奶牛早期妊娠的熒光定量pcr檢測試劑盒及檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種基于熒光定量PCR技術(shù)的奶牛早期妊娠檢測試劑盒及檢測方法，通過聯(lián)合檢測奶牛外周血中兩個干擾素刺激基因ISG15和RSAD2的表達(dá)量來進(jìn)行妊娠診斷，可以在青年母牛人工授精后18d排查空懷牛和妊娠牛，使妊娠診斷的時間提前；可實現(xiàn)在青年母牛第一次配種后3周以內(nèi)排查空懷牛，對其進(jìn)行再次人工授精，從而縮短產(chǎn)犢至下一次妊娠的間隔，進(jìn)而提高奶牛的繁殖率。本發(fā)明的試劑盒及其檢測方法，操作簡單，出結(jié)果快，檢測結(jié)果準(zhǔn)確，靈敏度高，有望成為今后奶牛業(yè)中早期妊娠診斷的主流技術(shù)。
【專利說明】奶牛早期妊娠的熒光定量PCR檢測試劑盒及檢測方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和核酸檢測【技術(shù)領(lǐng)域】，具體的說，本發(fā)明涉及一種基于熒 光定量PCR技術(shù)的奶牛早期妊娠檢測試劑盒及檢測方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 妊娠診斷是奶牛生產(chǎn)管理中的重要環(huán)節(jié)，對奶牛實施早期妊娠診斷可以盡早發(fā)現(xiàn) 空懷牛并對其進(jìn)行發(fā)情處理和再次人工授精，可縮短產(chǎn)犢間隔、減少空懷導(dǎo)致的經(jīng)濟損失。 根據(jù)國內(nèi)外專家估計，空懷導(dǎo)致每頭乳牛每日約減奶8-15千克；最低少生產(chǎn)牛犢0. 003頭， 每頭每日飼料、能源、人力等方面的消耗約20-30元。因此，探索科學(xué)、準(zhǔn)確、簡便、快捷的奶 牛早期妊娠診斷新技術(shù)顯得尤為重要。
[0003] 在生產(chǎn)中常見最常用的妊娠診斷方法是直腸觸診，技術(shù)比較成熟的繁殖員在配 種后45-50d可做出準(zhǔn)確診斷，經(jīng)驗豐富的繁殖員最早可以在人工授精后35d判斷是否妊 娠；通過測定牛奶或者血液中的孕酮含量也可以判斷奶牛是否受孕，該方法在人工授精 后21-24d進(jìn)行檢測；目前已經(jīng)開始初步使用但是尚未廣泛推廣的牛妊娠相關(guān)蛋白（PAG) ELISA試劑盒能在妊娠后28d做出較為可靠的判斷。由此可見，這些方法均只能在奶牛 人工授精三周后做出準(zhǔn)確診斷。最新的研究報道證實利用PAGELISA試劑盒于人工授精 后28d排查出來的空懷牛，與同樣條件下在妊娠46d時利用直腸檢查的方法排查出來的 空懷牛相比，對其實施同期發(fā)情并再次配種后的妊娠率和空懷天數(shù)并沒有提高（Sinedino LD，LimaFS,BisinottoRS，etal.Effectofearlyorlateresynchronization basedondifferentmethodsofpregnancydiagnosisonreproductiveperformance ofdairycows[J].Journalofdairyscience，2014, 97 (8): 4932-41) ?研究指出，如果 人工授精后一個情期內(nèi)（三周）能排查出空懷牛，即可對其進(jìn)行快速的同期發(fā)情處理，在 第21-23d進(jìn)行復(fù)配，減少空懷天數(shù)，提高奶牛的繁殖效率（LucyMC，McDougallS，Nation DP.Theuseofhormonaltreatmentstoimprovethereproductiveperformanceof lactatingdairycowsinfeedlotorpasture-basedmanagementsystems[J].Animal reproductionScience, 2004, 82-83:495-512)。因此，從某種程度上來講，能否于奶牛人工 授精后一個情期內(nèi)判斷奶牛妊娠或者空懷，是縮短奶牛產(chǎn)犢間隔和提高繁殖率的關(guān)鍵。
[0004] 綜上，需要能夠?qū)崿F(xiàn)快速、有效且準(zhǔn)確檢測奶牛早期妊娠的產(chǎn)品，以盡早發(fā)現(xiàn)空懷 牛并對其進(jìn)行發(fā)情處理和再次人工授精，縮短產(chǎn)犢間隔、減少空懷導(dǎo)致的經(jīng)濟損失。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種特異性好、靈敏度高、準(zhǔn)確地檢測奶牛早期妊娠的熒 光定量RT-PCR的方法，以較早時間判斷出青年牛人工授精后是否妊娠。
[0006] 牛早期胚胎發(fā)育的過程中，在授精后14-18d即母體妊娠識別階段，孕體合成并分 泌的干擾素-t(IFN-t)可作用于血液中白細(xì)胞，引起一系列干擾素刺激基因上調(diào)表達(dá)， 因此，通過定量PCR技術(shù)檢測白細(xì)胞中這些干擾素刺激基因的表達(dá)水平可以進(jìn)行妊娠診 斷。本發(fā)明通過熒光定量PCR技術(shù)檢測奶牛人工授精后18d外周血白細(xì)胞中干擾素刺激基 因的表達(dá)水平來進(jìn)行妊娠診斷，實現(xiàn)在奶牛人工授精后一個情期內(nèi)判別妊娠牛和空懷牛。 為空懷牛的復(fù)配節(jié)約時間，從根本上提高奶牛的繁殖效率。
[0007] 該熒光定量RT-PCR檢測方法包括如下步驟（步驟示意如圖1):
[0008] (1)血液標(biāo)本的收集
[0009]采集青年牛（14-16月齡的奶牛）發(fā)情后人工授精前0d和人工授精后18d的外周 血1. 5-2ml，抗凝，低溫冷藏。
[0010] ⑵標(biāo)本RNA的提取
[0011] 血液總RNA提取試劑盒提取標(biāo)本中總RNA(標(biāo)本采集后2h內(nèi)完成），之后利用 NanoDrop2000超微量分光光度計分析RNA樣本濃度與純度（0D26CI/28CI = 1. 9-2. 1)，同時采 用1. 2%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性，通過質(zhì)檢的樣本分裝后，于-80°C保存?zhèn)溆谩?br> [0012] (3)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)
[0013] 逆轉(zhuǎn)錄采用試劑盒進(jìn)行，每個反應(yīng)RNA用量為500ng，根據(jù)RNA的濃度計算得出每 次反應(yīng)所需的體積，按照試劑盒說明書進(jìn)行。
[0014] (4)熒光定量PCR檢測ISG15和RSAD2基因在青年牛外周血中的相對表達(dá)量
[0015] 1)目的基因和內(nèi)參基因引物的設(shè)計與合成
[0016] 牛ISG15基因和內(nèi)參基因P-Actin引物參考文獻(xiàn)報道（GiffordCA，Racicot K,ClarkDS,etal.RegulationofInterferon-StimulatedGenesinPeripheralBlood LeukocytesinPregnantandBred,NonpregnantDairyCows[J].Journalofdairy science, 2007, 90:274-280)，其中，所述的牛ISG15 基因的引物對是：SEQIDNO:1 和SEQ IDNO:2, 0 -Actin的引物對是：SEQIDNO:3和SEQIDNO:4,具體的引物信息如下：
[0017]ISG15-F:5 ; -GGTATCCGAGCTGAAGCAGTT-3 ;
[0018]ISG15-R:5 ; -ACCTCCCTGCTGTCAAGGT-3 ;
[0019] @-Actin-F:5 ' -CTGGACTTCGAGCAGGAGAT-3 '
[0020] P-Actin-R:5 ' -GGATGTCGACGTCACACTTC-3 '
[0021] 牛RSAD2基因引物對序列根據(jù)NCBI中提供的牛RSAD2基因序列（NM_001045941)， 利用軟件Primer5.0設(shè)計。所用引物序列如SEQIDNO:5和SEQIDNO:6所示，具體的引 物對序列為：
[0022] RSAD2-F:5 ' -GCTGAAAGAAGCAGGTATGGA-3 '
[0023]RSAD2-R:5 ' -CGTACTTCTGGAACCACCTCT-3 '
[0024] 2)熒光定量PCR反應(yīng)體系
[0025] 牛ISG15和RSAD2基因熒光定量PCR擴增體系均為：2xSYBR?Green10iil， 上下游引物各 〇? 5ill(10iimol/L)，cDNA模板 0? 3iil，ddH20 8. 7iil，體系共 20ill。
[0026] 3)熒光定量PCR反應(yīng)條件
[0027] 15615基因反應(yīng)條件：951：預(yù)變性6〇8,951：變性158,621：退火158 ;721：延伸 30s，共40個循環(huán)
[0028] 1?402基因反應(yīng)條件：951：預(yù)變性6〇8,951：變性158,581：退火158 ;721：延伸 30s，共40個循環(huán)
[0029]0-Actin基因反應(yīng)條件：95°C預(yù)變性 60s，95°C變性 15s，60-62°C退火 15s;72°C 延伸30s，共40個循環(huán)
[0030] (5)統(tǒng)計分析
[0031] 1)ISG15和RSAD2基因表達(dá)量的分析
[0032] 采用相對定量的方法檢測目的基因的表達(dá)量：計算出檢測標(biāo)本中目的基因Ct均 值與內(nèi)參基因Ct均值的差值（ACt)，以2_AAet表示樣品中目的基因mRNA相對表達(dá)量，其 中AACt=ACt-(人工授精后0d檢測樣本目的基因的Ct均值-該樣品內(nèi)參基因的Ct 均值）。將奶牛人工授精后〇d各基因的相對表達(dá)量較正為1，人工授精后18d的表達(dá)量為 〇d時表達(dá)量的倍數(shù)。
[0033] 2)利用牛ISG15和RSAD2基因的表達(dá)量進(jìn)行青年牛早期妊娠診斷
[0034] 人工授精后18d奶牛外周血中ISG15的表達(dá)量為XI，RSAD2的表達(dá)量為X2,將XI 和X2帶入公式P=l/[l+e_(_653+2__+°_866X2)]中，如果P值大于0? 680時，即為妊娠。
[0035] 本發(fā)明的另一目的在于提供牛外周血中干擾素刺激基因表達(dá)水平的實時熒光定 量RT-PCR檢測試劑盒，它含有牛干擾素刺激基因RSAD2和ISG15以及內(nèi)參基因P-Actin 特異性引物對，其中：
[0036] (a)牛ISG15基因和內(nèi)參基因@ -Actin弓丨物對信息如下：
[0037]ISG15-F:5 ' -GGTATCCGAGCTGAAGCAGTT-3 '
[0038]ISG15-R:5 ' -ACCTCCCTGCTGTCAAGGT-3 '
[0039] @-Actin-F:5 ' -CTGGACTTCGAGCAGGAGAT-3 '
[0040]P-Actin-R:5 ' -GGATGTCGACGTCACACTTC-3 '
[0041 ] (b)牛RSAD2基因引物對序列為：
[0042]RSAD2-F:5 ' -GCTGAAAGAAGCAGGTATGGA-3 '
[0043]RSAD2-R:5 ' -CGTACTTCTGGAACCACCTCT-3 '
[0044] 所述試劑盒的統(tǒng)一濃度和1人份測試用量統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)為：
[0045]

【權(quán)利要求】
1. 一種基于熒光定量PCR技術(shù)的奶牛早期妊娠檢測試劑盒，包含牛ISG15基因和內(nèi)參 基因 P-Actin特異性引物對，其中，所述的牛ISG15基因的引物對是：SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2，@-Actin的引物對是：SEQ ID NO :3和SEQ ID NO :4,其特征在于還包含牛RSAD2 基因特異性引物對，所用引物序列如SEQ ID NO :5和SEQ ID NO :6所示。
2. 如權(quán)利要求1所述試劑盒，其特征在于所述試劑盒的統(tǒng)一濃度和1人份測試用量統(tǒng) 一標(biāo)準(zhǔn)為： ISG15-F lOumol/L 0. 5 u L ISG15-R lOumol/L 0. 5 u L RSAD2-F lOumol/L 0. 5 u L RSAD2-R lOumol/L 0. 5 u L ^-Actin-F lOumol/L 0. 5 u L 3-Actin-R IOu mol/L 0.5 u L。
3. -種基于熒光定量PCR技術(shù)的奶牛早期妊娠檢測方法，包括如下步驟： (1) 血液標(biāo)本的收集 采集奶牛發(fā)情后人工授精前Od和人工授精后18d的外周血I. 5-2ml，抗凝，低溫冷藏； (2) 標(biāo)本RNA的提取 標(biāo)本采集后2h內(nèi)用血液總RNA提取試劑盒完成標(biāo)本中總RNA提取，之后利用NanoDrop 2000超微量分光光度計分析RNA樣本濃度與純度，0D26(I/28(I = 1. 9-2. 1，同時采用1. 2%瓊脂 糖凝膠電泳檢測RNA完整性，通過質(zhì)檢的樣本分裝后，于-80°C保存?zhèn)溆茫? (3) 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 逆轉(zhuǎn)錄采用試劑盒進(jìn)行，每個反應(yīng)RNA用量為500ng，根據(jù)RNA的濃度計算得出每次反 應(yīng)所需的體積，按照試劑盒說明書進(jìn)行； (4) 熒光定量PCR檢測ISG15和RSAD2基因在奶牛外周血中的相對表達(dá)量 1) 目的基因和內(nèi)參基因引物的設(shè)計與合成 牛ISG15基因的引物對信息如SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2所示的序列；內(nèi)參基因 3-Actin的引物對信息如SEQ ID NO :3和SEQ ID NO :4所示的序列；牛RSAD2基因引物對 序列如 SEQ ID NO :5 和 SEQ ID NO :6 ; 2) 熒光定量PCR反應(yīng)體系 牛15615、1?402基因和內(nèi)參基因3 4(^111熒光定量？〇?擴增體系均為：2><8丫]311? Green 10 iil，上下游引物各 0.5 ill (IOii mol/L)，cDNA 模板 0.3 iil，CldH2O 8.7 iil，體系共 20u I ； 3) 熒光定量PCR反應(yīng)條件 ISG15基因反應(yīng)條件：95°C預(yù)變性60s，95°C變性15s，62°C退火15s ;72°C延伸30s，共 40個循環(huán)； RSAD2基因反應(yīng)條件：95°C預(yù)變性60s，95°C變性15s，58°C退火15s ;72°C延伸30s，共 40個循環(huán)； 3-八(^丨11基因反應(yīng)條件：951：預(yù)變性6〇8,951：變性158,6〇-621：退火158;721：延伸 30s，共40個循環(huán)； (5)統(tǒng)計分析 1. ISG15和RSAD2基因表達(dá)量的分析 采用相對定量的方法檢測目的基因的表達(dá)量：計算出檢測標(biāo)本中目的基因與內(nèi)參基因 的閾值差（A Ct)，以2_AAct表示樣品中目的基因 mRNA相對表達(dá)量，將奶牛人工授精后Od 各基因的相對表達(dá)量較正為1，人工授精后18d的表達(dá)量為Od時表達(dá)量的倍數(shù)； 2) 利用牛ISG15和RSAD2基因的表達(dá)量進(jìn)行奶牛早期妊娠診斷 人工授精后18d奶牛外周血中ISG15的表達(dá)量為X1，RSAD2的表達(dá)量為X2,將Xl和X2 帶入公式P = l/[l+e_(_6 53+2__+°_866X2)]中，如果P值大于0.680時，即為妊娠。
【文檔編號】C12Q1/68GK104328202SQ201410657206
【公開日】2015年2月4日 申請日期:2014年11月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月18日
【發(fā)明者】程蕾, 向敏, 王定發(fā), 劉曉華, 胡修忠, 夏瑜, 凌明湖 申請人:武漢市畜牧獸醫(yī)科學(xué)研究所