管炎病毒（IBV)、雞傳染性喉氣管炎病毒（ILTV) (Yi Peng, et al. Visual detection of H3 subtype avian influenza viruses by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification assay. Virology Journal, 2011，8:337)公眾可從廣西壯方矣自 治區(qū)獸醫(yī)研究所（即 申請人:）獲得，該生物材料只為重復(fù)本發(fā)明的相關(guān)實驗所用，不可作為 其它用途使用。
[0070] 下述實施例中的H6N1亞型禽流感病毒、H6N2亞型禽流感病毒、H6N5亞型禽流感 病毒和H6N6亞型禽流感病毒（周辰瑜，H6亞型禽流感病毒病原學(xué)監(jiān)測和快速檢測方法的 研究，廣西大學(xué)2012年碩士畢業(yè)論文，2012-06-01.)公眾可從廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所 (即 申請人:）獲得，該生物材料只為重復(fù)本發(fā)明的相關(guān)實驗所用，不可作為其它用途使用。
[0071] 下述實施例中的H4N5亞型禽流感病毒、H10N3亞型禽流感病毒和H11N9亞型禽流 感病毒（羅思思，謝芝勵，劉加波，等.H7N9亞型AIV雙重實時熒光定量RT-PCR檢測方法的 建立[J].動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2013, 34(12) :1-5.)公眾可從廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所（即申 請人）獲得，該生物材料只為重復(fù)本發(fā)明的相關(guān)實驗所用，不可作為其它用途使用。
[0072] 下述實施例中的H13N5亞型禽流感病毒（Xie Z，Pang Y S，Liu J，et al. A multiplex RT-PCR for detection of type a influenza virus and differentiation of avian H5, H7 and H9 hemagglutinin subtypes[J]. Mol Cell Probes,2006,20(3-4)： 245-249.)公眾可從廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所（即 申請人:）獲得，該生物材料只為重復(fù)本 發(fā)明的相關(guān)實驗所用，不可作為其它用途使用。
[0073] 下述實施例中的pGEM T-easy載體為Promega公司（美國）產(chǎn)品，貨號為A3600。
[0074] 實施例1、制備鑒定或輔助鑒定禽流感病毒的引物對組合物
[0075] 鑒定或輔助鑒定禽流感病毒（AIV)的引物對組合物，由名稱為H6的PCR引物對、 名稱為Nl的PCR引物對和名稱為M的PCR引物對組成；所述H6由序列表中SEQ ID No. 1所 示的單鏈DNA (H6-F)和SEQ ID No. 2所示的單鏈DNA (H6-R)組成，可從H6亞型的禽流感病 毒中擴(kuò)增出大小為447bp的條帶；所述Nl由序列表中SEQ ID No. 3所示的單鏈DNA (Nl-F) 和SEQ ID No. 4所示的單鏈DNA(Nl-R)組成，可從Nl亞型的禽流感病毒中擴(kuò)增出大小為 325bp的條帶；所述M由序列表中SEQ ID No. 5所示的單鏈DNA (M-F)和SEQ ID No. 6所示 的單鏈DNA(M-R)組成，可從禽流感病毒中擴(kuò)增出大小為669bp的條帶。
[0076] 上述鑒定或輔助鑒定禽流感病毒的引物對組合物中，所述H6、所述Nl和所述M獨 立包裝。每種引物對中的兩條單鏈DNA的摩爾比均為1 :1。
[0077] 實施例2、實施例1的鑒定或輔助鑒定禽流感病毒的引物對組合物的敏感性實驗
[0078] 按照MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction試劑盒說明書，從H6N1亞型禽流感病 毒抽提得到濃度為IOng/ μ L的H6N1亞型禽流感病毒總RNA (簡稱H6N1RNA)。
[0079] 分別用文獻(xiàn) Hoffmann Ε, Stech J, Guan Υ, et al. Universal primer set for the full-length amplification of all influenza A viruses [ J]. Arch Virol, 2001, 146:2275 - 2289 中 HA、NA 和 M 基因引物，以 H6N1RNA 為模板進(jìn)行 RT-PCR 擴(kuò) 增，反應(yīng)體系如下：2X IStep Buffer 12.5 μ L，PrimeScript IStep Enzyme Mix 1 μ L，HA 或NA或M基因的上游引物（25μΜ)0. 5yL，HA或NA或M基因的下游引物（25μΜ)0. 5yL， H6NlRNA(10ng/yL)lyL，以無 RNA酶的超純水補(bǔ)足25yL;反應(yīng)程序如下：94°C 5min， 94°C lmin、52°C I. 5min、72°C I. 5min、35 個循環(huán)，72°C 8min, KTC終止反應(yīng)。RT-PCR 擴(kuò)增結(jié) 束后分別得到1744bp的HA基因片段、1458bp的NA基因片段和1027bp的M基因片段，將這 三個基因片段分別連接至PGEM T-easy載體上，將含有HA基因片段的正確序列的重組載體 命名為T-H6,將含有NA基因片段的正確序列的重組載體命名為為T-Nl，將含有M基因片段 的正確序列的重組載體命名為為T-M。
[0080] 利用限制性內(nèi)切酶Spe I酶切重組載體T-H6,得到線性化T-H6,用RNA體外轉(zhuǎn)錄 試劑盒（美國Promega公司，貨號為P1280)轉(zhuǎn)錄線性化T-H6,并利用RNA純化試劑盒（寶 生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品，貨號為9767)純化轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，得到純化的T-H6RNA。
[0081] 按照上述方法，將T-H6分別替換為T-Nl和T-M，其他步驟均不變，分別得到純化的 T-NlRNA 和純化的 T-M RNA。
[0082] 利用NanoDrop ND-1000微量核酸檢測儀對T-H6RNA、T-NlRNA和T-M RNA進(jìn)行濃 度檢測，根據(jù)分子量和核酸濃度計算拷貝數(shù)，將T-H6RNA、T-NlRNA和T-M RNA進(jìn)行等拷貝數(shù) 混合，并進(jìn)行稀釋，分別得到T-H6RNA、T-N1RNA和T-M RNA的濃度均為5 X IO7拷貝/ μ L的 5 X IO7 拷貝 / μ L RNA、T-H6RNA、T-N1RNA 和 T-M RNA 的濃度均為 5 X IO6 拷貝 / μ L 的 5 X IO6 拷貝 / μ L RNA、T-H6RNA、T-NlRNA 和 T-M RNA 的濃度均為 5 X IO5 拷貝 / μ L 的 5 X IO5 拷貝 / μ L RNA、T-H6RNA、T-NlRNA 和 T-M RNA 的濃度均為 5 X IO4 拷貝 / μ L 的 5 X IO4 拷貝 / μ L RNA、T-H6RNA、T-NlRNA 和 T-M RNA 的濃度均為 5 X IO3 拷貝 / μ L 的 5 X IO3 拷貝 / μ L RNA、 T-H6RNA、T-NlRNA 和 T-M RNA 的濃度均為 500 拷貝 / μ L 的 500 拷貝 / μ L RNA、T-H6RNA、 T-NlRNA和T-M RNA的濃度均為50拷貝/ μ L的50拷貝/ μ L RNA。
[0083] 按照下述25 μ L的一步法RT-PCR反應(yīng)體系進(jìn)行三重RT-PCR :2 X ISt印 BufTerl2.5yL，P;rimeSc;ript IStep Enzyme Mix lyL，SEQ ID Νο·1、3 和 5 所不單鏈 DNA, SEQ ID No. 2、4和6所示單鏈DNA，5 X IO7拷貝/ μ L RNA 1 μ L，以無 RNA酶的超純水補(bǔ)足 25 μ L，使SEQ ID No. 1和2所示單鏈DNA的終濃度均為0. 4 μ Μ，使SEQ ID No. 3和4所示 單鏈DNA的終濃度均為0. 2 μ M，使SEQ ID No. 5和6所示單鏈DNA的終濃度均為0. 2 μ M， 得到5 X IO7拷貝RNA的反應(yīng)體系。
[0084] 按照上述方法，將"5 X IO7拷貝/ μ L RNA"分別替換為"5 X IO6拷貝/ μ L RNA"、 "5Xl〇1#W/yLRNA"、"5Xl〇4#W/yLRNA"、"5Xl〇1#W/yLRNA"、"5Xl〇1#W/ μ L RNA"或"5 X IO1拷貝/ μ L RNA"分別得到5 X IO6拷貝RNA的反應(yīng)體系、5 X IO5拷貝RNA 的反應(yīng)體系、5 X IO4拷貝RNA的反應(yīng)體系、5 X IO3拷貝RNA的反應(yīng)體系、500拷貝H6N1RNA的 反應(yīng)體系和50拷貝RNA的反應(yīng)體系。
[0085] 按照上述方法，將5Χ107拷貝/yL RNA替換為無 RNA超純水，得到陰性對照的反 應(yīng)體系。
[0086] 反應(yīng)程序均為：50°C 30min, 94°C 2min ;94°C 30s, 52°C 30s, 72°C 30s, 30 個循環(huán)； 72 °C 10min〇
[0087] 將各三重RT-PCR獲得的產(chǎn)物分別進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳（圖1)，結(jié)果顯示，5X107 拷貝?5X IO3拷貝RNA的反應(yīng)體系中均有3條明顯的擴(kuò)增條帶出現(xiàn)，片段大小分別為 447bp、325bp、669bp ;500拷貝RNA的的反應(yīng)體系中有2條擴(kuò)增條帶的出現(xiàn)，大小分別為 447bp、325bp，50拷貝RNA的反應(yīng)體系和陰性對照的反應(yīng)體系中均無擴(kuò)增條帶。因此，本發(fā) 明的引物對組合物最低能檢測到濃度為5X IO3拷貝/25 μ L的禽流感病毒以及500拷貝 /25 μ L的Η6Ν1亞型禽流感病毒。
[0088] 實施例3、實施例1的鑒定或輔助鑒定禽流感病毒的引物對組合物的特異性實驗
[0089] 1、檢測樣品的制備
[0090] 實驗中用到的病毒分別是Η6Ν1亞型禽流感病毒、Η6Ν2亞型禽流感病毒、Η6Ν5亞型 禽流感病毒、Η6Ν6亞型禽流感病毒、Η6Ν8亞型禽流感病毒、HlNl亞型禽流感病毒、Η2Ν3亞型 禽流感病毒、Η3Ν2亞型禽流感病毒、Η4Ν5亞型禽流感病毒、Η5Ν1亞型禽流感病毒、Η7Ν2亞 型禽流感病毒、Η8Ν4亞型禽流感病毒、Η9Ν2亞型禽流感病毒、Η10Ν3亞型禽流感病毒、Η11Ν9 亞型禽流感病毒、Η12Ν5亞型禽流感病毒和Η13Ν5亞型禽流感病毒、新城疫病毒（NDV)、傳染 性支氣管炎病毒（IBV)和傳染性喉氣管炎病毒（ILTV)。
[0091] 2、利用實施例1的引物對組合物對病毒的核酸進(jìn)行三重RT-PCR
[0092] 1)病毒RNA的提取
[0093] 按照MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction試劑盒說明書，分別抽提得到步驟1中 禽流感病毒（H6N1、H6N2、H6N5、H6N6、H6N8、HlNl、H2N3、H3N2、H4N5、H5N1、H7N2、H8N4、H9N2、 H10N3、H11N9、H12N5、H13N5 和 H15N8 亞型）、NDV、IBV 的總 RNA，提取得到 ILTV 的 DNA。
[0094] 2)三重RT-PCR反應(yīng)及電泳檢測
[0095] 分別以上述步驟1)中各個病毒的RNA為模板，以無 RNA超純水為陰性對照，利用 實施例1中的H6、Nl和M進(jìn)行三重RT-PCR。
[0096] 每個三重RT-PCR均為25 μ L的一步法RT-PCR反應(yīng)體系：2 X ISt印Buffer 12.5yL，PrimeScript ISt印 Enzyme Mix lyL，SEQ ID Νο·1、3 和 5 所示單鏈 DNA，SEQ ID No. 2、4和6所示單鏈DNA，濃度為IOng/ μ L的病毒核酸或無 RNA超純水1 μ L，以無 RNA酶 的超純水補(bǔ)足25 μ L，使SEQ ID No. 1和2所示單鏈DNA的終濃度均為0. 4 μ Μ，使SEQ ID No. 3和4所示單鏈DNA的終濃度均為0. 2 μ Μ，使SEQ ID No. 5和6所示單鏈DNA的終濃度 均為0. 2 μ M。
[0097] 反應(yīng)程序均為：50°C 30min, 94°C 2min ;94°C 30s, 52°C 30s, 72°C 30s, 30 個循環(huán)； 72 °C 10min〇
[0098] 將各三重RT-PCR獲得的產(chǎn)物分別進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳（圖2)，結(jié)果顯示，H6N1亞 型禽流感病毒（泳道1和2)擴(kuò)增出大小分別為325bp、447bp和669bp的條帶；H6N2亞型禽 流感病毒（泳道3和4)、H6N5亞型禽流感病毒（泳道5)、H6N6亞型禽流感病毒（泳道6和 7)和H6N8亞型禽流感病毒（泳道8)均擴(kuò)增出大小為447bp和669bp的條帶；HlNl亞型禽 流感病毒（泳道9)和H5N1亞型禽流感病毒（泳道13)均擴(kuò)增出大小為325bp和669bp的 條帶；H2N3亞型禽流感病毒（泳道10)、H3N2亞型禽流感病毒（泳道11)、H4N5亞型禽流感 病毒（泳道12)、H7N2亞型禽流感病毒（泳道14)、H8N4亞型禽流感病毒（泳道15)、H9N2 亞型禽流感病毒（泳道16)、H10N3亞型禽流感病毒（泳道17)、H11N9亞型禽流感病毒（泳 道18)、H12N5亞型禽流感病毒（泳道19)和H13N5亞型禽流感病毒（泳道20)均只擴(kuò)增出 大小為669bp的條帶；NDV (泳道21)、IBV (泳道22)、ILTV (泳道23)及陰性對照（泳道24) 均未擴(kuò)增出任何條帶。結(jié)果和預(yù)期相符，表明本發(fā)明的引物對組合物可用來鑒定禽流感病 毒及其HA亞型和NA亞型：RT-PCR產(chǎn)物中若有大小分別為325bp、447bp和669bp的條帶， 表明該病毒為H6N1亞型禽流感病毒；RT-PCR產(chǎn)物中若只有大小分別為325bp和669bp的 條帶，表明該病毒為HxNl (X尹6)亞型禽流感病毒；RT-PCR產(chǎn)物中若只有大小分別為447bp 和669bp的條帶，表明該病毒為H6Nx(x尹1)亞型禽流感病毒；RT-PCR產(chǎn)物中若僅有大小 為669bp的條帶，表明該病毒為HxNy亞型禽流感病毒（X尹6, y尹I) ;RT-PCR產(chǎn)物中若無 任何條帶，表明該病毒非禽流感病毒。該實驗結(jié)果說明實施例1的鑒定或輔助鑒定禽流感 病毒的引物對組合物能特異性地檢測H6N1亞型禽流感病毒、H6亞型禽流感病毒和Nl亞型 禽流感病毒。實施例1的鑒定或輔助鑒定禽流感病毒的引物對組合物中的名稱為M的PCR 引物對能特異性地檢測禽流感病毒。
[0099] 實施例4、三重RT-PCR鑒定禽流感病毒
[0100] 1、樣品采集
[0101] 從活禽市場采集雞、鴨咽肛棉拭子305份，分別用含有抗生素的PBS溶液（PBS溶 液中青霉素的濃度為〇. 8萬單位/mL，硫酸鏈霉素的濃度為I. 0萬單位/mL，慶大霉素的濃 度為0. 5mg/mL，制霉菌素的濃度為0. 5mg/mL)充分浸泡棉拭子（約4小時），反復(fù)擠壓和清 洗棉拭子，8000rpm/min離心5min，得到305份棉拭子的上清液。
[0102] 2、三重RT-PCR確定禽流感病毒及其亞型
[0103] 取步驟1的305份棉拭子的上清液（樣品1-305)，按照MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction試劑盒說明書，分別提取并得到305份樣品的總RNA，分別調(diào)整每份樣品總RNA 的濃度，使這305份樣品的總RNA的濃度均為IOng/ μ L。按照下述方法，分別對每份樣品的 總RNA進(jìn)行三重RT-PCR :
[0104] 每個三重RT-PCR均為25 μ L的一步法RT-PCR反應(yīng)體系：2 X ISt印Buffer 12.5yL，PrimeScript ISt印 Enzyme Mix lyL，SEQ ID Νο·1、3 和 5 所示單鏈 DNA，SEQ ID No. 2、4和6所示單鏈DNA，病毒RNA (IOng/μ L) 1 μ L，以無 RNA酶的超純水補(bǔ)足25 μ L，使SEQ ID No. 1和2所示單鏈DNA的終濃度均為0. 4 μ Μ，使SEQ ID No. 3和4所示單鏈DNA的終 濃度均為〇. 2 μ M，使SEQ ID No. 5和6所示單鏈DNA的終濃度均為0. 2 μ M。
[0105] 反應(yīng)程序均為：50°C 30min, 94°C 2min ;94°C 30s, 52°C 30s, 72°C 30s, 30 個循環(huán)； 72 °C 10min〇
[0106] 將各三重RT-PCR獲得的產(chǎn)物分別進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳（表I)，結(jié)果顯示，這305 份樣品的總RNA的三重RT-PCR結(jié)果中，43份（樣品1-43)均能擴(kuò)增出大小為669bp的條 帶，表明樣品1-43含有禽流感病毒。樣品1-43中，樣品1-2還能擴(kuò)增出大小為447bp和 325bp的條帶，表明樣品1-2中的禽流感病毒的HA亞型均為H6亞型、NA亞型均為Nl亞型， 即樣品1-2中的禽流感病毒均為H6N1亞型禽流感病毒；樣品1-43中，樣品3-9還能擴(kuò)增出 大小為447bp的條帶但不能擴(kuò)增出325bp的條帶，表明樣品3-9中的禽流感病毒的HA亞型 均為H6亞型、NA亞型均不為Nl亞型，即樣品3-9中的禽流感病毒均為H6Nx(x尹1);樣品 1-43中，樣品10-15還能擴(kuò)增出大小為325bp的條帶但不能擴(kuò)增出447bp的條帶，表明樣品 10-15中的禽流感病毒的HA亞型均不為H6亞型、NA亞型均為Nl亞型，即樣品10-15中的 禽流感病毒均為HxNl (X尹6)。305份樣品中的樣品44-305均不能擴(kuò)增到條帶，說明樣品 44-305均不含禽流感病毒。
[0107] 3、常規(guī)方法確定禽流感病毒及其亞型
[0108] 按照如下病毒分離方法鑒定棉拭子的上清液中AIV :取步驟1的305份棉拭子的 上清液（樣品1-305)分別接種SPF雞胚，收集24-96h致死的雞胚尿囊液和96h以上未致 死的雞胚尿囊液，取尿囊液進(jìn)行血凝試驗。結(jié)果顯示（表1)，樣品1-43均具有血凝性，表明 樣品1-43均含有禽流感病毒。
[0109] 取有血凝價的樣品（樣品1-43)進(jìn)行血凝抑制試驗，確定感染的AIV的HA亞型 (表1)。結(jié)果顯示，樣品1-9中的禽流感病毒的HA亞型均為H6亞型，樣品10-15中的禽流 感病毒的HA亞型均為Hl亞型，樣品16-26中的禽流感病毒的HA亞型均為H9亞型，樣品 27-35中的禽流感病毒的HA亞型均為H3亞型，樣品36-43中的禽流感病毒的HA亞型均為 H4亞型。
[0110] 通過文獻(xiàn)（Hoffmann E,Stech J, Guan Y, et al. Universal primer set for the full-length amplification of all influenza A viruses [ J]. Arch Virol, 2001，146:2275 - 2289)中克隆測定的方法，確定樣品1-43中的AIV的NA亞型（表 1)。結(jié)果顯示，樣品1-2、10-15中的禽流感病毒的NA亞型均為Nl亞型，樣品3-5、16-25、 27-39中的禽流感病毒的NA亞型均為N2亞型，樣品6-7和40-43中的禽流感病毒的NA亞 型均為N6亞型，樣品8中的禽流感病毒的NA亞型為N5亞型，樣品9和26中的禽流感病 毒的NA亞型均為N8亞型。
[0111] 結(jié)果表明，用本發(fā)明的引物對組合物檢測H6亞型和Nl亞型禽流感病毒結(jié)果與病 毒分離鑒定、血凝抑制試驗和序列測定方法確定的禽流感病毒及其H6亞型和Nl亞型是一 致的，對于其他HA亞型（H3、H4和H9等）和NA亞型（N2、N5、N6和N8等）不發(fā)生交叉反 應(yīng)。因此，本發(fā)明的三重RT-PCR及引物對組合物可以用來確定是否為禽流感病毒，并進(jìn)一 步確定HA亞型是否為H6亞型、NA亞型是否為Nl亞型的禽流感病毒。
[0112] 表1、305份棉拭子中禽流感病毒及其H6亞型和Nl亞型的鑒定
[0113]
[0114]

【權(quán)利要求】
1. 鑒定或輔助鑒定禽流感病毒的引物對組合物，為組合物I、組合物2或組合物3 ; 所述組合物1由獨立包裝的三個引物對組成，即由名稱為H6的PCR引物對、名稱為Nl 的PCR引物對和名稱為M的PCR引物對組成； 所述H6由序列表中SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所示的兩條單鏈DNA組成；所述NI 由序列表中SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4所示的兩條單鏈DNA組成；所述M由序列表中SEQ ID No. 5和SEQ ID No. 6所示的兩條單鏈DNA組成； 所述組合物2由獨立包裝的兩個引物對組成，即由所述H6和所述M組成； 所述組合物3由獨立包裝的兩個引物對組成，即由所述NI和所述M組成。
2. 鑒定或輔助鑒定禽流感病毒的PCR引物對，其特征在于：所述PCR引物對為權(quán)利要 求1所述的M，所述M由序列表中SEQ ID No. 5和SEQ ID No. 6所示的兩條單鏈DNA組成。
3. 鑒定或輔助鑒定禽流感病毒的試劑或試劑盒，其特征在于：所述試劑或試劑盒含有 權(quán)利要求1所述的引物對組合物。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑或試劑盒，其特征在于：所述試劑或試劑盒還包括反轉(zhuǎn) 錄酶。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的試劑或試劑盒，其特征在于：所述試劑或試劑盒還包括 PrimeScript One Step RT-PCR Kit Ver. 2 試劑盒中的 2X IStep Buffer 和 PrimeScript IStep Enzyme Mix。
6. 鑒定或輔助鑒定禽流感病毒的試劑或試劑盒，其特征在于：所述試劑或試劑盒含有 權(quán)利要求2所述的PCR引物對。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的試劑或試劑盒，其特征在于：所述試劑或試劑盒還包括反轉(zhuǎn) 錄酶。
8. 根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的試劑或試劑盒，其特征在于：所述試劑或試劑盒還包括 PrimeScript One Step RT-PCR Kit Ver. 2 試劑盒中的 2X IStep Buffer 和 PrimeScript IStep Enzyme Mix。
9. 權(quán)利要求1所述的引物對組合物或權(quán)利要求3或4或5所述的試劑或試劑盒的制備 方法，包括將權(quán)利要求1所述的引物對組合物中各引物對的所述兩條單鏈DNA分別單獨包 裝的步驟。
10. 權(quán)利要求2所述的PCR引物對或權(quán)利要求6或7或8所述的試劑或試劑盒的制備 方法，包括將權(quán)利要求2所述的PCR引物對中的所述兩條單鏈DNA分別單獨包裝的步驟。
【文檔編號】C12Q1/70GK104313190SQ201410652473
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2014年11月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月17日
【發(fā)明者】謝芝勛, 羅思思, 謝志勤, 鄧顯文, 劉加波, 黃莉, 黃嬌玲, 曾婷婷 申請人:廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所