副雞禽桿菌發(fā)酵培養(yǎng)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種副雞禽桿菌發(fā)酵培養(yǎng)方法，屬于副雞禽桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)領(lǐng)域。本發(fā)明公開了一種副雞禽桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)方法，包括：(1)一級(jí)種子液的制備；(2)二級(jí)種子液的制備；(3)三級(jí)種子液的制備；(4)菌液發(fā)酵培養(yǎng)。本發(fā)明從接種方式、培養(yǎng)時(shí)間、初始接種量等對副雞禽桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)條件進(jìn)行了改進(jìn)，采用四步接種法，接種比例為2.5～10％，培養(yǎng)方式為發(fā)酵罐培養(yǎng)，在不改變單批次發(fā)酵總體積，不增加人員和原材料成本的情況下，最終使副雞禽桿菌發(fā)酵終點(diǎn)活菌數(shù)達(dá)到9.8×108CFU/mL，總菌數(shù)達(dá)56.7億/mL，單批產(chǎn)量增加5倍，不用濃縮即可達(dá)到配苗要求，能夠進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)用。
【專利說明】副雞禽桿菌發(fā)酵培養(yǎng)方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及副雞禽桿菌的培養(yǎng)方法，尤其涉及副雞禽桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)方法，屬于 副雞禽桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)領(lǐng)域。

【背景技術(shù)】
[0002] 雞傳染性鼻炎（Infectious Coryza, 1C)是由副雞禽桿菌（Avibacterium paragallinarum, Apg)引起雞的一種急性呼吸道傳染病，多發(fā)生于寒冷潮濕季節(jié)。該病可 使育成雞生長發(fā)育不良和產(chǎn)蛋雞產(chǎn)蛋明顯下降（可引起產(chǎn)蛋率下降10%?40% )，在中 國大型的集約化養(yǎng)殖場是重要疫病之一。目前本病在世界許多地方都有發(fā)生和流行，中 國于1987年首次分離到該病原（馮文達(dá).北京雞傳染性鼻炎病原菌的分離及鑒定[J]. 微生物學(xué)通報(bào)，1987,5:216?219.)，近年來也陸續(xù)在中國山東、北京分離到多株副雞禽 桿菌（楊國良，鄭杰等.A型副雞嗜血桿菌（山東株）的分離與鑒定[J].中國畜牧獸 醫(yī)，2013, 40 (2) : 189-192.)。隨著養(yǎng)雞業(yè)的發(fā)展，養(yǎng)殖環(huán)境的不斷復(fù)雜化，雞傳染性鼻炎的 發(fā)生頻率越來越高，已經(jīng)給養(yǎng)雞業(yè)造成很大經(jīng)濟(jì)損失。
[0003]目前，對于雞傳染性鼻炎的防治主要采取藥物或疫苗免疫兩種方法。但是雞只用 藥后，藥物的原形或其代謝產(chǎn)物和有關(guān)雜質(zhì)可能蓄積、殘留在動(dòng)物的組織、器官或食用產(chǎn)品 中，造成了獸藥在動(dòng)物性食品中的殘留，對人體造成嚴(yán)重的危害。所以，當(dāng)前高品質(zhì)的雞傳 染性鼻炎疫苗仍是預(yù)防此病的首選。但是，現(xiàn)有的副雞禽桿菌的培養(yǎng)方法存在產(chǎn)量低的缺 陷，需對菌液進(jìn)行濃縮處理才能達(dá)到配苗要求（《獸用生物制品規(guī)程》要求半成品總菌數(shù)為 50億/mL)。因此，亟待對副雞禽桿菌的高密度發(fā)酵關(guān)鍵工藝進(jìn)行優(yōu)化以有效提高單位產(chǎn) 量，便于進(jìn)行規(guī)?；I(yè)生產(chǎn)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種副雞禽桿菌（Avibacterium paragallinarum)的發(fā)酵培養(yǎng)方法，該方法顯著提高單位產(chǎn)量，使發(fā)酵終點(diǎn)總菌數(shù)達(dá)到 56. 7億/mL，不用濃縮即可達(dá)到配苗要求。
[0005] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：
[0006] 本發(fā)明公開了一種副雞禽桿菌（Avibacterium paragallinarum)的發(fā)酵培養(yǎng)方 法，包括以下步驟：（1) 一級(jí)種子液的制備；（2)二級(jí)種子液的制備；（3)三級(jí)種子液的制 備；(4)菌液發(fā)酵培養(yǎng)。
[0007] 其中，步驟（1)所述一級(jí)種子液的制備包括：將副雞禽桿菌種毒稀釋，取4mL接種 至160mL半合成培養(yǎng)基培養(yǎng)llh ;優(yōu)選的，所述稀釋為將凍干保存的副雞禽桿菌種毒用5mL PH值為7. 2的PBS稀釋。
[0008] 步驟（2)所述二級(jí)種子液的制備包括：將160mL-級(jí)種子液接種至1600mL半合成 培養(yǎng)基培養(yǎng)4h。
[0009]所述一級(jí)種子液和二級(jí)種子液的制備均為37°C，200r/min搖床培養(yǎng)。
[0010] 步驟⑶所述三級(jí)種子液的制備包括：將1600mL二級(jí)種子液接種至30000mL半合 成培養(yǎng)基培養(yǎng)4h;所述培養(yǎng)為37°C200r/min磁力攪拌或搖床培養(yǎng)；優(yōu)選為200r/min磁力 攪拌培養(yǎng)。
[0011] 本發(fā)明所述一級(jí)種子液、二級(jí)種子液和三級(jí)種子液的制備，所述培養(yǎng)的終點(diǎn)至種 子液的〇D55。值為0.50 ±0.05。
[0012] 本發(fā)明所述副雞禽桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)方法，步驟⑷所述菌液發(fā)酵培養(yǎng)包括： 將30000mL三級(jí)種子液接種至300L發(fā)酵罐，磁力攪拌培養(yǎng)；發(fā)酵終點(diǎn)為菌液0D55(I值為 0. 55±0. 05。培養(yǎng)基為半合成培養(yǎng)基；培養(yǎng)溫度為37°C，pH為7. 2,攪拌轉(zhuǎn)速為200r/min。
[0013] 利用本發(fā)明所述副雞禽桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)方法培養(yǎng)副雞禽桿菌，發(fā)酵結(jié)束時(shí)活菌數(shù) 達(dá) 9. 8X108CFU/mL，總菌數(shù)達(dá) 56. 7 億 /mL。
[0014] 本發(fā)明所述副雞禽桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)方法適用于任何一種可以獲得的副雞禽桿菌 菌株。
[0015] 本發(fā)明從接種方式、培養(yǎng)時(shí)間、初始接種量等方面對副雞禽桿菌C-Apg-8(PageA 型）的發(fā)酵培養(yǎng)進(jìn)行了改進(jìn)。本發(fā)明改變現(xiàn)有副雞禽桿菌生產(chǎn)的二步接種法：一級(jí)種子一 二級(jí)種子（7500mL) - 300L為四步接種法：4mL- 160mL- 1600mL- 30000mL- 300L。 [0016] 就細(xì)菌發(fā)酵過程中種子液接種量而言，增大接種量可以明顯縮短種子液對培養(yǎng)基 的適應(yīng)過程，從而較快進(jìn)入對數(shù)生長期，縮短延滯期。但是增加接種比例也是有一定范圍 的，有研究表明，接種量過大的時(shí)候，會(huì)過度消耗培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分同時(shí)產(chǎn)生大量的抑制 細(xì)菌繼續(xù)增長的代謝產(chǎn)物，這樣都是不利于發(fā)酵培養(yǎng)的。同時(shí)，較大的接種量也意味著對制 備種子的工作量的加大，對于實(shí)際的生產(chǎn)工作而言，也是非常不利的。本發(fā)明經(jīng)過比較并結(jié) 合生產(chǎn)實(shí)際情況選用2. 5?10%的接種比例，達(dá)到了預(yù)期的效果。
[0017] 在細(xì)菌性疫苗的生產(chǎn)過程中，種子液的最佳培養(yǎng)時(shí)間為對數(shù)生長期末（此時(shí)該細(xì) 菌的活菌數(shù)為最大值，且菌齡仍處于對數(shù)生長期），這是因?yàn)樵趯?shù)生長期內(nèi)細(xì)菌群體的世 代時(shí)間不變，細(xì)菌數(shù)目以幾何級(jí)數(shù)量增長；在對數(shù)生長期內(nèi)，菌體的分裂速度最快，菌體個(gè) 體之間細(xì)胞組成成分差異性較小，菌體抗原性相對穩(wěn)定、一致，因此使用對數(shù)生長期的種子 液接種制苗用菌液可使制苗菌液的抗原質(zhì)量相對穩(wěn)定、延滯期大大縮短從而使整個(gè)培養(yǎng)周 期最短。在本發(fā)明的培養(yǎng)條件下，一級(jí)種子液的培養(yǎng)時(shí)間應(yīng)該控制在llh以內(nèi)。
[0018] 在一定條件下（如培養(yǎng)基、溫度、PH值等），每一種細(xì)菌的世代時(shí)間是恒定的（李 季倫，張偉心等.微生物生理學(xué)[M].北京：北京農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，1993,422-426)，因此在 雞傳染性鼻炎滅活疫苗抗原的實(shí)際生產(chǎn)過程中，當(dāng)需要調(diào)整種子液的培養(yǎng)時(shí)間或菌液濃度 時(shí)，只要保證培養(yǎng)條件不變就可以利用測得的種子液的世代時(shí)間和所需的種子液培養(yǎng)時(shí)間 或菌液濃度來計(jì)算出最適宜的最初接種量，從而達(dá)到控制生產(chǎn)工藝流程的目的。
[0019] 在實(shí)際生產(chǎn)中，由于生物試驗(yàn)的可重復(fù)性差，希望精確找到種子液活菌數(shù)最高時(shí) 的0D值是困難的。本發(fā)明通過大量的0D值與活菌數(shù)的對應(yīng)數(shù)據(jù)，找到對數(shù)期末活菌數(shù)達(dá) 到某數(shù)值時(shí)的0D值范圍（550nm)，即對于種子液為：0. 50±0. 05,對于制苗菌液發(fā)酵終點(diǎn) 為：0. 55±0. 05 (由于發(fā)酵罐培養(yǎng)副雞禽桿菌需要通氣、攪拌、補(bǔ)堿，故活菌數(shù)有所增加，導(dǎo) 致0D值比種子液略高），這樣就可以估算出此時(shí)的活菌數(shù)，簡便的解決了測定活菌數(shù)耗時(shí) 長的問題，通過此方法可以快速判定副雞禽桿菌的收獲終點(diǎn)，從而最終來指導(dǎo)生產(chǎn)。
[0020] 本發(fā)明通過改變現(xiàn)有副雞禽桿菌生產(chǎn)的二步接種法：一級(jí)種子一二級(jí)種子 (7500mL) - 300L為四步接種法：4mL- 160mL- 1600mL- 30000mL- 300L，接種比例由之 前的2. 5 %變?yōu)?. 5?10%，培養(yǎng)方式由大瓶變?yōu)榘l(fā)酵罐培養(yǎng)，同時(shí)在不改變單批次發(fā)酵總 體積，不增加人員和原材料成本的情況下，最終使發(fā)酵終點(diǎn)活菌數(shù)比優(yōu)化前提高了接近13 倍（9. 8X108 - 7. 7X107CFU/mL)，總菌數(shù)提高了接近 5 倍（11. 5 億/mL- 56. 7 億 /mL)，即 單批產(chǎn)量增加5倍，菌液不用濃縮即可達(dá)到配苗用抗原要求（規(guī)程要求半成品總菌數(shù)為50 億/mL)。本發(fā)明應(yīng)用優(yōu)化的副雞禽桿菌發(fā)酵培養(yǎng)方法在獸用生物制品GMP車間連續(xù)生產(chǎn)六 批副雞禽桿菌抗原的良好效果表明，本發(fā)明副雞禽桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)方法完全可以大規(guī)模生 產(chǎn)應(yīng)用。
[0021] 在實(shí)際的疫苗生產(chǎn)中，本發(fā)明將工藝改進(jìn)后培養(yǎng)的副雞禽桿菌乳化制苗，進(jìn)行疫 苗的免疫攻毒保護(hù)試驗(yàn)，其攻毒保護(hù)率達(dá)到100%合格。
[0022] 本發(fā)明所渉及到的術(shù)語定義
[0023] 除非另外定義，否則本文所用的所有技術(shù)及科學(xué)術(shù)語都具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的 普通技術(shù)人員通常所了解相同的含義。
[0024] 術(shù)語"接種"意指按無菌操作技術(shù)要求將目的微生物移接到培養(yǎng)基質(zhì)中的過程。
[0025] 可互換使用的術(shù)語"疫苗"或"疫苗組合物"指這樣的藥物組合物，其包括在動(dòng)物 中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的至少一種免疫原性組合物。疫苗或疫苗組合物可以保護(hù)動(dòng)物免受由于感 染的疾病或可能的死亡，并且可以包括或不包括增強(qiáng)活性組分的免疫活性的一種或多種另 外組分。疫苗或疫苗組合物可以另外包括對于疫苗或疫苗組合物典型的進(jìn)一步組分，包括 例如佐劑或免疫調(diào)節(jié)劑。疫苗的免疫活性組分可以包括以其原始形式的完全活生物體或在 經(jīng)修飾的活疫苗中作為經(jīng)減毒的生物體，或在經(jīng)殺死或滅活的疫苗中通過合適方法滅活的 生物體，或包括病毒的一種或多種免疫原性組分的亞單位疫苗，或通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已 知的方法制備的遺傳改造、突變或克隆的疫苗。疫苗或疫苗組合物可以包括一種或同時(shí)超 過一種上述組分。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0026] 圖1為種子液生長曲線；
[0027] 圖2為種子液對數(shù)生長期直線方程；
[0028] 圖3為不同培養(yǎng)方式對副雞禽桿菌活菌數(shù)的影響比較。

【具體實(shí)施方式】
[0029] 下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而 更為清楚。但是應(yīng)理解所述實(shí)施例僅是范例性的，不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng) 域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié) 和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改或替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0030] 1、實(shí)驗(yàn)材料
[0031] 1. 1 菌株
[0032] 副雞禽桿菌菌株C-Apg-8(PageA型）購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。
[0033] 1. 2主要儀器
[0034]KC-06-57-300L型發(fā)酵罐，北京科諾德流體設(shè)備有限公司生產(chǎn)；ZHWY-211C型恒溫 培養(yǎng)振蕩器，上海智城分析儀器制造有限公司；752型紫外可見分光光度計(jì)，上海光譜儀器 有限公司；DL-CJ-2ND型超級(jí)潔凈工作臺(tái)，北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；HF90型C02培 養(yǎng)箱，上海力申科學(xué)儀器有限公司；標(biāo)準(zhǔn)比濁管，中國食品藥品檢定研究院。
[0035] 1. 3培養(yǎng)基
[0036] 半合成培養(yǎng)基、半合成瓊脂培養(yǎng)基參照馮文達(dá)等的方法制備（馮文達(dá).北京雞傳 染性鼻炎病原菌的分離鑒定[J].微生物學(xué)通報(bào)，1987,5:216?219.);半合成培養(yǎng)基的配 方與中華人民共和國獸用生物制品規(guī)程2000年版規(guī)定的相同。
[0037] 1. 4 其他
[0038]雞血清，購自鄭州佰安生物工程有限公司；輔酶I，產(chǎn)地Germang。實(shí)施例1副雞 禽桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)
[0039] (1)一級(jí)種子液的制備
[0040] 將凍干保存的副雞禽桿菌C-Apg-8種毒用5mL PBS (PH=7. 2)稀釋，取4mL接種 至160mL半合成培養(yǎng)基37°C，200r/min搖床培養(yǎng)llh，培養(yǎng)終點(diǎn)種子液的0D55(I值為0. 450， 活菌數(shù)最高。
[0041] (2)二級(jí)種子液的制備
[0042] 將160mL-級(jí)種子液接種至1600mL半合成培養(yǎng)基中37°C，200r/min搖床培養(yǎng)4h。 活菌數(shù)最高為1. 3X109CFU/mL，此時(shí)菌液在550nm下0D值為0. 507。
[0043] (3)三級(jí)種子液的制備
[0044] 將1600mL二級(jí)種子液接種至30000mL半合成培養(yǎng)基，37°C200r/min磁力攪拌培 養(yǎng)4h;活菌數(shù)達(dá)到峰值為9.OX108CFU/ml，此時(shí)菌液在550nm下0D值為0. 467。
[0045] ⑷菌液發(fā)酵培養(yǎng)
[0046] 將30000mL三級(jí)種子液接種至300L發(fā)酵罐，磁力攪拌培養(yǎng)，攪拌轉(zhuǎn)速為200r/min; 發(fā)酵罐培養(yǎng)溫度通過自動(dòng)控溫系統(tǒng)維持在37°C左右；培養(yǎng)基為半合成培養(yǎng)基；通過自動(dòng)流 加5?10%的NaOH控制pH在7. 2左右。發(fā)酵終點(diǎn)菌液0D55Q值為0. 501。
[0047] 發(fā)酵結(jié)束時(shí)，活菌數(shù)為7. 6X108CFU/mL，總菌數(shù)為56. 7億/mL。
[0048] 實(shí)施例2副雞禽桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)
[0049](1)一級(jí)種子液的制備
[0050] 將凍干保存的副雞禽桿菌C-Apg-8種毒用5mL PBS (PH=7. 2)稀釋，取4mL接種 至160mL半合成培養(yǎng)基37°C，200r/min搖床培養(yǎng)llh，培養(yǎng)終點(diǎn)種子液的0D55(I值為0. 550， 活菌數(shù)最高。
[0051] ⑵二級(jí)種子液的制備
[0052] 將160mL-級(jí)種子液接種至1600mL半合成培養(yǎng)基中37°C，200r/min搖床培養(yǎng)4h。 活菌數(shù)最高為1. 3X109CFU/mL，此時(shí)菌液在550nm下0D值為0. 507。
[0053] (3)三級(jí)種子液的制備
[0054] 將1600mL二級(jí)種子液接種至30000mL半合成培養(yǎng)基，37°C200r/min搖床培養(yǎng)4h; 活菌數(shù)達(dá)到峰值為1. 4X109CFU/ml，此時(shí)菌液在550nm下0D值為0. 523。
[0055] (4)菌液發(fā)酵培養(yǎng)
[0056]將30000mL三級(jí)種子液接種至300L發(fā)酵罐，磁力攪拌培養(yǎng)，攪拌轉(zhuǎn)速為200r/min; 發(fā)酵罐培養(yǎng)溫度通過自動(dòng)控溫系統(tǒng)維持在37°C左右；培養(yǎng)基為半合成培養(yǎng)基；通過自動(dòng)流 加5?10 %的NaOH控制pH在7. 2左右。發(fā)酵終點(diǎn)菌液0D55Q值為0. 60。
[0057] 發(fā)酵結(jié)束時(shí)，活菌數(shù)為3. 3X109CFU/mL，總菌數(shù)為57. 4億/mL。
[0058] 實(shí)施例3副雞禽桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)
[0059] (1)一級(jí)種子液的制備
[0060] 將凍干保存的副雞禽桿菌C-Apg-8種毒用5mLPBS(PH= 7. 2)稀釋，取4mL接種 至160mL半合成培養(yǎng)基37°C，200r/min搖床培養(yǎng)llh，培養(yǎng)終點(diǎn)種子液的0D55(I值為0. 502， 活菌數(shù)最高。
[0061] (2)二級(jí)種子液的制備
[0062] 將160mL-級(jí)種子液接種至1600mL半合成培養(yǎng)基中37°C，200r/min搖床培養(yǎng)4h。 活菌數(shù)最高為1. 2X109CFU/mL，此時(shí)菌液在550nm下0D值為0. 507。
[0063] (3)三級(jí)種子液的制備
[0064] 將1600mL二級(jí)種子液接種至30000mL半合成培養(yǎng)基，37°C200r/min搖床培養(yǎng)4h; 活菌數(shù)達(dá)到峰值為1. 45X109CFU/ml，此時(shí)菌液在550nm下0D值為0. 512。
[0065] (4)菌液發(fā)酵培養(yǎng)
[0066] 將30000mL三級(jí)種子液接種至300L發(fā)酵罐，磁力攪拌培養(yǎng)，攪拌轉(zhuǎn)速為200r/min; 發(fā)酵罐培養(yǎng)溫度通過自動(dòng)控溫系統(tǒng)維持在37°C左右；培養(yǎng)基為半合成培養(yǎng)基；通過自動(dòng)流 加5?10 %的NaOH控制pH在7. 2左右。發(fā)酵終點(diǎn)菌液0D55Q值為0. 578。
[0067] 發(fā)酵結(jié)束時(shí)，活菌數(shù)為8. 5X108CFU/mL，總菌數(shù)為57. 21億/mL。
[0068] 實(shí)驗(yàn)例1副雞禽桿菌的發(fā)酵方法優(yōu)化實(shí)驗(yàn)
[0069] 1、實(shí)驗(yàn)方法
[0070] 1. 1 -級(jí)種子液的制備
[0071] 將凍干保存的C-Apg-8種毒用5mLPBS(PH= 7. 2)稀釋，取4mL接種160mL半合 成培養(yǎng)基37°C，200r/min搖床培養(yǎng)16h，期間每lh取樣測定活菌數(shù)及0D值，繪制生長曲線， 根據(jù)對數(shù)生長期末活菌數(shù)最高的特點(diǎn)來確定培養(yǎng)時(shí)間及0D值范圍。重復(fù)3次。
[0072] 檢測0D值即將上述培養(yǎng)時(shí)取得的樣品，用752型紫外可見分光光度計(jì)檢測，以吸 光度表示，取發(fā)酵菌液3mL，在550nm下測定吸光度，并詳細(xì)記錄數(shù)據(jù)。
[0073] 1. 2二級(jí)種子液的制備
[0074] 將確定好活菌數(shù)最高時(shí)的160mL-級(jí)種子液接種至1600mL半合成培養(yǎng)基中37°C， 200r/min搖床培養(yǎng)6h，期間每0. 5h及l(fā)h取樣測定活菌數(shù)及0D值。重復(fù)3次，以3次重復(fù) 的平均值作為最終的結(jié)果。
[0075] 1. 3三級(jí)種子液的制備
[0076] 按照試驗(yàn)可操作性及接種比例，將1600mL- 30000mL階段用160mL- 3000mL試 驗(yàn)替代，37°C培養(yǎng)，并根據(jù)現(xiàn)有生產(chǎn)條件，選用磁力攪拌與搖床培養(yǎng)同步進(jìn)行對比試驗(yàn)，轉(zhuǎn) 速 200r/min。
[0077] 1. 4發(fā)酵培養(yǎng)
[0078] 按照10 %的接種比例接種至300L發(fā)酵罐，其余條件與二步接種法一致，分別進(jìn)行 發(fā)酵培養(yǎng)，檢測活菌數(shù)及0D值，以便對照比較。
[0079] 1. 5活菌計(jì)數(shù)方法
[0080] 采用平板計(jì)數(shù)法。分別取每種樣品做10倍稀釋，用移液器將滅菌好的PBS液加 入小管中，每管9mL，然后將樣品搖勻后取lmL加入第一管中，之后以此類推，選擇適宜的三 個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度接種2個(gè)平板，接種量為500yL，接種半合成瓊脂培養(yǎng)基使其自然擴(kuò) 散，于37°C5%C02條件下培養(yǎng)18h?20h。依照GB4789. 2-94中的方法計(jì)算CFU/mL。
[0081] 1.6總菌數(shù)測定方法
[0082] 采用標(biāo)準(zhǔn)比池法。將制苗菌液高速離心30min，轉(zhuǎn)數(shù)為4000r/min，棄去上清，取沉 淀加入PH7. 2的PBS制成懸濁液，用生物制品國家標(biāo)準(zhǔn)品"中國細(xì)菌濁度標(biāo)準(zhǔn)（C-Apg-8菌 株：28億/mL) "進(jìn)行比較，測得總菌數(shù)。
[0083] 1.7副雞禽桿菌生長曲線的繪制
[0084] 以培養(yǎng)時(shí)間為橫軸，種子液活菌數(shù)對數(shù)為縱軸，繪制出種子液生長曲線。
[0085] 1.8種子液世代時(shí)間的計(jì)算
[0086] 細(xì)菌在對數(shù)生長期每分裂一次所需時(shí)間，稱為世代時(shí)間或倍增時(shí)間，用g表示。根 據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)計(jì)算，細(xì)菌群體所有細(xì)胞世代時(shí)間的平均值是一定的，稱之為細(xì)菌群體的世代時(shí) 間。根據(jù)張洪等（張洪，王文泉等.副雞嗜血桿菌在疫苗生產(chǎn)中生長特性的研究[J].中國 獸藥雜志.2003, 37 (5) : 15-17, 20.)的試驗(yàn)方法計(jì)算世代時(shí)間。
[0087] 2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0088] 2. 1-級(jí)種子液活菌數(shù)及0D值的測定
[0089] 種子液各時(shí)間點(diǎn)的活菌數(shù)測定結(jié)果及其相應(yīng)的對數(shù)值、0D值見表1。
[0090] 表1C-Apg-8菌株各時(shí)間點(diǎn)活菌數(shù)、對數(shù)值及0D值
[0091]

【權(quán)利要求】
1?一種副雞禽桿菌（Avibacterium paragallinarum)的發(fā)酵培養(yǎng)方法，其特征在于， 包括以下步驟：（1) 一級(jí)種子液的制備；（2)二級(jí)種子液的制備；（3)三級(jí)種子液的制備； (4)菌液發(fā)酵培養(yǎng)。
2. 按照權(quán)利要求1所述的發(fā)酵培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟（1)所述一級(jí)種子液的制備 包括：將副雞禽桿菌種毒稀釋，取4mL接種至160mL半合成培養(yǎng)基培養(yǎng)llh ;優(yōu)選的，所述稀 釋為將凍干保存的副雞禽桿菌種毒用5mL PH值為7. 2的PBS稀釋。
3. 按照權(quán)利要求1所述的發(fā)酵培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟（2)所述二級(jí)種子液的制備 包括：將160mL -級(jí)種子液接種至1600mL半合成培養(yǎng)基培養(yǎng)4h。
4. 按照權(quán)利要求2或3所述的發(fā)酵培養(yǎng)方法，其特征在于：所述培養(yǎng)為37°C，200r/min 搖床培養(yǎng)。
5. 按照權(quán)利要求1所述的發(fā)酵培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟（3)所述三級(jí)種子液的制備 包括：將1600mL二級(jí)種子液接種至30000mL半合成培養(yǎng)基培養(yǎng)4h。
6. 按照權(quán)利要求5所述的發(fā)酵培養(yǎng)方法，其特征在于：所述培養(yǎng)為37°C，200r/min磁 力攪拌或搖床培養(yǎng)；優(yōu)選為200r/min磁力攪拌培養(yǎng)。
7. 按照權(quán)利要求1、2、3或5任何一項(xiàng)所述的發(fā)酵培養(yǎng)方法，其特征在于：所述培養(yǎng)的 終點(diǎn)至種子液的〇D55Q值為0? 50±0. 05。
8. 按照權(quán)利要求1所述的發(fā)酵培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟（4)所述菌液發(fā)酵培養(yǎng)包 括：將30000mL三級(jí)種子液接種至300L發(fā)酵罐，磁力攪拌培養(yǎng)；發(fā)酵終點(diǎn)為菌液OD55(l值為 0. 55±0. 05 ;優(yōu)選的，培養(yǎng)基為半合成培養(yǎng)基；培養(yǎng)溫度為37°C，pH值為7. 2,攪拌轉(zhuǎn)速為 200r/min〇
9. 權(quán)利要求1、2、3、5、6或8任何一項(xiàng)所述的發(fā)酵培養(yǎng)方法培養(yǎng)的副雞禽桿菌。
10. 權(quán)利要求9所述副雞禽桿菌在制備雞傳染性鼻炎滅活疫苗中的用途。
【文檔編號(hào)】C12N1/20GK104328077SQ201410659185
【公開日】2015年2月4日 申請日期:2014年11月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月18日
【發(fā)明者】張洪, 楊國良, 梁爽, 丁春宇, 陳秋平, 張凌云, 王亞麗, 周涵鍔, 李靜, 賈桂珍, 曹寧 申請人:北京華都詩華生物制品有限公司