一種samhd1基因敲除細(xì)胞系的構(gòu)建方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種SAMHD1基因敲除細(xì)胞系的構(gòu)建方法，首先針對SAMHD1基因CDS1和CDS2共設(shè)計4對識別序列；然后將靶點識別單元模塊的基因片段分別按照4對識別序列進(jìn)行串聯(lián)，并克隆入pCAG-T7-TALEN(Sangamo)-Destination質(zhì)粒，構(gòu)建4對TALEN表達(dá)質(zhì)粒對；將4對TALEN質(zhì)粒對分別轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，并用新霉素篩選出敲除SAMHD1基因的細(xì)胞系；所述方法能夠在基因組SAMHD1靶位點造成移碼突變，形成目標(biāo)基因敲除突變體，達(dá)到從基因組中穩(wěn)定敲除SAMHD1基因的目的。
【專利說明】-種SAMHD1基因敲除細(xì)胞系的構(gòu)建方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種從基因組中敲除SAMHD1基因的方法， 可用于SAMHD1功能研究及構(gòu)建SAMHD1表達(dá)穩(wěn)定缺失的細(xì)胞系。

【背景技術(shù)】
[0002] 最近，Laguette N等在HIV-1難以感染的髓系細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了一種HIV-1的宿主 限制因子--SAMHD1，該分子可以水解dNTPs，從而抑制人類髓系細(xì)胞中HIV-1的復(fù)制。 SAMHD1全長67020bp，包含16個外顯子，蛋白由626個氨基酸組成。Goldstone等測定了 它的結(jié)構(gòu)和催化活性，晶體結(jié)構(gòu)揭示SAMHD1是一個二聚體，其分子結(jié)構(gòu)包括N-末端的SAM 結(jié)構(gòu)域，HD結(jié)構(gòu)域和C末端區(qū)域。HD結(jié)構(gòu)域以組氨酸/天冬氨酸殘基雙聯(lián)體基序為特征， 在進(jìn)化上高度保守，在核酸代謝和信號傳導(dǎo)等方面發(fā)揮重要作用。當(dāng)SAM結(jié)構(gòu)域缺失時，HD 結(jié)構(gòu)域可以表現(xiàn)完全磷酸水解酶的功能。
[0003] SAMHD1是一種dGTP依賴的磷酸水解酶。SAMHD1先形成二聚體結(jié)構(gòu)的分子，再結(jié) 合dGTP，并發(fā)生變構(gòu)，從而暴露出磷酸水解酶的活性。它的主要功能是將dNTPs水解成脫氧 核苷和無機(jī)的三磷酸，從而降低核內(nèi)dNTPs的濃度，參與細(xì)胞內(nèi)的dNTPs代謝過程。SAMHD1 功能的缺失可以造成細(xì)胞內(nèi)dNTPs的大量積聚，從而導(dǎo)致強(qiáng)烈的免疫活化和大量的I型干 擾素分泌。先天性的SAMHD1基因突變可以引起一種罕見的遺傳性自身免疫性疾病--AGS (Aicardi-GoutiSres syndrome),這是一種類似于先天性宮內(nèi)病毒感染表現(xiàn)的先天性腦 病，可以引起嚴(yán)重的腦萎縮和慢性腦脊液淋巴細(xì)胞增多，患者常伴有不適宜的免疫活化和 IFN-a的大量產(chǎn)生。SAMHD1基因缺陷的AGS患者的單核細(xì)胞更容易感染HIV-1，進(jìn)一步在 人體原代細(xì)胞上驗證了 SAMHD1的HIV-1感染限制功能。
[0004] 鑒于SAMHD1在細(xì)胞核酸代謝和HIV-1感染中的重要作用，敲除SAMHD1蛋白在 SAMHD1的功能研究中是十分重要的手段。目前敲除或降低SAMHD1表達(dá)的方法僅限于RNAi， 該方法僅能瞬時降低SAMHD1蛋白的表達(dá)，不能形成穩(wěn)定敲除，更難以建立SAMHD1表達(dá)缺 失的細(xì)胞系，而且降低的程度也有限，不能完全敲除SAMHD1的表達(dá)。因此，有必要開發(fā)一種 從基因組中完全敲除 SAMHD1 基因的方法。TALENs(transcription activator-like (TAL) effector nucleases)的中文名為轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶，是基因組編輯核酸酶三 大類之一。它是實現(xiàn)基因敲除、敲入或轉(zhuǎn)錄激活等靶向基因組編輯的里程碑。相比于傳統(tǒng) 的鋅指核酸酶（ZFNs)技術(shù)，TALENs具有獨特的優(yōu)勢：設(shè)計更簡單，特異性更高，現(xiàn)在成為了 科研人員用于研究基因功能和潛在基因治療應(yīng)用的重要工具。是目前較有發(fā)展前景的基因 修飾技術(shù)。我們以TALENs技術(shù)為基礎(chǔ)，開發(fā)了一種從基因組中完全敲除SAMHD1基因的方 法。該方法將為研究SAMHD1功能、建立SAMHD1缺失的細(xì)胞系以及HIV-1感染機(jī)制研究打 下基礎(chǔ)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是針對目前瞬時敲除SAMHD1方法的不穩(wěn)定性和不徹底性，提供一 種從基因組中穩(wěn)定敲除SAMHD1基因的方法，該方法除用于SAMHD1功能研究外，還可以用于 建立SAMHD1表達(dá)缺失細(xì)胞系，為其它研究提供細(xì)胞模型。
[0006] 本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)：一種SAMHD1基因敲除細(xì)胞系的構(gòu)建方法， 包括以下步驟： (1) 針對SAMHD1基因的⑶S1選取作用靶點，并設(shè)計2對識別序列，分別為L1/R1、L2/ R2 ;針對SAMHD1基因的⑶S2選取作用靶點，并設(shè)計2對識別序列，分別為L3/R3、L4/R4 ; L1 ?L4 的序列如 SEQ ID N0. 17?SEQ ID N0. 20 所示，R1 ?R4 的序列如 SEQ ID N0. 21 ?SEQ ID NO. 24 所示；Ll/Rl、L2/R2、L3/R3、L4/R4 具體為：

【權(quán)利要求】
1. 一種SAMHD1基因敲除細(xì)胞系的構(gòu)建方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 針對SAMHD1基因的⑶S1選取作用靶點，并設(shè)計2對識別序列，分別為Ll/Rl、L2/ R2 ;針對SAMHD1基因的⑶S2選取作用靶點，并設(shè)計2對識別序列，分別為L3/R3、L4/R4 ; L1 ?L4 的序列如 SEQ ID NO. 17?SEQ ID NO. 20 所示，R1 ?R4 的序列如 SEQ ID NO. 21 ?SEQ ID NO. 24所示； (2) 將靶點識別單元模塊的基因片段分別按照L1/R1、L2/R2、L3/R3、L4/R4序列進(jìn)行串 聯(lián)，串聯(lián)成功后克隆入PCAG-T7-TALEN (Sangamo) - Destination質(zhì)粒，共構(gòu)建4對TALEN表 達(dá)質(zhì)粒對；其中，靶點識別單元模塊的基因片段按照L1序列進(jìn)行串聯(lián)后對應(yīng)的氨基酸序列 如SEQ ID NO. 9所示；按照R1序列進(jìn)行串聯(lián)后對應(yīng)的氨基酸序列如SEQ ID NO. 10所示；按 照L2序列進(jìn)行串聯(lián)后對應(yīng)的氨基酸序列如SEQ ID NO. 11所示；按照R2序列進(jìn)行串聯(lián)后對 應(yīng)的氨基酸序列如SEQ ID NO. 12所示；按照L3序列進(jìn)行串聯(lián)后對應(yīng)的氨基酸序列如SEQ ID NO. 13所示；按照R3序列進(jìn)行串聯(lián)后對應(yīng)的氨基酸序列如SEQ ID NO. 14所示；按照L4 序列進(jìn)行串聯(lián)后對應(yīng)的氨基酸序列如SEQ ID NO. 15所示；按照R4序列進(jìn)行串聯(lián)后對應(yīng)的 氨基酸序列如SEQ ID NO. 16所示； (3) 將構(gòu)建好的4對TALEN表達(dá)質(zhì)粒對分別用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒轉(zhuǎn)染到表達(dá)SAMHD1 的293T細(xì)胞系中，48小時后將細(xì)胞在含有濃度為100ug/ml的新霉素的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng) 10-14天，篩選出活細(xì)胞，得到敲除SAMHD1基因的細(xì)胞系。
【文檔編號】C12N15/85GK104450784SQ201410654987
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年11月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月18日
【發(fā)明者】靳昌忠, 吳南屏 申請人:浙江大學(xué)