一種東亞飛蝗ATP合酶α亞基基因及其dsRNA在害蟲防治中的應用的制作方法
【專利摘要】一種東亞飛蝗ATP合酶α亞基基因及其dsRNA在害蟲防治中的應用。本發(fā)明提供了蝗蟲的ATP合成酶酶α亞基cDNA的保守序列，并構建其RNA、DNA等構建體，利用RNAi技術沉默蝗蟲體內ATP合酶α亞基，使體內ATP合酶α亞基的表達明顯受到抑制，導致蝗蟲產(chǎn)生致死效應，可應用于RNAi技術對東亞飛蝗害蟲防治。
【專利說明】-種東亞飛蝗ATP合酶a亞基基因及其dsRNA在害蟲防治 中的應用

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物【技術領域】，尤其涉及一種ATP合酶a亞基基因、dsRNA及其在東 亞飛蝗防治中的應用。

【背景技術】
[0002] 害蟲嚴重危害農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，由于長期施用有機氯、有機磷等化學殺蟲劑，導致一系列 問題：農(nóng)藥殘留導致環(huán)境污染嚴重；有毒農(nóng)藥危害人類身體健康；昆蟲出現(xiàn)抗藥性，防治成 本提_等。目如已有將生物殺蟲劑應用于害蟲防治，但殺蟲時間較長，殺蟲效果不穩(wěn)定，因 此迫切需要新型的害蟲防治方法。
[0003] RNA干擾（RNAi)是一種通常由雙鏈RNA分子引起的特異性轉錄后基因沉默現(xiàn)象， 于2006年獲得諾貝爾獎。這一發(fā)現(xiàn)不僅為基因的功能研究提供了方法上的突破，同時也為 人類的疾病治療和害蟲防治開辟了新的途徑。2008年，Price和Gatehouse總結了眾多實 驗結果后，提出來基于RNAi的害蟲防治策略?；赗NA干擾技術的害蟲防治具有如下優(yōu) 勢：1)選擇對害蟲專一的基因進行干擾，對高等動物和人類是安全的；2)抗蟲具有專一性， 對靶標生物無殺傷作用；對環(huán)境無毒無害。


【發(fā)明內容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種核酸分子，可以編碼東亞飛蝗ATP合成酶a亞基的基 因，并作為藥物靶點，使蝗蟲致死。
[0005]-種核酸分子，其特征在于：序列為SEQ ID NO. 1及其互補序列。
[0006] 優(yōu)選地，上述核酸分子中，SEQIDN0. 2序列及其互補序列可以作為有效的藥物靶 點，干擾基因的轉錄表達。
[0007] 本發(fā)明的另一目的在于針對上述核酸分子，提供有效干擾其轉錄表達的 dsRNA (雙鏈核糖核酸）。
[0008] RNA構建體，其包含至少一個雙鏈RNA區(qū)，其至少一條鏈包含與上述任一核酸分子 互補的核苷酸序列。
[0009] 上述RNA構建體，其中所述至少一個雙鏈RNA區(qū)至少具有17bp。
[0010] 優(yōu)選地，RNA構建體，其序列為SEQ ID NO. 3或其互補序列。
[0011] DNA構建體，包含了上述核酸分子，或者包含編碼上述RNA構建體的區(qū)域。
[0012] 表達構建體，包含了上述DNA構建體。
[0013] 宿主細胞，包含上述RNA構建體、DNA構建體或表達構建體。
[0014] 殺蟲組合物，包含了上述RNA構建體和/或上述DNA構建體和/或上述表達構建 體和/或上述宿主細胞以及適合的載體。
[0015] 上述任一項RNA構建體和/或DNA構建體和/或表達構建體和/或宿主細胞以及 適合的載體和/或殺蟲組合物在防治蝗蟲中的應用。
[0016] 有益效果
[0017] 1.本發(fā)明獲得了蝗蟲的ATP合成酶酶a亞基eDNA的保守序列，并構建其RNA、DNA 等構建體沉默了蝗蟲體內ATP合酶a亞基，經(jīng)驗證體內ATP合酶a亞基的表達明顯受到 抑制，并導致蝗蟲產(chǎn)生致死效應，本發(fā)明可應用于RNAi技術對東亞飛蝗害蟲防治。
[0018] 2.本發(fā)明用于防治蝗蟲尤其是東亞飛蝗，種屬特異性強，不會對其它物種造成干 擾，如蜜蜂、人等；本發(fā)明基因特異性強，不會對除ATP合酶或a亞基之外的基因產(chǎn)生干擾 影響。
[0019] 3.本發(fā)明防治蝗蟲具有高效性，尤其是東亞飛幢，劑量小（dsRNA用量為100ng)， 起效快（處理2天左右導致蝗蟲致死）。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0020] 圖1 :五齡飛蝗注射SEQ ID NO :2合成的dsRNA后的致死情況。
[0021] 圖2 :五齡飛蝗注射序列為SEQ ID N0 :3合成的dsRNA后ATP合酶a亞基基因 (LmATPSA)的不同時間點mRNA表達，RP49做為內參基因。12,24,36h為注射dsRNA后的小 時數(shù)。

【具體實施方式】
[0022] 下面結合附圖和實施例對本發(fā)明做進一步詳細說明。以下實施例僅限于說明本發(fā) 明而不用于限制本發(fā)明的范圍。
[0023] 實施例1 :飛蝗ATP合酶a亞基基因及其dsRNA的獲得
[0024] i、飛蝗ATP合酶a亞基基因的獲得
[0025] 1)飛蝗ATP合酶a亞基基因在飛蝗EST數(shù)據(jù)庫的搜索
[0026] 基于飛蝗的EST數(shù)據(jù)庫，采用生物信息學方法對飛蝗ATP合酶a亞基基因進行搜 索，經(jīng)過序列拼接及比對后，共獲得1條飛蝗ATP合酶a亞基基因。
[0027] 2)飛蝗ATP合酶a亞基基因引物的設計
[0028] 基于已獲得LmATPSB的堿基序列，采用primer premier5. 0軟件設計引物。所有 引物均由南京金思瑞生物有限公司合成。
[0029] 3)飛蝗總RNA獲得
[0030] 選取大小一致雌雄各半飛蝗5齡若蟲，3頭一組，冷凍于液氮中，待提取RNA，具體 操作步驟參照TRIzol (Invitrogen)說明書。
[0031] 4)第一鏈cDNA的合成
[0032] 參照PromegaM-MLV反轉錄酶試劑說明書，進行第一鏈cDNA的合成。
[0033] 5)飛蝗ATP合酶a亞基基因的獲得
[0034] 根據(jù)Thermo Fusion說明書進行PCR，進一步克隆獲得飛蝗ATP合酶a亞基基因 cDNA序列。
[0035] 6)飛蝗ATP合酶a亞基基因堿基序列的分析
[0036] 利用Expasy網(wǎng)站中相關在線軟件和GENED0C、基因探索者等軟件分析所得序列， 之后在NCBI網(wǎng)站中使用BLAST功能進行序列同源性比對。經(jīng)序列驗證后，獲得的ATP合酶 a亞基（LmATP5A)序列全長2100bp，開放閱讀框1656bp。
[0037] II、飛蝗ATP合酶a亞基基因片段及其dsRNA合成
[0038] 1)飛蝗ATP合酶a亞基基因片段的獲得
[0039] 基于本研究所得到飛蝗ATP合酶a亞基基因的序列SEQIDN0:1 ;
[0040] 1，設計dsRNA弓丨物，引物序列分別為SEQ ID NO :4和SEQ ID NO :5。所有引物均 由南京金思瑞生物有限公司合成。
[0041] 選取大小一致雌雄各半東亞飛蝗5齡若蟲，三頭一組，凍存于液氮中，待提取RNA， 具體操作步驟參照TRIzol (Invitrogen)說明書。M-MLV反轉錄酶將所提RNA反轉錄成第一 鏈cDNA，以此為模板，以SEQ ID N0 :4和SEQ ID N0 :5為引物進行PCR擴增，獲得ATP合酶 a亞基基因片段。
[0042] 2)飛蝗ATP合酶a亞基dsRNA的合成
[0043] 膠回收試劑盒純化基因片段，試劑盒純化后按照MEGAscript high yield transcription kit (Ambion)說明書合成dsRNA，dsRNA濃度采用紫外分光光度計測定，并 稀釋至終濃度為20ng/iil。所述的dsRNA片段如SEQ ID N0 :3所示。
[0044] 實施例2:飛蝗ATP合酶a亞基dsRNA致死五齡飛蝗
[0045]1、飛蝗ATP合酶a亞基dsRNA注射
[0046] 選取五齡第三天、大小均一、健康狀況一致的若蟲用于注射上述合成的dsRNA(SEQ ID NO :3)，25iil規(guī)格微量注射器用于注射，注射時不可用力過大，順著血液流動的方向， 側腹部第2至3腹節(jié)的連接處作為注射點，避開氣門。注射dsRNA的量為100ng，并設置 dsGFP(lOOng)的對照組，每組20頭蟲，3個生物學重復，共計60頭。注射完畢后，將試蟲用 朔料籠子進飼養(yǎng)（光照：黑暗時間為14h : 10h，溫度30±2°C)，給以新鮮小麥幼苗。
[0047] 2、注射dsRNA后五齡飛蝗表型的觀察
[0048] 五齡幼蟲經(jīng)注射dsRNA后，注射dsGFP對照組5天后開始蛻皮并全部成功蛻皮至 成蟲，蛻皮至成蟲后形態(tài)活力正常。注射dsATP5A的處理組若蟲共60頭，第2天開始死亡， 第4天死亡率超過90 %，生測圖如圖1所示。
[0049] 3、飛蝗ATP合酶a亞基基因mRNA水平檢測
[0050] 對5齡飛蝗若蟲dsRNA注射后不同時間點的沉默效率檢測，選擇注射后12h、24h 和36h的蟲體作為RNA提取對象，每組各個時間點設置3個生物學重復。提取各樣品的總 RNA并反轉錄成第一鏈cDNA，用RT-PCR檢測目的基因（LmATP5A)和管家基因（RP49)的表達 量（圖2)。經(jīng)數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，飛蝗體內注射ATP合酶a亞基雙鏈RNA后，LT 5Q為2. 4±0. 4 天；mRNA表達量在注射后12小時、24小時和36小時依次降低了 91. 7%，93. 6%和95. 7%;。 而注射GFP dsRNA的東亞飛蝗體內的ATP合酶a亞基的mRNA沒有顯著性的變化，也不引 起致死。
[0051] 按照實施例2所述方法將dsRNA (SEQIDN0 :3)分別注射入蜜蜂、蜘蛛體內，未發(fā) 現(xiàn)致死現(xiàn)象。
[0052] 表1實施例2中注射dsRNA后體內a亞基相對表達量
[0053]

【權利要求】
1. 一種核酸分子，其特征在于：序列為SEQ ID NO. 1或SEQ ID NO. 2,或SEQ ID NO. 1 或SEQ ID NO. 2的互補序列。
2. -種RNA構建體，其包含至少一個雙鏈RNA區(qū)，其至少一條鏈包含與權利要求1或 2所述任一核酸分子互補的核苷酸序列。
3. 權利要求2的RNA構建體，其中所述至少一個雙鏈RNA區(qū)至少為17bp。
4. 權利要求2的RNA構建體，序列為SEQ ID NO. 3或其互補序列。
5. -種DNA構建體，包含了權利要求1或2核酸分子，或者包含編碼權利要求3或4所 述RNA構建體的區(qū)域。
6. 表達構建體，包含了如權利要求5所述DNA構建體。
7. -種宿主細胞，包含權利要求3或4所述RNA構建體或權利要求5所述DNA構建體 或權利要求6所述表達構建體。
8. -種殺蟲組合物，包含了權利要求3或4所述RNA構建體和/或權利要求5所述DNA 構建體和/或權利要求6所述表達構建體和/或權利要求7所述宿主細胞以及適合的載體。
9. 權利要求3或4所述RNA構建體和/或權利要求5所述DNA構建體和/或權利要求 6所述表達構建體和/或權利要求7所述宿主細胞以及適合的載體和/或權利要求8所述 殺蟲組合物在防治蝗蟲中的應用。
10. 如權利要求9所述的蝗蟲為東亞飛蝗。
【文檔編號】C12N15/55GK104450755SQ201410665503
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年11月14日 優(yōu)先權日:2014年11月14日
【發(fā)明者】夏玉先, 胡軍 申請人:重慶大學, 夏玉先