利用氧化葡萄糖桿菌生產(chǎn)吡咯喹啉醌的方法及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種利用氧化葡萄糖桿菌生產(chǎn)吡咯喹啉醌的方法，它的步驟如下：（1）將氧化葡萄糖桿菌DSM2003發(fā)酵，得到發(fā)酵液；（2）發(fā)酵液經(jīng)高速離心，取上清液，經(jīng)HP-20型大孔樹脂色譜柱進行富集，得到富含吡咯喹啉醌的洗脫流份；（3）將富含吡咯喹啉醌的洗脫流份減壓濃縮，經(jīng)聚酰胺柱色譜純化，得到吡咯喹啉醌純品。本發(fā)明提供的氧化葡萄糖桿菌菌株在常規(guī)培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下，PQQ產(chǎn)量可達125mg/L，而且利用上述生產(chǎn)制備方法，條件簡單，過程快捷，便于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，對促進PQQ的產(chǎn)業(yè)化有重要意義。
【專利說明】利用氧化葡萄糖桿菌生產(chǎn)吡咯喹啉醌的方法及應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種微生物菌株的應(yīng)用，具體的說是利用氧化葡萄糖菌DSM 2003生產(chǎn)制備吡咯喹啉醌的工藝。

【背景技術(shù)】
[0002]卩比咯喹啉醌(Pyrroloquinolinequinine, PQQ)是一種水溶性醌類化合物，是葡萄糖脫氫酶和乙醇脫氫酶的輔酶，被認為是新的B族維生素(Nature 2003 ;422:832)。PQQ分子量為330，最早是在微生物中發(fā)現(xiàn)，隨后研究表明其也存在于動植物體內(nèi)。PQQ作為多種重要酶類的輔基，參與呼吸鏈中的電子傳遞，并能調(diào)節(jié)體內(nèi)自由基水平。具有重要的生理功能，已知PQQ與神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)的功能有如下四種:(I)抗氧化，清除自由基；(2)影響呼吸鏈功能，維護線粒體能量代謝；(3)刺激神經(jīng)生長因子的分泌，修復(fù)和促進神經(jīng)生長；(4)延緩ct-synuclein蛋白的沉積,防止神經(jīng)細胞纖維化。因此,有關(guān)研究人員認為PQQ對帕金森病和老年性癡呆等多種神經(jīng)變性性疾病具有潛在的治療價值。所以，尋找簡單易行的獲得PQQ的方法，進行產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，對促進人類的身體健康具有重大的意義。
[0003]化學(xué)合成PQQ步驟多，產(chǎn)率低，異構(gòu)體和副產(chǎn)品的去除需要多步純化，并需用多種有毒試劑而污染環(huán)境(JACS，1981 ；103:5599_2600)。因此，一般認為生物學(xué)合成方法更具產(chǎn)業(yè)化意義。PQQ廣泛存在于革蘭陰性菌中，但合成量卻有所不同，有些菌只產(chǎn)生痕量PQQ，供正常的生理代謝需求，如惡臭假單胞菌；還有些菌卻能產(chǎn)生過量的PQQ，并分泌到胞外。迄今發(fā)現(xiàn)的能產(chǎn)生過量PQQ的野生菌包括無色桿菌屬(Achromobacter)、交替單胞菌屬(Alteromonas)、彎桿菌屬(Ancylobacter)、生絲微菌屬(Hy-phomicrobium)、甲燒單胞菌屬(Methanomonas)、甲基菌屬(Methy-lobacillus)、甲基單胞菌屬(Methylomonas)、嗜甲基菌屬(Methy-lophilus)、甲基桿菌屬(Methylobacterium)、微環(huán)菌屬(Microcy-clus)、枝動菌屬(Mycoplana)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、精朊桿菌屬(Protaminobacter)> 原單胞菌屬(Protomonas)、硫桿菌屬(Th1bacillus)及黃色桿菌屬(Xanthobacter)等。目前，也有采用微生物發(fā)酵的方法生產(chǎn)PQQ，使用的原始菌種PQQ產(chǎn)量在0.07-7mg/L，發(fā)酵時間為2-5天左右(US Pat49943)。根據(jù)文獻調(diào)研，目前并沒有發(fā)現(xiàn)簡單易行的從微生物發(fā)酵液中獲取PQQ的方法，而實現(xiàn)PQQ的工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)不足，提供一種可能大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)制備吡咯喹啉醌的方法。
[0005]本發(fā)明的技術(shù)方案是:利用氧化葡萄糖桿菌生產(chǎn)吡咯喹啉醌的方法，它的步驟如下:
(1)將氧化葡萄糖桿菌DSM2003發(fā)酵，得到發(fā)酵液；
(2)發(fā)酵液經(jīng)高速離心，取上清液，經(jīng)HP-20型大孔樹脂色譜柱進行富集，得到富含吡咯喹啉醌的洗脫流份；(3)將富含吡咯喹啉醌的洗脫流份減壓濃縮，經(jīng)聚酰胺柱色譜純化，得到吡咯喹啉醌純品O
[0006]所述步驟(I)中將氧化葡萄糖桿菌發(fā)酵的操作如下:將氧化葡萄糖桿菌菌種按照5%的比例接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，所述培養(yǎng)基每升含有45-55 g山梨醇、15-25 g酵母提取物、3-6 g (NH4)2SO4,3-5 g KH2PO4,4-6 g MgSO4.H2O,在 28 攝氏度下震蕩培養(yǎng) 3d。
[0007]所述步驟(2)中HP-20型大孔樹脂色譜柱的條件是甲醇-水梯度洗脫，甲醇與水的體積比為0:1、1:9、7:34。
[0008]所述步驟(3)中聚酰胺柱色譜的條件是甲醇-水梯度洗脫，每10ml甲醇中含Iml氨水，甲醇與水的體積比為0:1、1:9。
[0009]氧化葡萄糖桿菌菌株在生產(chǎn)吡咯喹啉醌中的應(yīng)用。
[0010]本發(fā)明提供的氧化葡萄糖桿菌菌株在常規(guī)培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下，PQQ產(chǎn)量可達125mg/L,而且利用上述生產(chǎn)制備方法，條件簡單，過程快捷，便于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，對促進PQQ的產(chǎn)業(yè)化有重要意義。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0011]圖1 HP-20大孔樹脂柱色譜富含PQQ流份HPLC檢測，其中，A為對照品，B為樣品； 圖2聚酰胺柱色譜各個流份TLC檢測；
圖3產(chǎn)物的HPLC分析結(jié)果；
圖4為PQQ產(chǎn)物的紫外光譜，其中，A為對照品，B為樣品；
圖5為PQQ產(chǎn)物的質(zhì)譜。

【具體實施方式】
[0012]利用氧化葡萄糖桿菌生產(chǎn)吡咯喹啉醌的方法，它的步驟如下:
(I)氧化葡萄糖菌發(fā)酵培養(yǎng)
將菌種按照5%的比例接入發(fā)酵培養(yǎng)基(每升含有40 g山梨醇、20 g酵母提取物、5g (NH4)2SO4,2 g KH2PO4,5 g MgSO4.H2O)中，在28°C下震蕩培養(yǎng)3d。發(fā)酵罐培養(yǎng)時按照10%接種，培養(yǎng)基濃度為正常2倍。將菌種接種至富集培養(yǎng)基，28°C下震蕩培養(yǎng)5d，培養(yǎng)物50C 9000r/min離心15分鐘，得到含有PQQ的上清液。
[0013](2) PQQ的富集純化
上清液上HP-20型大孔樹脂色譜柱，用甲醇-水梯度洗脫(0%，10%, 70%, v/v),每個梯度洗脫10個柱體積，經(jīng)HPLC檢測，發(fā)現(xiàn)70%洗脫部位富含PQQ，將其減壓濃縮至無醇味。
[0014](3) PQQ的富集純化
得到上述富含PQQ濃縮液后，上聚酰胺色譜柱，甲醇-水梯度洗脫(95%，0%，水含1%氫氧化鈉)，經(jīng)TLC檢測，得到目標(biāo)產(chǎn)物PQQ。
[0015](4)產(chǎn)物分析
①產(chǎn)物的HPLC檢測,采用Waters Symmetry 300 C18反向色譜柱，以乙腈:水(乙腈和水均含2%甲酸)為流動相，流速lml/min,梯度洗脫(30-90%,30min),檢測波長254nm,可以得到較好的色譜分析結(jié)果。結(jié)果表明，產(chǎn)物為純度達到99%以上的PQQ樣品。
[0016]②產(chǎn)物氫譜數(shù)據(jù)，通過文獻報道PQQ氫譜數(shù)據(jù)對比，結(jié)果表明，樣品與其完全一o ViT*
【權(quán)利要求】
1.利用氧化葡萄糖桿菌生產(chǎn)吡咯喹啉醌的方法，其特征在于，它的步驟如下: (1)將氧化葡萄糖桿菌DSM2003發(fā)酵，得到發(fā)酵液； (2)發(fā)酵液經(jīng)高速離心，取上清液，經(jīng)HP-20型大孔樹脂色譜柱進行富集，得到富含吡咯喹啉醌的洗脫流份； (3)將富含吡咯喹啉醌的洗脫流份減壓濃縮，經(jīng)聚酰胺柱色譜純化，得到吡咯喹啉醌純品O
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用氧化葡萄糖桿菌生產(chǎn)吡咯喹啉醌的方法，其特征在于:所述步驟(I)中將氧化葡萄糖桿菌發(fā)酵的操作如下:將氧化葡萄糖桿菌菌種按照5%的比例接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，所述培養(yǎng)基每升含有45-55 g山梨醇、15-25 g酵母提取物、3_6 g(NH4)2SO4,3-5 g KH2PO4,4-6 g MgSO4.H2O,在 28 攝氏度下震蕩培養(yǎng) 3d。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用氧化葡萄糖桿菌生產(chǎn)吡咯喹啉醌的方法，其特征在于:所述步驟(2)中HP-20型大孔樹脂色譜柱的條件是甲醇-水梯度洗脫，甲醇與水的體積比為 0:1、1:9、7:34。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用氧化葡萄糖桿菌生產(chǎn)吡咯喹啉醌的方法，其特征在于:所述步驟(3)中聚酰胺柱色譜的條件是甲醇-水梯度洗脫，每10ml甲醇中含Iml氨水，甲醇與水的體積比為0:1、1:9。
5.氧化葡萄糖桿菌菌株在生產(chǎn)吡咯喹啉醌中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12P17/18GK104328155SQ201410664021
【公開日】2015年2月4日 申請日期:2014年11月20日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月20日
【發(fā)明者】楊雪鵬, 馬科, 胡仙妹, 鐘桂芳, 葉建斌, 劉寅, 馬歌麗 申請人:鄭州輕工業(yè)學(xué)院