紅色毛癬菌角蛋白酶活性的測定方法
【專利摘要】紅色毛癬菌角蛋白酶活性的測定方法：⑴.含表皮、真皮結(jié)構(gòu)人工皮膚的構(gòu)建；將人皮膚成纖維細胞重懸于膠原蛋白溶液滴加至細胞培養(yǎng)孔板培養(yǎng)；細胞完全展開滴加人角質(zhì)形成細胞懸液至膠原凝膠表面繼續(xù)培養(yǎng)；凝膠表面人角質(zhì)形成細胞完全鋪滿時進行氣液面培養(yǎng)；角質(zhì)層分化至5-8層停止培養(yǎng)；⑵.紅色毛癬菌的人工感染；⑶.角蛋白酶活性的測定。本發(fā)明構(gòu)建的人工皮膚成為角蛋白酶產(chǎn)生的天然誘導(dǎo)劑；具有以下優(yōu)點：一、人工皮膚含有真皮層、表皮層及5-8層的角質(zhì)層，結(jié)構(gòu)和功能更接近人體皮膚；二、表皮層角質(zhì)形成細胞分泌的角蛋白作為天然底物誘導(dǎo)角蛋白酶的產(chǎn)生；三、由天然底物角蛋白誘導(dǎo)產(chǎn)生的角蛋白酶，其活性測定更準確、更真實、更穩(wěn)定。
【專利說明】 紅色毛癬菌角蛋白酶活性的測定方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種紅色毛癬菌角蛋白酶活性的測定方法，屬于真菌微生物【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002]皮膚癬菌是指能入侵角質(zhì)層和角質(zhì)組織，引起人和動物皮膚、毛發(fā)和甲感染的真菌。目前發(fā)現(xiàn)大約有40余種皮膚癬菌，其中的30余種有致病性。常引起感染的皮膚癬菌主要有紅色毛癬菌，須癬毛癬菌，犬小孢子菌，石膏小孢子菌和絮狀表皮癬菌。紅色毛癬菌是引起皮膚癬菌病最常見的致病菌，據(jù)統(tǒng)計可導(dǎo)致皮膚癬菌病90%的慢性難治性感染。
[0003]與其他感染性疾病相同，皮膚癬菌病的發(fā)病是真菌毒力因子與宿主屏障結(jié)構(gòu)和免疫系統(tǒng)相互作用的結(jié)果。通常認為與角蛋白降解有關(guān)的酶是皮膚癬菌病致病菌的重要毒力因子。
[0004]但是，角蛋白酶的產(chǎn)生需要底物的誘導(dǎo)，現(xiàn)有研究及相關(guān)的技術(shù)體系需要采用特殊培養(yǎng)基，如沙堡培養(yǎng)基、蛋白胨培養(yǎng)基、含皮屑培養(yǎng)基、含甲培養(yǎng)基等誘導(dǎo)角蛋白酶的產(chǎn)生。臨床上紅色毛癬菌感染人體時并不存在上述誘導(dǎo)物，以誘導(dǎo)產(chǎn)生的方式研究紅色毛癬菌重要的毒力因子角蛋白酶致病機理可能存在嚴重偏差。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種紅色毛癬菌角蛋白酶活性的測定方法。該方法是為了模擬人體皮膚的組織結(jié)構(gòu)與基本功能且反映紅色毛廯菌臨床上粘附、感染并致病的大體過程，從而構(gòu)建了含表皮、真皮結(jié)構(gòu)的人工皮膚，該人工皮膚含有分化良好的角質(zhì)層，成為角蛋白酶產(chǎn)生的天然誘導(dǎo)劑。為今后揭示紅色毛廯菌導(dǎo)致機體發(fā)病的機理提供更真實、更準確的方法。
[0006]本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下:
一種紅色毛癬菌角蛋白酶活性的測定方法，其特征在于，包括以下步驟:(1).含表皮、真皮結(jié)構(gòu)人工皮膚的構(gòu)建；⑵.紅色毛癬菌的人工感染；⑶.角蛋白酶活性的測定。
[0007]以上所述的紅色毛癬菌角蛋白酶活性的測定方法，具體操作步驟是:
(1).含表皮、真皮結(jié)構(gòu)人工皮膚的構(gòu)建:
a.無菌操作條件下，將人皮膚成纖維細胞重懸于膠原蛋白溶液，滴加至細胞培養(yǎng)孔板，放置于細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)；
b.顯微鏡下觀察到細胞完全展開，滴加人角質(zhì)形成細胞懸液至膠原凝膠表面，繼續(xù)置于細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)；
c.顯微鏡下觀察到凝膠表面人角質(zhì)形成細胞完全鋪滿時，進行氣液面培養(yǎng)；
d.之后每天進行冷凍切片HE染色，當角質(zhì)層分化至5-8層時，停止培養(yǎng)；即得含表皮、真皮結(jié)構(gòu)的人工皮膚；
⑵.紅色毛癬菌的人工感染:將培養(yǎng)的紅色毛癬菌重懸于生理鹽水，調(diào)整為I個麥氏濃度(16個孢子/ml)，滴加5μ I至步驟⑴制備的含表皮、真皮結(jié)構(gòu)的人工皮膚，繼續(xù)培養(yǎng)48h ；HE染色驗證紅色毛癬菌是否成功感染人工皮膚；
(3).角蛋白酶活性的測定:收集步驟⑵感染紅色毛癬菌的人工皮膚的培養(yǎng)液，以天青角蛋白為底物，按照試劑盒說明書操作測定角蛋白酶的活性。
[0008]為了模擬人體皮膚的組織結(jié)構(gòu)與基本功能且反映紅色毛廯菌臨床上粘附、感染并致病的大體過程，本發(fā)明構(gòu)建了含表皮、真皮結(jié)構(gòu)的人工皮膚，該人工皮膚含有分化良好的角質(zhì)層，成為角蛋白酶產(chǎn)生的天然誘導(dǎo)劑。
[0009]本發(fā)明的核心創(chuàng)新在于:創(chuàng)造性的引入人體角蛋白作為角蛋白酶的誘導(dǎo)底物，而角蛋白哪里來的呢？是通過我們構(gòu)建人工皮膚時自然產(chǎn)生的。這一核心創(chuàng)新點，與目前所有研究均不同，以前的研究集中在動物模型或者是用培養(yǎng)基誘導(dǎo)角蛋白酶的產(chǎn)生。
[0010]本發(fā)明的核心是模擬一種更準確、更真實模擬紅色毛廯菌感染人體皮膚的過程，即用來自人體細胞且與人體皮膚有同樣結(jié)構(gòu)的角蛋白作為角蛋白酶的誘導(dǎo)底物。
[0011]本發(fā)明具有以下優(yōu)點:一、人工皮膚含有真皮層、表皮層，特別是5-8層的角質(zhì)層，在結(jié)構(gòu)和功能上更接近人體皮膚；二、表皮層角質(zhì)形成細胞分泌的角蛋白作為天然底物誘導(dǎo)角蛋白酶的產(chǎn)生；三、由天然底物角蛋白誘導(dǎo)產(chǎn)生的角蛋白酶，其活性的測定更準確、更真實、更穩(wěn)定。例如，在實施例中，A595 nm較陰性對照每改變0.01相當于IU角蛋白酶活性，得到角蛋白酶活性9.85±0.13 U。

【具體實施方式】
[0012]為進一步說明本發(fā)明，結(jié)合一下實施例具體闡述。
[0013]實施例1:
無菌操作條件下，將16個人皮膚成纖維細胞重懸于2ml膠原蛋白溶液，滴加至細胞培養(yǎng)6孔板，放置于37°C、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。3d后顯微鏡下觀察到細胞完全展開，滴加16個人角質(zhì)形成細胞懸液至膠原凝膠表面，繼續(xù)置于細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。5d后顯微鏡下觀察到凝膠表面人角質(zhì)形成細胞完全鋪滿時，進行氣液面培養(yǎng)。之后每天進行冷凍切片HE染色，1d后角質(zhì)層分化至5-8層時，停止培養(yǎng)。即得含表皮、真皮結(jié)構(gòu)的人工皮膚(見圖1)。
[0014]實施例2:
將培養(yǎng)的紅色毛癬菌重懸于生理鹽水，調(diào)整為I個麥氏濃度(16個孢子/ml)，滴加5μ I至步驟⑴制備的含表皮、真皮結(jié)構(gòu)的人工皮膚，繼續(xù)培養(yǎng)48h。HE染色驗證紅色毛癬菌成功感染人工皮膚(見圖2)。
[0015]實施例3:
收集步驟⑵感染紅色毛癬菌的人工皮膚的培養(yǎng)液約4ml，4000 rpm 15 min，吸出上清液3 ml轉(zhuǎn)移入2 ml含5 mg的keratin-azure的緩沖液,將其放入30°C 200 rpm搖床孵育。用3ml無菌水代替上清液作為陰性對照。72小時后，將反應(yīng)上清液置于冰板上，吸取上清液lml，4°C 12000 rpm離心5min。將上清液吸取至96孔板，每孔200 μ 1，重復(fù)3孔，用紫外分光光度計測定Α595 nm的OD值，以無菌水含等量keratin-azure的空白液為陰性對照。A595 nm較陰性對照每改變0.01相當于IU角蛋白酶活性，得到角蛋白酶活性9.85±0.13U。
【權(quán)利要求】
1.一種紅色毛癬菌角蛋白酶活性的測定方法，其特征在于，包括以下步驟:α).含表皮、真皮結(jié)構(gòu)人工皮膚的構(gòu)建；⑵.紅色毛癬菌的人工感染；(3).角蛋白酶活性的測定。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的紅色毛癬菌角蛋白酶活性的測定方法，其特征在于，具體操作步驟如下: (1).含表皮、真皮結(jié)構(gòu)人工皮膚的構(gòu)建: a.無菌操作條件下，將人皮膚成纖維細胞重懸于膠原蛋白溶液，滴加至細胞培養(yǎng)孔板，放置于細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)； b.顯微鏡下觀察到細胞完全展開，滴加人角質(zhì)形成細胞懸液至膠原凝膠表面，繼續(xù)置于細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)； c.顯微鏡下觀察到凝膠表面人角質(zhì)形成細胞完全鋪滿時，進行氣液面培養(yǎng)； d.每天進行冷凍切片HE染色，當角質(zhì)層分化至5-8層時，停止培養(yǎng)；即得含表皮、真皮結(jié)構(gòu)的人工皮膚； (2).紅色毛癬菌的人工感染:將培養(yǎng)的紅色毛癬菌重懸于生理鹽水，調(diào)整為I個麥氏濃度，滴加5 μ I至步驟⑴制備的含表皮、真皮結(jié)構(gòu)的人工皮膚，繼續(xù)培養(yǎng)48h ；HE染色驗證紅色毛癬菌是否成功感染人工皮膚； (3).角蛋白酶活性的測定:收集步驟⑵感染紅色毛癬菌的人工皮膚的培養(yǎng)液，以天青角蛋白為底物，按照試劑盒說明書操作測定角蛋白酶的活性。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的紅色毛癬菌角蛋白酶活性的測定方法，其特征在于，各步驟的具體操作方法是: ⑴.含表皮、真皮結(jié)構(gòu)人工皮膚的構(gòu)建:a.無菌操作條件下，將16個人皮膚成纖維細胞重懸于2ml膠原蛋白溶液，滴加至細胞培養(yǎng)6孔板，放置于37°C、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)；b.3d后顯微鏡下觀察到細胞完全展開，滴加16個人角質(zhì)形成細胞懸液至膠原凝膠表面，繼續(xù)置于細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)；c.5d后顯微鏡下觀察到凝膠表面人角質(zhì)形成細胞完全鋪滿時，進行氣液面培養(yǎng)；d.之后每天進行冷凍切片HE染色，1d后角質(zhì)層分化至5-8層時，停止培養(yǎng)；即得含表皮、真皮結(jié)構(gòu)的人工皮膚； ⑵.紅色毛癬菌的人工感染:將培養(yǎng)的紅色毛癬菌重懸于生理鹽水，調(diào)整為I個麥氏濃度，滴加5 μ I至步驟⑴制備的含表皮、真皮結(jié)構(gòu)的人工皮膚，繼續(xù)培養(yǎng)48h ；HE染色驗證紅色毛癬菌成功感染人工皮膚； (3).角蛋白酶活性的測定:收集步驟⑵感染紅色毛癬菌的人工皮膚的培養(yǎng)液約4ml，4000 rpm 15 min,吸出上清液3 ml轉(zhuǎn)移入2 ml含5 mg的keratin-azure的緩沖液,將其放入30°C 200 rpm搖床孵育；用3ml無菌水代替上清液作為陰性對照；72小時后，將反應(yīng)上清液置于冰板上，吸取上清液lml，4°C 12000 rpm離心5min ;將上清液吸取至96孔板，每孔200μ 1，重復(fù)3孔，用紫外分光光度計測定Α595 nm的OD值，以無菌水含等量keratin-azure的空白液為陰性對照；A595 nm較陰性對照每改變0.01相當于IU角蛋白酶活性，得到角蛋白酶活性9.85±0.13 U。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的紅色毛癬菌角蛋白酶活性的測定方法，其特征在于，步驟⑴的子步驟a中，是將滴加有人皮膚成纖維細胞的細胞培養(yǎng)孔板，放置于細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
【文檔編號】C12Q1/02GK104357542SQ201410657738
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2014年11月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月6日
【發(fā)明者】劉維達, 馬鵬程, 曹玉萍, 沈永年 申請人:中國醫(yī)學科學院皮膚病研究所