熒光pcr檢測(cè)鯊魚源性成分的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了用于檢測(cè)鯊魚源性成分的熒光PCR引物對(duì)和探針，正向引物的堿基序列為SEQIDNO.3，反向引物的堿基序列為SEQIDNO.4，探針的堿基序列為SEQIDNO.5。本發(fā)明利用基于Taqman探針的熒光PCR方法，特異性強(qiáng)、快速靈敏、簡(jiǎn)便而不易污染。
【專利說(shuō)明】熒光PCR檢測(cè)鯊魚源性成分的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種生物檢測(cè)方法，具體而言，本發(fā)明涉及基于Taqman探針熒光PCR用于檢測(cè)鯊魚源性成分的特異性引物對(duì)及探針、試劑盒和方法。

【背景技術(shù)】
[0002]Taqman探針是一種RNA探針。TaqMan熒光探針是一種寡核苷酸探針，熒光基團(tuán)連接在探針的5’末端，而淬滅劑則在3’末端。PCR擴(kuò)增時(shí)在加入一對(duì)引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的熒光探針，探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收；PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的5’ 一 3’外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。常用的熒光基團(tuán)是FAM，TET, VIC, HEX。
[0003]所謂魚翅，就是鯊魚鰭中的細(xì)絲狀軟骨，是用鯊魚的鰭加工而成的一種海產(chǎn)珍品。魚翅之所以能食用，是因?yàn)轷忯~的鰭含有一種形如粉絲狀的翅筋，其中含80%左右的蛋白質(zhì)，還含有脂肪、糖類及其他礦物質(zhì)。魚翅是比較珍貴的烹調(diào)原料，但營(yíng)養(yǎng)價(jià)值不十分高，因魚翅所含的蛋白質(zhì)缺少一種必需的氨基酸(色氨酸)，是一種不完全蛋白質(zhì)。在東亞各國(guó)，魚翅是高檔食品，消費(fèi)量很大。
[0004]鯊魚隸屬于軟骨魚綱、板鰓亞綱、鯊總目，大約包括8目35科465多種，是位于海洋食物鏈頂層的重要魚類。以鯊魚為原料的加工產(chǎn)品包括魚翅、鯊魚硫酸軟骨素、鯊魚肝油、鯊魚肉等，均具備一定的藥用、保健或營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。近年來(lái)，由于鯊魚產(chǎn)品消費(fèi)趨熱，鯊魚的捕殺量常年在較高水平(73?80 X 104噸/每年，數(shù)據(jù)來(lái)源:FAO Yearbook.Fishery andAquaculture Statistics.2012)。在巨額經(jīng)濟(jì)利益的驅(qū)使下,S魚產(chǎn)品摻雜造假的情況時(shí)有發(fā)生，尤其是魚翅類產(chǎn)品造假更是屢見不鮮。
[0005]目前對(duì)鯊魚產(chǎn)品的研究主要集中在鯊魚產(chǎn)品功能成分的提純和生物活性研究、鯊魚產(chǎn)品對(duì)疾病的治療和保健機(jī)理、鯊魚種屬鑒定等方面，而對(duì)鯊魚產(chǎn)品市場(chǎng)所急需的鯊魚總類成分檢測(cè)與鑒定技術(shù)(非鑒定到種)的研究還較為少見，僅見郭云霞等(申請(qǐng)?zhí)?201110362019.7)報(bào)道了針對(duì)鯊魚源性成分建立了 PCR鑒別方法和SYBR Green實(shí)時(shí)熒光PCR方法。為維護(hù)正常市場(chǎng)秩序和消費(fèi)者合法權(quán)益，迫切需要開發(fā)出特異性強(qiáng)、靈敏度高、快速準(zhǔn)確的鯊魚源性成分檢測(cè)鑒定方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]為了解決以上的技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明的一個(gè)目的在于，提供用于檢測(cè)鯊魚源性成分的特異性熒光PCR引物和探針，其特異性地將樣品中的鯊魚源性成分通過(guò)熒光PCR檢測(cè)出來(lái)，而不屬于鯊魚源性的成分則不能通過(guò)熒光PCR檢測(cè)出來(lái)，通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
該用于檢測(cè)鯊魚源性成分的特異性熒光PCR引物和探針，其特征在于，在鯊魚源性成分的熒光PCR擴(kuò)增過(guò)程中，采用所述熒光PCR引物包括正向引物、反向引物和探針，所述正向引物的堿基序列為SEQ ID N0.3，所述反向引物的堿基序列為SEQ ID N0.4，探針的堿基序列為 SEQ ID N0.5。
[0007]在本發(fā)明的另一些實(shí)施例中，所述熒光PCR引物和探針用于Taqman熒光PCR檢測(cè)，所述探針進(jìn)一步包括在5’端連接的熒光報(bào)告基團(tuán)以及在3’端連接的熒光淬滅基團(tuán)，所述探針進(jìn)一步包括在在5’端連接的熒光報(bào)告基團(tuán)以及3’端連接的熒光淬滅基團(tuán)，
在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施例中，所述熒光報(bào)告基團(tuán)為FAM，所述熒光淬滅基團(tuán)為BHQ1。值得注意的是，本發(fā)明的熒光報(bào)告基團(tuán)也可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的熒光報(bào)告基團(tuán)，包括但不限于CY3、CY5、HEX或TET。同理，本發(fā)明的熒光淬滅基團(tuán)也可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的熒光淬滅基團(tuán)，包括但不限于也可以是TAMRA、BHQ2或BHQ3。此外，需要注意的是，在選擇熒光報(bào)告基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)的時(shí)候，兩者必須對(duì)應(yīng)使用。
[0008]本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種用于檢測(cè)鯊魚源性成分的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括SEQ ID N0.3的正向引物和SEQ ID N0.4的反向引物，以及SEQ ID N0.5的熒光探針，這三者的配合使本發(fā)明能獲得準(zhǔn)確的定性和/或定量檢測(cè)結(jié)果。
[0009]本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供一種用于檢測(cè)鯊魚源性成分的方法，其特征在于，所述方法包括
a)制備熒光PCR反應(yīng)體系，包括:
2 X Taq PCR Master mix12.5 μ L ；
20 μ mol/L權(quán)利要求1所述的熒光PCR引物對(duì)各1.0 yL ；
10 μ mol/L權(quán)利要求1所述的探針1.0 yL；
樣品DNA模版5.0 UL ；
補(bǔ)水至25 μ L ；
b)將步驟a)的熒光PCR反應(yīng)體系置于94°C下反應(yīng)2min ；
c)置于94°C下反應(yīng)10S，隨后在60°C下反應(yīng)40 s ；
d)步驟c)重復(fù)40次。
[0010]本發(fā)明的優(yōu)勢(shì)在于:本發(fā)明利用基于Taqman探針的熒光PCR方法，特異性強(qiáng)、快速靈敏、簡(jiǎn)便而不易污染。此外:
1)本發(fā)明的特異性PCR引物，即SEQID N0.3的正向引物和SEQ ID N0.4的反向引物，結(jié)合熒光探針，能夠特異地?cái)U(kuò)增出鯊魚源性的成分，準(zhǔn)確地分辨出鯊魚源性的樣品；
2)本發(fā)明中使用的引物和探針，可以檢測(cè)到的最低質(zhì)粒拷貝數(shù)為10拷貝/μL的數(shù)量級(jí)；
3)采用本發(fā)明的引物和探針，可以穩(wěn)定地檢測(cè)出樣品中的鯊魚源性成分。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0011]圖1為13份魚翅樣品PCR結(jié)果；
圖2為13份魚翅樣品的熒光PCR結(jié)果；
圖3為熒光PCR方法特異性試驗(yàn)結(jié)果；
圖4為熒光PCR方法靈敏度試驗(yàn)結(jié)果；
圖5為熒光RT-PCR重復(fù)性和穩(wěn)定性試驗(yàn)的第一次重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果；
圖6為熒光RT-PCR重復(fù)性和穩(wěn)定性試驗(yàn)的第二次重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果。

【具體實(shí)施方式】
[0012]以下將結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說(shuō)明。
[0013]實(shí)施例1
熒光PCR方法檢測(cè)購(gòu)買的魚翅產(chǎn)品中是否含有鯊魚源性成分。
[0014]1.1 樣品
13份魚翅樣品為本實(shí)驗(yàn)室留存樣品，另外12份鯊魚源性樣品(包括4份新鮮鯊魚和8份魚翅樣品)及9份其他魚類樣品(包括美洲鰻2份、日本鰻2份、龍頭魚I份、羅非魚I份、池魚I份、馬鮫魚I份、鳙魚I份)均購(gòu)自珠海海鮮及干貨市場(chǎng)。
[0015]1.2主要試劑
DNA提取試劑盒E.Z.N.A.TM Tissue DNA Kit 為美國(guó) OMEGA公司產(chǎn)品，TIANGEN Taq PCRMastermix為天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品，DNA膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、pMD18-T、DNA Marker DL 2000均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。
[0016]1.3主要儀器
Applied B1systems 7500 Fast Real Time PCR System 為美國(guó) ABI 公司產(chǎn)品。AlphaImager HP凝膠成像分析系統(tǒng)為美國(guó)Alpha Innotech公司產(chǎn)品。Sigma 3-18 K小型高速冰凍臺(tái)式離心機(jī)為德國(guó)Sartorius公司產(chǎn)品。NanoDrop ND - 1000 Spectrophotometer紫外分光光度計(jì)為美國(guó)NanoDrop Technologies公司產(chǎn)品。
[0017]1.4熒光PCR檢測(cè)鯊魚源性成分
發(fā)明人根據(jù)GenBank中公布的S魚線粒體DNA (mtDNA)序列,利用生物學(xué)軟件ClustalX比對(duì)后在高度保守區(qū)域用Primer Express 2.0設(shè)計(jì)了一對(duì)熒光PCR引物、探針，由上海輝睿生物科技有限公司合成。正向引物和反向引物和探針分別是:
SEQ ID N0.3 (正向引物):5’ - ACCTGTGGCAATTAAYCGTTGA -3，
SEQ ID N0.4 (反向引物):5’ - CTATWCCTGCTCATGCACCAAA -3，
SEQ ID N0.5 (探針序列):5’_ FAM- TTTTCTACHAACCACAAAGA TATYGGCACCCT-BHQ1 -3’
1.4.1擴(kuò)增反應(yīng)
實(shí)時(shí)熒光 PCR:PCR 反應(yīng)體系為 25 μ L:2 X Taq PCR Master mix 12.5 μ I, 20 μ mol/L上下游引物各1.0 yL, 10 μ mol/L Taqman探針1.0 μ L，DNA模版(實(shí)施例1) 5.0 μ L,補(bǔ)水至25 UL0反應(yīng)程序:94°C 2 min ；94°C 10 s，60°C 40 s (收集熒光信號(hào))，40個(gè)循環(huán)。
[0018]1.4.2結(jié)果分析
參見圖2，本實(shí)驗(yàn)方法對(duì)已確認(rèn)為鯊魚翅的13份樣品均成功進(jìn)行了擴(kuò)增，出現(xiàn)了典型的S型擴(kuò)增曲線，陰性對(duì)照未見熒光增長(zhǎng)。反應(yīng)時(shí)間較普通PCR大大縮短。
[0019]實(shí)施例2
實(shí)時(shí)熒光PCR方法特異性、靈敏度、穩(wěn)定性試驗(yàn)。
[0020]2.1特異性
2.1.1魚翅樣品的普通PCR擴(kuò)增及種屬鑒定
按照DNA提取試劑盒說(shuō)明書提取樣品DNA。以13份魚翅樣品DNA為模板進(jìn)行普通PCR，并對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆測(cè)序。
[0021]PCR 反應(yīng)體系為 25 μ L:2 X Taq PCR Master mix 12.5 μ L，100 ymol/L 上下游引物各 1.0 yL，DNA 模版 2.0 μ L，補(bǔ)水至 25 μ L。反應(yīng)程序:94°C 2 min ；94°C 30 s，50°CI min ,72°C 30 s，35個(gè)循環(huán)；72°C 7 min。擴(kuò)增結(jié)束后于2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并將PCR產(chǎn)物測(cè)序比對(duì)，確定其種屬來(lái)源。
[0022]其中，采用的上游引物為SEQ ID N0.1:5’ - GTGGCAATTAAYCGTTGACTATTTTCTAC-3’ ；采用的下游引物為 SEQ ID N0.2:5’ - AGTCARAARCTTATRTTATTTATTCG-3’。
[0023]13份魚翅樣品均被成功進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物大小約為310bp，與預(yù)期符合(見圖1)。PCR產(chǎn)物經(jīng)克隆測(cè)序，在GenBank中比對(duì)，確認(rèn)此13份魚翅樣品均為鯊魚源性，分別來(lái)自大青鯊(4份)、犁鰭檸檬鯊(2份)、黑吻真鯊、太平洋鼠鯊、錘頭雙髻鯊、淺海長(zhǎng)尾鯊、澳洲斜鋸牙鯊、白邊真鯊和鐮狀真鯊。
[0024]2.1.2熒光PCR方法特異性試驗(yàn)
熒光PCR方法與實(shí)施例1的檢測(cè)方法相同，不同的是采用的樣品。本試驗(yàn)中，對(duì)市場(chǎng)購(gòu)買的12份鯊魚源性樣品(4份新鮮鯊魚和8份魚翅樣品)和9份其他種屬魚類的樣品進(jìn)行特異性擴(kuò)增，結(jié)果參見圖3。
[0025]圖3中可以看出，設(shè)計(jì)的特異性引物和探針對(duì)鯊魚源性的樣品有明顯曲線增長(zhǎng)的部分，而屬于其他種屬魚類的9份樣品均未見熒光增長(zhǎng)，結(jié)果為近乎為直線的紅線部分，說(shuō)明設(shè)計(jì)的弓I物和探針特異性良好。
[0026]2.2靈敏度
將實(shí)施例1中的熒光PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)后的目的條帶割膠回收，進(jìn)行克隆、測(cè)序鑒定，并以此重組質(zhì)粒作為陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品。將重組質(zhì)粒用紫外分光光度計(jì)測(cè)定質(zhì)粒濃度，根據(jù)阿伏伽德羅常數(shù)換算成目的基因的拷貝數(shù)。提取陽(yáng)性克隆質(zhì)粒，測(cè)定濃度后，以10倍梯度稀釋到10,，對(duì)梯度稀釋的樣本進(jìn)行熒光PCR檢測(cè)。
[0027]熒光PCR方法與實(shí)施例1的檢測(cè)方法相同，將8個(gè)濃度梯度的陽(yáng)性對(duì)照進(jìn)行熒光PCR 反應(yīng)，濃度分別為 107、16、ΙΟ5、ΙΟ4、103、12、11UO0 拷貝 / μ L。
[0028]靈敏度試驗(yàn)的結(jié)果見圖4，可檢測(cè)到的最低質(zhì)粒拷貝數(shù)為10拷貝/ μ L的數(shù)量級(jí)，即為該檢測(cè)方法的靈敏度，實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明該方法檢測(cè)鯊魚源性成分的相對(duì)檢測(cè)限非常低，靈敏度很高。
[0029]2.3穩(wěn)定性
以鯊魚陽(yáng)性對(duì)照為模板，使用實(shí)施例1的檢測(cè)方法在兩個(gè)時(shí)間段各做20次重復(fù)，通過(guò)計(jì)算Ct值的變異系數(shù)驗(yàn)證批內(nèi)及批間穩(wěn)定性。
[0030]對(duì)兩次試驗(yàn)所獲得的Ct值用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 13.0分析，批內(nèi)變異系數(shù)分別為
1.10%和1.22%，批間變異系數(shù)為1.32%，說(shuō)明20次批內(nèi)重復(fù)和2次批間重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果符合性較好，方法穩(wěn)定，試驗(yàn)結(jié)果見圖5，圖6。
[0031]本發(fā)明根據(jù)GenBank中公布的鯊魚線粒體DNA (mtDNA)序列，在其高度保守區(qū)域設(shè)計(jì)了一對(duì)特異性引物和探針，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該引物和探針的特異性較好，對(duì)鯊魚樣品均能進(jìn)行特異性擴(kuò)增，并且靈敏度較高，能檢測(cè)到的最低質(zhì)?？截悢?shù)量級(jí)為10拷貝/ μ L。最后，本發(fā)明的特異性引物和探針具有突出的穩(wěn)定性和重復(fù)性。
[0032]雖然已經(jīng)對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方案進(jìn)行了描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)認(rèn)識(shí)到，在不偏離本發(fā)明的范圍或精神的前提下可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行多種改變與修飾。因而，本發(fā)明意欲涵蓋落在權(quán)利要求書及其同等物范圍內(nèi)的所有這些改變與修飾。
【權(quán)利要求】
1.用于檢測(cè)鯊魚源性成分的熒光PCR引物對(duì)及探針，所述熒光PCR引物包括正向引物和反向引物，其特征在于，熒光PCR正向引物的堿基序列為SEQ ID N0.3，熒光PCR反向引物的喊基序列為SEQ ID N0.4，探針的喊基序列為SEQ ID N0.5。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的熒光PCR引物對(duì)及探針，其特征在于，探針包括在5’端連接有熒光報(bào)告基團(tuán)，在3’端連接有熒光淬滅基團(tuán)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的熒光PCR引物對(duì)及探針，其特征在于，所述熒光報(bào)告基團(tuán)為FAM，所述熒光淬滅基團(tuán)為BHQ1。
4.用于檢測(cè)鯊魚源性成分的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括權(quán)利要求1-3中任意一項(xiàng)所述的熒光PCR引物對(duì)及探針。
5.用于檢測(cè)鯊魚源性成分的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟: a)制備熒光PCR反應(yīng)體系，包括: 2XTaq PCR Master mix12.5 μ L ； 20 μ mol/L權(quán)利要求1所述的熒光PCR引物對(duì)各1.0 μ L ; 10 μ mol/L權(quán)利要求1所述的探針1.0 yL ； 樣品DNA模版5.0 yL； 補(bǔ)水至25 μ L ； b)將步驟a)的熒光PCR反應(yīng)體系置于94°C下反應(yīng)2min ； c)置于94°C下反應(yīng)10s，隨后在60°C下反應(yīng)40 s ； d)步驟c)重復(fù)40次。
6.權(quán)利要求1所述的熒光PCR引物對(duì)及探針在檢測(cè)鯊魚源性成分中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK104404143SQ201410656749
【公開日】2015年3月11日 申請(qǐng)日期:2014年11月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月18日
【發(fā)明者】羅寶正, 廖秀云, 陳軒, 陶旻, 薄清如, 徐海聶, 沙才華, 黃海超 申請(qǐng)人:珠海出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心