一種細(xì)菌快速裂解試劑盒及其檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種細(xì)菌快速裂解試劑盒及其檢測(cè)方法，可對(duì)臨床及食品樣本中細(xì)菌的核酸進(jìn)行快速提取，提取的核酸可直接用于PCR或熒光PCR檢測(cè)，也可置于-20℃長(zhǎng)期保存。
【專利說明】一種細(xì)菌快速裂解試劑盒及其檢測(cè)方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于體外診斷試劑【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種細(xì)菌快速裂解試劑盒及其檢測(cè) 方法，可對(duì)臨床及食品樣本中細(xì)菌的核酸進(jìn)行快速提取。

【背景技術(shù)】
[0002] 感染性疾病是全世界共同面對(duì)的不可忽視的公共衛(wèi)生問題，其發(fā)病率也在人類各 種疾病中居首位，其中細(xì)菌是引起感染性疾病的一類重要病原體。建立快速有效的細(xì)菌檢 測(cè)方法在感染性疾病的預(yù)防、檢測(cè)以及治療方面均起著至關(guān)重要的作用。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)細(xì) 菌的檢測(cè)方法主要包括培養(yǎng)法、免疫學(xué)檢測(cè)和核酸檢測(cè)等。傳統(tǒng)培養(yǎng)鑒定法操作比較繁瑣， 對(duì)操作人員技術(shù)水平要求比較高，且檢測(cè)周期長(zhǎng)，一般需要5-7天時(shí)間，在時(shí)效上不能滿足 臨床診斷和治療的需求，因此可能延誤對(duì)患者的治療。同樣，在傳染病疫情爆發(fā)時(shí)，實(shí)驗(yàn)室 僅依賴傳統(tǒng)培養(yǎng)方法也不能滿足疫情防控的需要。免疫學(xué)主要應(yīng)用抗原抗體特異結(jié)合的特 點(diǎn)進(jìn)行細(xì)菌的檢測(cè)，常見的方法有免疫層析、免疫滲濾、免疫熒光、ELISA等。方法操作簡(jiǎn)便 快速，但靈敏度不足，通常在l〇5CFU/ml，對(duì)一些樣本中含量極少的病原微生物會(huì)發(fā)生漏檢， 不能完全滿足檢測(cè)需求。核酸檢測(cè)操作簡(jiǎn)便，通常幾小時(shí)就能得出分析結(jié)果，且檢測(cè)靈敏度 比免疫法更高，因此核酸檢測(cè)成為快速檢測(cè)方法的趨勢(shì)。核酸檢測(cè)的第一步就是對(duì)樣本進(jìn) 行核酸提取。細(xì)菌檢測(cè)的樣本大多為臨床樣本、食品樣本或環(huán)境樣本。這些樣本往往細(xì)菌含 量較低，核酸提取效率的高低是至關(guān)重要的，直接影響到實(shí)驗(yàn)的陽性檢出率。現(xiàn)在檢測(cè)機(jī)構(gòu) 用得較多的細(xì)菌核酸提取的方法包括Trizol提取法（LifeTechnology),柱提法（Qiagen, Roche)和磁珠法（Chemagen、Thermo、金麥格)。Trizol提取法提取的核酸得率相對(duì)較低，且 步驟較為繁雜，整個(gè)提取過程耗時(shí)1-2小時(shí)，直接影響檢測(cè)效率。柱提法和磁珠法的試劑盒 在一定程度上提高了核酸提取效率，簡(jiǎn)化了核酸提取的步驟，也提高了提取的速度，但整個(gè) 提取過程仍需0. 5-1小時(shí)。除了提取時(shí)間長(zhǎng)，這些提取試劑盒的價(jià)格都極為昂貴，每一個(gè)樣 本的的提取約需30-50元不等。同時(shí)對(duì)于含抑制物比較強(qiáng)的糞便、牛奶等樣本，以及細(xì)胞壁 比較厚的革蘭氏陽性菌，目前的核酸提取方法提取效果都不理想。因此，臨床基因診斷需要 操作簡(jiǎn)單、快速、價(jià)格低廉的樣本前處理試劑，尤其對(duì)于臨床樣本量較大的病例，簡(jiǎn)單快速 的核酸提取顯得尤為重要。
[0003] 現(xiàn)有核酸提取試劑提取臨床樣本、食品樣本中的細(xì)菌核酸存在操作時(shí)間長(zhǎng)、成本 高、提取效率低等問題，本發(fā)明成功解決了以上問題。本發(fā)明提出了一種對(duì)臨床或食品樣本 中細(xì)菌進(jìn)行快速裂解的試劑盒及其檢測(cè)方法，整個(gè)提取過程不超過10分鐘，既簡(jiǎn)化核酸提 取過程，同時(shí)也大大節(jié)約成本，且無需進(jìn)行純化便可直接用于擴(kuò)增。由于本試劑盒具有核酸 得率高、實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)單、實(shí)驗(yàn)條件簡(jiǎn)易、成本低等優(yōu)點(diǎn)，可廣泛用于病原微生物檢測(cè)，流行病 學(xué)調(diào)查、菌群調(diào)查的核酸檢測(cè)，對(duì)細(xì)菌高通量篩選尤為適用。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一種細(xì)菌快速裂解試劑盒，提取的核酸可直接用于 PCR擴(kuò)增或熒光PCR檢測(cè)，也可置于-20 °C長(zhǎng)期保存。
[0005] 為了解決上述任務(wù)，本發(fā)明的具體技術(shù)路線為： 1)從各種去污劑著手，篩選裂解細(xì)菌能力強(qiáng)的去污劑和最佳配比，以使整個(gè)裂解過程 只需5分鐘加熱便能最大程度地釋放細(xì)菌樣本核酸。
[0006] 2)在裂解細(xì)胞、釋放核酸的同時(shí)，由于核酸的質(zhì)量會(huì)影響PCR擴(kuò)增的效果，需采用 防止核酸降解的技術(shù)。
[0007] 3)針對(duì)各種復(fù)雜的樣本類型，如糞便、牛奶、食品等，確定相應(yīng)的處理方法和檢測(cè) 步驟，以減少抑制物的干擾，最大程度保障后續(xù)的擴(kuò)增檢測(cè)。
[0008] 通過反復(fù)的摸索，確定了細(xì)菌樣本快速裂解試劑盒各組成成分及濃度，該試劑盒 核酸得率高、實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)單，無需復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)設(shè)備且成本低廉。
[0009] 本發(fā)明所提供的細(xì)菌快速裂解試劑盒包括：（1)裝有細(xì)菌裂解液的試劑瓶或管， 和（2)分隔并集中包裝這些試劑瓶或管的包裝盒，其特征在于細(xì)菌裂解液由月桂?；“?酸鈉、二硫蘇糖醇、TE(pH7. 4)組成。
[0010] 本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案是細(xì)菌裂解液中月桂?；“彼徕c的最佳濃度為 5g/L。
[0011] 本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案是細(xì)菌裂解液中二硫蘇糖醇的濃度為20mmol/L? 200mmol/L〇
[0012] 本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案是細(xì)菌裂解液中TE(pH7.4)由lOmmol/LTris-HCl、 lmmol/LEDTA組成，pH為 7· 4。
[0013] 本發(fā)明提供的細(xì)菌快速裂解試劑盒可以提取臨床和食品樣本中的細(xì)菌DNA，其中 臨床和食品樣本包括菌液、咽拭子、肛拭子、糞便、牛奶、面包，細(xì)菌包括革蘭氏陽性菌和革 蘭氏陰性菌。
[0014] 本發(fā)明另一個(gè)目的是提供一種細(xì)菌快速裂解的檢測(cè)方法，包括不同樣本類型的步 驟如下： 1、菌液樣本 (1) 取過夜菌液100μ1離心棄上清收集菌體，或取一個(gè)菌落，將菌與50μ1細(xì)菌裂 解液混合，用槍頭吹吸混勻； (2) 將混合物置于95 °C孵育5min; (3) 將孵育后的混合物在12, 000rpm條件下離心2min，收集上清，即為細(xì)菌的核酸提 取物。
[0015] 2、咽拭子和肛拭子樣本： (1) 待檢拭子樣本直接置于200μ1細(xì)菌裂解液中，充分?jǐn)嚢柘疵撌米由系臉颖?，在?壁擠壓數(shù)次后棄拭子； (2) 震蕩混勻，95 °C孵育5min; (3) 孵育后的樣本12，000rpm離心2min，收集上清，即為拭子樣本的細(xì)菌核酸提取 物。
[0016] 3、糞便樣本： (1)采集〇. 1-0. 2g糞便樣本，采集后立即放入無菌采便管內(nèi)，加入Iml無菌生理鹽水， 震蕩混勻，12，000rpm離心2min,棄上清，重復(fù)以上步驟再次洗漆沉淀，棄上清后用Iml 無菌生理鹽水重懸沉淀，靜置5min; (2) 取樣本懸液(生理鹽水懸液）25μ?，加入25μ?細(xì)菌裂解液，震蕩混勻，95°C孵育5 min； (3) 孵育后的樣本12，OOOrpm離心2min，收集上清，即為糞便樣本的細(xì)菌核酸提取 物。
[0017] 4、牛奶樣本： (1) 取牛奶〇. 5ml于I. 5ml的無菌離心管中，12，000rpm離心5分鐘，去最上層奶 油與中間層上清，沉淀加Iml無菌生理鹽水吹打混勻； (2) 取樣本懸液(生理鹽水懸液）25μ?，加入25μ?細(xì)菌裂解液，震蕩混勻，95°C孵育5 min； (3) 孵育后的樣本12，000rpm離心2min，收集上清，即為牛奶樣本中的細(xì)菌核酸提 取物。
[0018] 5、面包樣本： (1) 取面包0. 3?0. 5g加入IOml無菌生理鹽水中，震蕩30s，靜置5min; (2) 取樣本懸液(生理鹽水懸液）25μ?，加入25μ?細(xì)菌裂解液，震蕩混勻，95°C孵育5 min； (3) 孵育后的樣本12，000rpm離心2min，收集上清，即為面包樣本中的細(xì)菌核酸提 取物。
[0019] 該核酸提取物可直接用于PCR擴(kuò)增或熒光PCR檢測(cè)，也可置于-20 °C長(zhǎng)期保存。
[0020] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下優(yōu)點(diǎn)：①組分簡(jiǎn)單，且無昂貴的試劑，大大節(jié)約 成本；②步驟簡(jiǎn)單，僅需三步；③提取速度快，整個(gè)提取過程不超過10分鐘；④樣本中的 核酸均保留在細(xì)菌裂解液中，核酸沒有損失，且無需純化，用于PCR擴(kuò)增或熒光PCR檢測(cè)，靈 敏度高于現(xiàn)有技術(shù)。⑤無需核酸提取儀等復(fù)雜的設(shè)備，僅需水浴鍋和離心機(jī)即可完成操作。 ⑥對(duì)細(xì)胞壁厚的革蘭氏陽性菌，含抑制物質(zhì)較多的糞便、牛奶等樣本具有更高的提取效率。
[0021] 因此，本發(fā)明的試劑盒可廣泛用于對(duì)臨床和食品樣本中細(xì)菌核酸進(jìn)行快速提取， 特別是待測(cè)樣本數(shù)量較多時(shí)尤為適用。
[0022]

【專利附圖】

【附圖說明】
[0023] 圖1顯示本試劑盒對(duì)過夜培養(yǎng)的金黃葡萄球菌提取核酸，并進(jìn)行靈敏度試驗(yàn)的結(jié) 果。不同濃度梯度的金黃色葡萄球菌除濃度IXl〇2CFU/ml的樣本無Ct值判為陰性外，其 余濃度的樣本擴(kuò)增曲線均呈S型，濃度為lX105CFU/ml、lX104CFU/ml、lX103CFU/ml的金 黃色葡萄球菌樣本的Ct值分別為23. 81、27. 9、30. 97,可明確判為陽性。
[0024] 圖2顯示本試劑盒對(duì)過夜培養(yǎng)的沙門氏菌提取核酸，并進(jìn)行靈敏度試驗(yàn)的結(jié)果。 不同濃度梯度的沙門氏菌除濃度Ixio1CfuAiI的樣本無Ct值判為陰性外，其余濃度的樣 本擴(kuò)增曲線均呈S型，濃度為IX105CFU/ml、IX104CFU/ml、IX103CFU/ml、IX102CFU/ml的 金黃色葡萄球菌樣本的Ct值分別為23. 47, 26. 51，29. 65, 32. 93,可明確判為陽性。
[0025] 圖3顯示本試劑盒對(duì)過夜培養(yǎng)的蠟樣芽胞桿菌提取核酸，并進(jìn)行靈敏度試驗(yàn)的 結(jié)果。不同濃度梯度的蠟樣芽胞桿菌除濃度IXl〇2CFU/ml的樣本無Ct值判為陰性外， 其余濃度的樣本擴(kuò)增曲線均呈S型，濃度為IXIO5CFUAil、IXIO4CFUAil、IXIO3CFUAil、IX102CFU/ml的金黃色葡萄球菌樣本的Ct值分別為20. 77, 25. 06, 29. 02,可明確判為陽 性。
[0026] 圖4顯示本試劑盒對(duì)咽拭子中提取的口腔鏈球菌屬核酸進(jìn)行熒光PCR檢測(cè)結(jié)果。 兩份口腔鏈球菌陽性的咽拭子樣本的擴(kuò)增曲線均呈S型，Ct值分別為17. 53和19. 16,檢測(cè) 為口腔鏈球菌屬陽性。
[0027] 圖5顯示本試劑盒對(duì)面包、牛奶、糞便樣本中提取的金黃色葡萄球菌核酸進(jìn)行熒 光PCR檢測(cè)結(jié)果。金黃色葡萄球菌陽性的面包、牛奶和糞便樣本的擴(kuò)增曲線均呈S型，Ct值 分別為16. 64、17. 06和17. 5,檢測(cè)為金黃色葡萄球菌陽性。
[0028] 圖6顯示本試劑盒提取過夜培養(yǎng)的金黃色葡萄球菌的核酸與Qiagen柱提試劑提 取的核酸進(jìn)行熒光定量PCR的對(duì)比實(shí)驗(yàn)結(jié)果。Qiagen柱提試劑熒光PCR結(jié)果Ct值為16. 64， 本試劑盒熒光PCR結(jié)果Ct值為10. 39,比Qiagen柱提試劑的Ct值提前6. 25。兩條擴(kuò)增曲 線均呈S型。
[0029] 圖7顯示不同二硫蘇糖醇濃度的細(xì)菌樣本裂解液進(jìn)行PCR電泳檢測(cè)結(jié)果。泳道 1-9 分別對(duì)應(yīng)二硫蘇糖醇濃度 200mM、150mM、100mM、50mM、20mM、10mM、lmM、0mM和陰性 對(duì)照。
[0030]

【具體實(shí)施方式】
[0031] 本發(fā)明實(shí)施方式的描述，旨在通過舉例說明更好地理解本發(fā)明的本質(zhì)，而不是限 制本發(fā)明。
[0032] 本發(fā)明實(shí)施方式所用的實(shí)驗(yàn)材料，如沒有特別說明，均為市售產(chǎn)品。
[0033] 實(shí)施例1 :細(xì)菌樣本快速裂解試劑盒制備及其使用方法(適用于菌液檢測(cè)） 1.制備細(xì)菌樣本快速裂解試劑盒（50測(cè)試/盒）：細(xì)菌裂解液（I. 25ml/管）2管。
[0034] 2.標(biāo)本采集 取過夜生長(zhǎng)的菌液100μ1，8，000rpm離心2min，收集菌體，棄上清。
[0035] 3.檢測(cè)步驟 菌體沉淀加入50μ?細(xì)菌裂解液，震蕩混勻，95 °C孵育5min;孵育后的樣本12，000rpm離心2min,收集上清。
[0036] 上清可直接用于PCR擴(kuò)增或熒光PCR檢測(cè)，也可置于-20 °C長(zhǎng)期保存。
[0037] 實(shí)施例2 :細(xì)菌樣本快速裂解試劑盒制備及其使用方法(適用于咽拭子和肛拭子） 1.制備細(xì)菌樣本快速裂解試劑盒（50測(cè)試/盒）：細(xì)菌裂解液（5ml/瓶）2瓶。
[0038] 2.標(biāo)本采集、保存 1)咽拭子：用專用采樣拭子，適度用力拭抹咽后壁和兩側(cè)扁桃體部位，應(yīng)避免觸及舌 部；迅速將拭子放采樣管中，在靠近頂端處折斷棉簽桿，旋緊管蓋并密封，以防干燥。
[0039] 2)肛拭子：用專用采樣拭子在生理鹽水中浸濕，插入肛門2-3cm處，自肛門周圍 皺襞處拭取，或在肛門口內(nèi)輕輕旋轉(zhuǎn)涂擦；迅速將拭子放采樣管中，在靠近頂端處折斷棉簽 桿，旋緊管蓋并密封，以防干燥。
[0040] 以上標(biāo)本可立即用于測(cè)試，也可放置在-20°c±5°C條件下長(zhǎng)期保存。
[0041] 3.檢測(cè)步驟 菌體沉淀加入50μ?細(xì)菌裂解液，震蕩混勻，95 °C孵育5min;孵育后的樣本12，000rpm離心2min,收集上清。
[0042] 上清可直接用于PCR擴(kuò)增或熒光PCR檢測(cè)，也可置于-20 °C長(zhǎng)期保存。
[0043] 實(shí)施例3:細(xì)菌樣本快速裂解試劑盒制備及其使用方法(適用于糞便） 1.制備細(xì)菌樣本快速裂解試劑盒（50測(cè)試/盒）：細(xì)菌裂解液（5ml/瓶）2瓶。
[0044] 2.標(biāo)本采集、保存 采集0. 1~0. 2g糞便樣本，采集后立即放入無菌采便管內(nèi)，加入Iml無菌生理鹽水，震 蕩混勻，12，000rpm離心2min,棄上清，重復(fù)以上步驟再次洗漆沉淀，棄上清后用Iml無 菌生理鹽水重懸沉淀，靜置5min。
[0045] 以上標(biāo)本可立即用于測(cè)試，也可放置在-20°C±5°C條件下長(zhǎng)期保存。
[0046] 3.檢測(cè)步驟 取樣本懸液(生理鹽水懸液）25μ?，加入25μ?細(xì)菌裂解液，震蕩混勻，95°C孵育5min;孵育后的樣本12，000rpm離心2min,收集上清。
[0047] 上清可直接用于PCR擴(kuò)增或熒光PCR檢測(cè)，也可置于-20 °C長(zhǎng)期保存。
[0048] 實(shí)施例4:細(xì)菌樣本快速裂解試劑盒制備及其使用方法(適用于牛奶） 1.制備細(xì)菌樣本快速裂解試劑盒（50測(cè)試/盒）：細(xì)菌裂解液（5ml/瓶）2瓶。
[0049] 2.標(biāo)本采集、保存 取牛奶0. 5ml于I. 5ml的無菌離心管中，12，000rpm離心5分鐘，去最上層奶油與 中間層上清，沉淀加Iml無菌生理鹽水吹打混勻。
[0050] 以上標(biāo)本可立即用于測(cè)試，也可放置在_20°C±5°C條件下長(zhǎng)期保存。
[0051] 3.檢測(cè)步驟 取樣本懸液(生理鹽水懸液）25μ?，加入25μ?細(xì)菌裂解液，震蕩混勻，95°C孵育5min;孵育后的樣本12，000rpm離心2min,收集上清。
[0052] 上清可直接用于PCR擴(kuò)增或熒光PCR檢測(cè)，也可置于-20 °C長(zhǎng)期保存。
[0053] 實(shí)施例5 :細(xì)菌樣本快速裂解試劑盒制備及其使用方法(適用于面包） 1.制備細(xì)菌樣本快速裂解試劑盒（50測(cè)試/盒）：細(xì)菌裂解液（5ml/瓶）2瓶。
[0054] 2.標(biāo)本采集、保存 取面包0. 3?0. 5g加入IOml無菌生理鹽水中，震蕩30s，靜置5min; 以上標(biāo)本可立即用于測(cè)試，也可放置在-20°C±5°C條件下長(zhǎng)期保存。
[0055] 3.檢測(cè)步驟 取樣本懸液(生理鹽水懸液）25μ?，加入25μ?細(xì)菌裂解液，震蕩混勻，95°C孵育5min;孵育后的樣本12，000rpm離心2min,收集上清。
[0056] 上清可直接用于PCR擴(kuò)增或熒光PCR檢測(cè)，也可置于-20 °C長(zhǎng)期保存。
[0057] 實(shí)施例6 :使用本試劑盒從不同濃度的金黃色葡萄球菌液中提取的核酸進(jìn)行靈敏 度試驗(yàn)。
[0058](1)將在BHI培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)的金黃色葡萄球菌用生理鹽水稀釋到IXIO5CFU/ ml、IX104CFU/ml、IX103CFU/ml、IX102CFU/ml; (2)以上4個(gè)稀釋度的菌液各取10〇μ1置于離心管中； (3) 12,OOOrpm離心1分鐘，棄上清； (4) 加入50μ?細(xì)菌裂解液，震蕩混勻； (5) 將混合物置于95 °C孵育5min; (6) 將孵育后的樣本在12, 000rpm離心2分鐘，收集上清，即得到樣本的核酸； (7) 取2μ1核酸樣本進(jìn)行熒光PCR擴(kuò)增。使用上游引物StaphF，序列 為 5' -CAGCAGCCGCGGTAATA-3'（SEQIDNO:1)，下游引物StaphR，序列為 5，-GGACTACCAGGGTATCTAATCC-3，（SEQIDN0:2)和探針Staphprobe，序列為5，-CTGTM CTGACGCTGATGTGCGAMGC-3'（SEQIDNO: 3)，探針的兩端分別結(jié)合有熒光發(fā)生基團(tuán)FAM和 突光泮滅基團(tuán)TAMRA。使用Takara公司的PremixExTaq?(ProbeqPCR)(貨號(hào)RR390Q)， 按照試劑盒說明配制反應(yīng)體系，對(duì)金黃色葡萄球菌16SrDNA進(jìn)行熒光PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件 為 95°C30s(Icycle), 95°C10s，58°C40s(40cycles)。
[0059] 由附圖I所示的檢測(cè)結(jié)果可知，本試劑盒提取的金黃色葡萄球菌菌液的靈敏度為 IX103CFU/ml。
[0060] 實(shí)施例7:使用本試劑盒從不同濃度的沙門氏菌液中提取的核酸進(jìn)行靈敏度試 驗(yàn)。
[0061] (1)將在BHI培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)的沙門氏菌用生理鹽水稀釋到IX105CFU/ml、 IX104CFU/ml、IX103CFU/ml、IX102CFU/ml、IXIo1CFUAiI; (2) 以上5個(gè)稀釋度的菌液各取10〇μ1置于離心管中； (3) 12, 000rpm離心1分鐘，棄上清； (4) 加入50μ?細(xì)菌裂解液，震蕩混勻； (5) 將混合物置于95 °C孵育5min; (6) 將孵育后的樣本在12, 000rpm離心2分鐘，收集上清，即得到樣本的核酸； (7) 取2μ1核酸樣本進(jìn)行熒光PCR擴(kuò)增。使用上游引物invAF，序列 為 5' -CCGCCAAACCTAAAACCAG-3'（SEQIDNO:7)，下游引物1鮮六1?5'-GAGCTTTTTCCAGATCTTCACGC-3'（SEQIDN0:8)和熒光探針invAprobe，序列為5'-CTGATTGGCGATCTCGATAAAGTCTCTACAG-3'（SEQIDN0:9)，探針的兩端分別結(jié)合有熒光發(fā) 生基團(tuán)FAM和熒光淬滅基團(tuán)TAMRA，并使用Takara公司的PremixExTaq?(ProbeqPCR) (貨號(hào)RR390Q)，按照試劑盒說明配制反應(yīng)體系；擴(kuò)增條件為95°C30s(Icycle)，95°C 10s，58°C40s(40cycles)。
[0062] 由附圖2所示的檢測(cè)結(jié)果可知，本試劑盒提取的沙門氏菌菌液的靈敏度為 IX102CFU/ml。
[0063] 實(shí)施例8 :使用本試劑盒從不同濃度的蠟樣芽胞桿菌菌液中提取的核酸進(jìn)行靈敏 度試驗(yàn)。
[0064] (1)將在BHI培養(yǎng)基中培養(yǎng)18~24小時(shí)的蠟樣芽胞桿菌菌液用生理鹽水稀釋到 IX105CFU/ml、IX104CFU/ml、IX103CFU/ml、IX102CFU/ml; (2) 以上4個(gè)稀釋度的菌液各取10〇μ1置于離心管中； (3) 12, 000rpm離心1分鐘，棄上清； (4) 加入50μ?細(xì)菌裂解液，震蕩混勻； (5) 將混合物置于95 °C孵育5min; (6) 將孵育后的樣本在12,OOOrpm離心2分鐘，收集上清，即得到樣本的核酸； (7) 取2μ1核酸樣本進(jìn)行熒光PCR擴(kuò)增。使用上游引物murBF，序列 為 5' -CCTTCTTCAAGTTCAAATCTCG-3'（SEQIDNO:10)，下游引物murBR 5'-GTYGTAATGACAGGTGATGGA-3'（SEQIDN0:11)和熒光探針murBprobe，序列為5'-TGTAATGGTTGTTCGCAAATACACTC-3'（SEQIDN0:12)，探針的兩端分別結(jié)合有熒光發(fā)生基 團(tuán)FAM和熒光淬滅基團(tuán)TAMRA，并使用Takara公司的PremixExTaq?(ProbeqPCR)(貨 號(hào)RR390Q)，按照試劑盒說明配制反應(yīng)體系，擴(kuò)增條件為95°C30s(Icycle), 95°C10s， 58°C40s(40cycles)。
[0065]由附圖3所示的檢測(cè)結(jié)果可知，本試劑盒提取蠟樣芽胞桿菌菌液，其檢測(cè)靈敏度 為lX103CFU/ml。
[0066] 實(shí)施例9:使用本試劑盒對(duì)咽拭子中提取的口腔鏈球菌屬核酸進(jìn)行熒光PCR檢測(cè)。
[0067] (1)取兩個(gè)健康人的咽拭子，刷拭牙齦及口腔壁，將拭子洗脫在400μ1生理鹽水 中； (2) 12, 000rpm離心1分鐘，棄上清； (3) 加入50μ?細(xì)菌裂解液，震蕩混勻； (4) 將混合物置于95 °C孵育5min; (5) 將孵育后的樣本在12, 000rpm離心2分鐘，收集上清，即得到樣本的核酸； (6) 取2μ1核酸樣本進(jìn)行熒光PCR擴(kuò)增。上游引物Str印F，序列為5' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'（SEQIDΝ0:4)，下游引物Str印R，序列為 5' CGYCCATTGCCGAAGATTCC3，（SEQIDΝ0:5)和探針Str印probe，序列為 5，-AGATGGAC CTGCGTTGTATTAGCTAGTTGG-3'（SEQIDNO:6)，探針的兩端分別結(jié)合有熒光發(fā)生基團(tuán)FAM和 突光泮滅基團(tuán)TAMRA。使用Takara公司的PremixExTaq?(ProbeqPCR)(貨號(hào)RR390Q)， 按照試劑盒說明配制反應(yīng)體系，對(duì)口腔鏈球菌屬16SrDNA進(jìn)行熒光PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為 95°C30s(Icycle), 95°C10s, 58°C40s(40cycles)。
[0068] 如附圖4所示的檢測(cè)結(jié)果可知，本試劑盒提取的兩份咽拭子樣本進(jìn)行熒光PCR檢 測(cè)均為口腔鏈球菌屬陽性。
[0069] 實(shí)施例10:使用本試劑盒對(duì)面包、牛奶、糞便樣本提取的金黃色葡萄球菌核酸進(jìn) 行熒光PCR檢測(cè)。
[0070] (1)樣本準(zhǔn)備： a) 面包樣本：取面包0. 3~0. 5g加入IOml混有IX107CFU/ml金黃色葡萄球菌的生理 鹽水中，震蕩混勻，靜置5min; b) 牛奶樣本：取牛奶0. 5ml于I. 5ml的無菌離心管中，12，000rpm離心5分鐘，去 最上層奶油與中間層上清，沉淀加Iml混有IXIO7CFUAiI金黃色葡萄球菌的生理鹽水，震 蕩混勻。
[0071]C)糞便樣本：采集0.f〇. 2g糞便樣本，采集后立即放入無菌采便管內(nèi)，加入IOml 混有IXl〇7CFU/ml金黃色葡萄球菌的生理鹽水充分混勻，靜置5min。
[0072] (2)取三種樣本的生理鹽水懸液25μ?，加入25μ?細(xì)菌裂解液，震蕩混勻，95°C孵 育 5min; (3)將孵育后的樣本在12, 000rpm離心2分鐘，收集上清，即得到樣本的核酸； (4)取2μ1核酸樣本進(jìn)行熒光PCR擴(kuò)增，用上游引物StaphF，序列 為 5' -CAGCAGCCGCGGTAATA-3'（SEQIDNO:1)，下游引物StaphR，序列為 5'-GGACTACCAGGGTATCTAATCC-3'（SEQIDNO:2)和探針Staphprobe，序列為 5'-CTGTAAC TGACGCTGATGTGCGAAAGC-3'（SEQIDNO:3)，探針的兩端分別結(jié)合有熒光發(fā)生基團(tuán)FAM和熒 光淬滅基團(tuán)TAMRA。使用Takara公司的PremixExTaq?(ProbeqPCR)(貨號(hào)RR390Q)，按 照試劑盒說明配制反應(yīng)體系，對(duì)金黃色葡萄球菌16SrDNA進(jìn)行熒光PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為 95°C30s(Icycle), 95°C10s, 58°C40s(40cycles)。
[0073] 如附圖5所示的檢測(cè)結(jié)果可知，本試劑盒提取金黃色葡萄球菌陽性的面包、牛奶 和糞便樣本進(jìn)行熒光PCR檢測(cè)均為金黃色葡萄球菌陽性。
[0074] 實(shí)施例11:以過夜培養(yǎng)的金黃色葡萄球菌為樣本，本試劑盒提取的核酸與Qiagen 柱提試劑（QIAampDNAMiniKit，貨號(hào)51304)提取的核酸用于熒光定量PCR的對(duì)比實(shí)驗(yàn)結(jié) 果。
[0075] 兩種核酸提取方法的操作步驟對(duì)比見下表：

【權(quán)利要求】
1. 一種細(xì)菌快速裂解試劑盒，試劑盒包括：（1)裝有細(xì)菌裂解液的試劑瓶或管，和（2) 分隔并集中包裝這些試劑瓶或管的包裝盒，其中細(xì)菌裂解液由月桂?；“彼徕c、二硫蘇 糖醇、PH7.4的TE組成。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征還在于細(xì)菌裂解液中月桂酰基肌氨酸鈉的最 佳濃度為5g/L。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征還在于細(xì)菌裂解液中二硫蘇糖醇的濃度為 20mmol/L ?200mmol/L。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征還在于細(xì)菌裂解液中pH7. 4的TE由lOmmol/ L Tris、lmmol/L EDTA 組成，pH 為 7. 4。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒用于提取臨床和食品樣本中的細(xì)菌DNA，其中臨床和 食品樣本包括菌液、咽拭子、肛拭子、糞便、牛奶、面包，細(xì)菌包括革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰 性菌。
6. -種細(xì)菌快速裂解的檢測(cè)方法，針對(duì)菌液樣本包括如下檢測(cè)步驟： (1) 取過夜菌液100 Pi離心棄上清收集菌體，或取一個(gè)菌落，將菌與50 yl細(xì)菌裂解 液混合，用槍頭吹吸混勻； (2) 將混合物置于95°C孵育5min ; (3) 將孵育后的混合物在12, OOOrpm條件下離心2min，收集上清，即為細(xì)菌的核酸提 取物。
7. -種細(xì)菌快速裂解的檢測(cè)方法，針對(duì)咽拭子和肛拭子樣本包括如下檢測(cè)步驟： (1)待檢拭子樣本直接置于200 yl細(xì)菌裂解液中，充分?jǐn)嚢柘疵撌米由系臉颖?，在?壁擠壓數(shù)次后棄拭子； ⑵震蕩混勻，95°C孵育5min; (3)孵育后的樣本12, 000 rpm離心2min，收集上清，即為拭子樣本的細(xì)菌核酸提取 物。
8. -種細(xì)菌快速裂解的檢測(cè)方法，針對(duì)糞便樣本包括如下檢測(cè)步驟： (1) 采集〇. 1-0. 2g糞便樣本，采集后立即放入無菌采便管內(nèi)，加入lml無菌生理鹽水， 震蕩混勻，12, OOOrpm離心2min，棄上清，重復(fù)以上步驟再次洗漆沉淀，棄上清后用lml無 菌生理鹽水重懸沉淀，靜置5min ; (2) 取樣本生理鹽水懸液25耵，加入25W細(xì)菌裂解液，震蕩混勻，95°C孵育5min; (3) 孵育后的樣本12, OOOrpm離心2min，收集上清，即為糞便樣本的細(xì)菌核酸提取物。
9. 一種細(xì)菌快速裂解的檢測(cè)方法，針對(duì)牛奶樣本包括如下檢測(cè)步驟： (1) 取牛奶〇. 5ml于1. 5ml的無菌離心管中，12, OOOrpm離心5分鐘，去最上層奶油與 中間層上清，沉淀加lml無菌生理鹽水吹打混勻； (2) 取樣本生理鹽水懸液25耵，加入25W細(xì)菌裂解液，震蕩混勻，95°C孵育5min; (3) 孵育后的樣本12, OOOrpm離心2min，收集上清，即為牛奶樣本中的細(xì)菌核酸提取 物。
10. -種細(xì)菌快速裂解的檢測(cè)方法，針對(duì)面包樣本包括如下檢測(cè)步驟： (1) 取面包〇? 3、. 5g加入10ml無菌生理鹽水中，震蕩30s，靜置5min ; (2) 取樣本生理鹽水懸液25耵，加入25W細(xì)菌裂解液，震蕩混勻，95°C孵育5min ; (3)孵育后的樣本12,000rpm離心2min，收集上清，即為面包樣本中的細(xì)菌核酸提取 物。
【文檔編號(hào)】C12Q1/04GK104357572SQ201410662477
【公開日】2015年2月18日 申請(qǐng)日期:2014年11月19日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月19日
【發(fā)明者】金鑫, 張欽, 張平, 周正峰, 朱坤 申請(qǐng)人:南京美寧康誠(chéng)生物科技有限公司, 北京美康生物技術(shù)研究中心有限責(zé)任公司