纖維素酶蛋白的分離提純方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及到纖維素酶分離純化方法。本方法首先調(diào)節(jié)纖維素酶蛋白濃度至3mg/mL～8mg/mL，通過(guò)高精度強(qiáng)陰離子柱層析，利用線性與梯度相結(jié)合的洗脫方式對(duì)纖維素酶液進(jìn)行初步分離，真空冷凍濃縮至凍干粉，用pH4.0～6.0緩沖液溶解，然后再通過(guò)凝膠柱層析，并采用蛋白電泳進(jìn)行純度檢測(cè)，最后通過(guò)質(zhì)譜檢測(cè)，從而達(dá)到高效、精確分離提純纖維素酶單酶組分的目的。與現(xiàn)有的方法對(duì)比，本方法可以實(shí)現(xiàn)酶蛋白單一組分的快速高效和精確分離，并能一次性獲得多個(gè)單酶組分。
【專利說(shuō)明】纖維素酶蛋白的分離提純方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于酶【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及到單酶分離提純方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 纖維素酶是一類多組分酶的總稱，能夠?qū)㈦y以被生物利用的纖維素水解為利于被 生物利用的葡萄糖，因此被認(rèn)為是潛力巨大的酶制劑之一。纖維素酶屬于糖苷水解酶，能夠 降解纖維素的纖維素酶系至少包括三類組分：1、內(nèi)切型-β -葡聚糖酶（endo-Ι，4-β-D-gl ucanase, EC3. 2. I. 4) ;2、外切型-β -葡聚糖酶（exo-1, 4- β -D-glucanase, EC 3· 2. I. 91); 3、β -葡萄糖苷酶（β -1，4-D-glucosidase, EC 3. 2. I. 21)。而纖維素主體由批喃葡萄糖構(gòu) 成，并以β -1，4糖苷鍵連接，形成的大分子線性多聚物，單體為纖維二糖分子，主要由結(jié)構(gòu) 穩(wěn)定、微生物難以降解的結(jié)晶區(qū)和結(jié)構(gòu)疏松、微生物容易降解的非結(jié)晶區(qū)兩部分構(gòu)成。
[0003] 纖維素酶系中的酶組分并不是單獨(dú)作用于纖維素從而水解纖維素的，它們通過(guò)相 互協(xié)同作用實(shí)現(xiàn)水解功能，其中內(nèi)切型-葡聚糖酶作用于非結(jié)晶區(qū)，水解β -1，4糖苷 鍵，可將線性纖維素多聚物截?cái)嗌纱罅繋Х沁€原性末端的纖維素小分子；外切型_β -葡 聚糖酶水解1，4-β-D-糖苷鍵，作用于線性纖維素多聚物的末端，生成單個(gè)纖維二糖分子； β_葡萄糖苷酶則將纖維二糖水解成為葡萄糖。通過(guò)纖維素酶復(fù)合酶組分的相互協(xié)同作用， 可以將地球上最豐富的生物高聚物一纖維素，轉(zhuǎn)化為微生物可以輕易利用的葡萄糖分子， 并通過(guò)發(fā)酵產(chǎn)生生物燃料，用以緩解目前的能源短缺的問(wèn)題。
[0004] 纖維素酶的來(lái)源廣泛，能產(chǎn)生纖維素酶的生物包括昆蟲(chóng)、軟體動(dòng)物、原生動(dòng)物、細(xì) 菌和真菌，纖維素酶最為方便的來(lái)源就是采用微生物作為纖維素酶的來(lái)源。然而，這些自產(chǎn) 酶天生具有一定的配比缺陷，比如：里氏木霉的纖維素酶中CBH II和β -葡萄糖苷酶表達(dá) 量不足，而黑曲霉所產(chǎn)酶中各酶的分泌高峰期不同，這些因素均對(duì)纖維素水解有限制作用。 所以，優(yōu)化定制纖維素酶，使各組分達(dá)到最佳配比，才能在最少酶用量時(shí)獲得最優(yōu)的水解效 果?？梢?jiàn)，對(duì)纖維素酶復(fù)合酶液進(jìn)行單酶分離提純是十分必要的。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供纖維素酶酶蛋白的分離提純方法，通過(guò)高精度強(qiáng)陰離子柱 過(guò)柱、真空冷凍濃縮以及凝膠柱過(guò)柱，對(duì)纖維素復(fù)合酶液進(jìn)行分離，并使之達(dá)到電泳純。為 分析纖維素酶協(xié)同作用，提高纖維素酶酶解效率奠定了基礎(chǔ)。
[0006] 本發(fā)明的技術(shù)解決方法包括的纖維素酶蛋白的分離提純方法包括以下步驟：
[0007] 1、纖維素酶液蛋白濃度調(diào)節(jié)：一般而言，商業(yè)纖維素酶制劑十分粘稠，色澤厚重， 微生物自產(chǎn)酶或復(fù)配酶酶蛋白含量較低，均不滿足柱層析的要求，對(duì)酸性纖維素酶液而言， 用pH4. 0?6. 0緩沖溶液，例如檸檬酸緩沖液、檸檬酸-磷酸緩沖液或乙酸鈉緩沖液，將纖 維素酶蛋白含量調(diào)節(jié)至3mg/mL?8mg/mL較為合適。
[0008] 2、純化：對(duì)稀釋后的纖維素酶液進(jìn)行陰離子交換柱層析色譜，采用高精度強(qiáng)陰離 子交換柱，例如Mono Q 5/50GL或Hitrap Q HP，利用線性與梯度洗脫結(jié)合的方式對(duì)纖維素 酶液進(jìn)行分離，層析緩沖液為pH7. O?9. O緩沖溶液，例如Tris-HCl緩沖液。
[0009] 3、電泳純條帶檢測(cè)：對(duì)接收液進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，當(dāng)接收管所對(duì)應(yīng)條帶為單一條 帶時(shí)，其接收管直接進(jìn)入下一步的質(zhì)譜鑒定；當(dāng)接收管對(duì)應(yīng)條帶雜而多時(shí)，其接收管進(jìn)行真 空冷凍濃縮過(guò)夜，將凍干酶粉用PH4. 0?6. 0緩沖溶液進(jìn)行溶解，再采用凝膠柱層析，例如 Surperdex? 7510/300L 或 Surperdex? 20010/300L，層析緩沖液為 pH4. 0 ?6. 0 緩沖溶液。 將所得接收液同樣進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，保留單條帶所對(duì)應(yīng)的接收管。
[0010] 4、質(zhì)譜檢測(cè)：對(duì)所有單條帶對(duì)應(yīng)的接收管均進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)，即可得到確切的單酶 組分。
[0011] 本發(fā)明的有益效果：
[0012] 1、本方法操作周期短，分離工藝簡(jiǎn)單，主要由陰離子柱層析與凝膠柱層析組成，陰 離子柱層析耗時(shí)約3小時(shí)，凝膠柱層析耗時(shí)約6小時(shí)。
[0013] 2、采用高精度強(qiáng)陰離子交換柱，提高分離效率，通過(guò)SDS-PAGE與質(zhì)譜檢測(cè)，能夠 精確檢驗(yàn)分離組分。
[0014] 3、在經(jīng)過(guò)陰離子柱層析與真空冷凍濃縮后，用pH4. 0?6. 0的緩沖液溶解，且凝膠 柱層析的緩沖液同樣使用ΡΗ4. 0?6. 0的緩沖液，使分離后所得酶蛋白處于適宜環(huán)境中，保 持酶蛋白活力。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0015] 圖I B液濃度控制0?20 %線性增加，洗脫體積為30CV
[0016] 圖2 B液濃度控制20?30 %線性增加，洗脫體積為20CV
[0017] 圖3 B液濃度控制30?50 %線性增加，洗脫體積為30CV
[0018] 圖4 Mono Q 5/50GL柱層析后對(duì)蛋白峰進(jìn)行SDS-PAGE，其中，
[0019] 泳道1、2、3檢測(cè)的是圖1中的峰1，
[0020] 泳道4、5、6、7檢測(cè)的分別是圖2中的峰1、2、3、4，
[0021] 泳道8、9、10、11、12檢測(cè)的是圖3中的峰1、2、3、4、5。
[0022] 圖5對(duì)圖4第5泳道所對(duì)應(yīng)的接收液進(jìn)行凝膠柱層析
[0023] 圖6對(duì)圖4第6泳道所對(duì)應(yīng)的接收液進(jìn)行凝膠柱層析
[0024] 圖7對(duì)圖4第7泳道所對(duì)應(yīng)的接收液進(jìn)行凝膠柱層析
[0025] 圖8 -次純化和兩次純化后所得蛋白峰SDS-PAGE，其中，
[0026] 泳道1、2檢測(cè)的是圖5中的峰1，
[0027] 泳道3、4檢測(cè)的是圖7中的峰1，
[0028] 泳道5、6檢測(cè)的是圖1中的峰1，
[0029] 泳道7檢測(cè)的是圖3中的峰5。
[0030] 圖9 B液濃度控制0?9 %線性增加，洗脫體積為IOCV
[0031] 圖10 B液濃度控制0?13 %線性增加，洗脫體積為20CV
[0032] 圖11 B液濃度控制20?30%線性增加，洗脫體積為20CV
[0033] 圖12 Mono Q 5/50GL柱層析后對(duì)蛋白峰進(jìn)行SDS-PAGE，其中，
[0034] 泳道1檢測(cè)的是圖11中的峰1，
[0035] 泳道2、3檢測(cè)的是圖11中的峰2，
[0036] 泳道4檢測(cè)的是圖11中的峰3，
[0037] 泳道5檢測(cè)的是圖9中的峰1，
[0038] 泳道6、7、8、9檢測(cè)的分別是圖10中的峰1、2、3、4。
[0039] 圖13對(duì)圖4的第2泳道所對(duì)應(yīng)的蛋白接收液進(jìn)行凝膠柱層析
[0040] 圖14對(duì)圖4的第4泳道所對(duì)應(yīng)的蛋白接收液進(jìn)行凝膠柱層析
[0041] 圖15 -次純化和兩次純化后所得蛋白峰SDS-PAGE，其中，
[0042] 泳道1檢測(cè)的是圖11的峰3，
[0043] 泳道2檢測(cè)的是圖9中的峰1，
[0044] 泳道3、4檢測(cè)的是圖10中的峰2、3，
[0045] 泳道5、6檢測(cè)的是圖14中的峰1。

【具體實(shí)施方式】
[0046] 下面通過(guò)實(shí)例，對(duì)發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行進(jìn)一步的說(shuō)明。
[0047] 實(shí)施例1
[0048] 取商業(yè)酶制劑GC220原酶液適量，用50mM檸檬酸緩沖液（pH4. 8)稀釋纖維素酶蛋 白濃度至5. 4369mg/mL,用水系0. 45 μ m針頭式過(guò)濾器過(guò)濾一次,使用美國(guó)通用電氣醫(yī)療集 團(tuán)生產(chǎn)的AKT avant蛋白分離儀，通過(guò)高精度強(qiáng)陰離子柱Mono Q 5/50GL將復(fù)合酶液進(jìn)行 初步分離。其中：緩沖液A液是20mM Tris-HCl緩沖液（pH7. 5)，B液是含IM NaCl的A液， 上樣量為lmL，控制流速為0. 7mL/min。陰離子柱層析結(jié)果見(jiàn)圖1?3。
[0049] 通過(guò)高精度強(qiáng)陰離子交換柱Mono Q 5/50GL后，對(duì)蛋白峰進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)。檢 測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖4。
[0050] 凝膠柱Surperdex? 75 10/300L上樣量為500yL，對(duì)第一次跑膠驗(yàn)證后雜帶所 對(duì)應(yīng)的接收液進(jìn)行真空冷凍干燥至凍干粉，用50mM檸檬酸緩沖液（pH4. 8)溶解，然后通過(guò) Surperdex? 7510/300L凝膠柱層析，進(jìn)行進(jìn)一步純化，層析緩沖液為含有0. 15 M NaCl的 50mM檸檬酸緩沖液（pH4. 8)，控制流速為0. 8mL/min。凝膠柱層析結(jié)果見(jiàn)圖5?7。
[0051] 對(duì)這些蛋白進(jìn)行SDS-PAGE預(yù)實(shí)驗(yàn)后，將經(jīng)過(guò)一次純化得到的電泳純和二次純化 得到的電泳純條帶所對(duì)應(yīng)的接收液進(jìn)行SDS-PAGE。結(jié)果見(jiàn)圖8。
[0052] 對(duì)圖8中的這些條帶進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)，快速鑒定蛋白種類。鑒定結(jié)果見(jiàn)下表。
[0053]

【權(quán)利要求】
1. 纖維素纖維素酶蛋白的分離提純方法，其特征在于方法的步驟如下： 1) 纖維素酶液蛋白濃度調(diào)節(jié)：用PH4. 0?6. 0緩沖溶液將纖維素酶液調(diào)節(jié)至合適的蛋 白濃度。 2) 純化：對(duì)稀釋后的纖維素酶液進(jìn)行陰離子交換柱層析，利用線性與梯度洗脫結(jié)合的 方式對(duì)纖維素酶液進(jìn)行分離，層析緩沖液為pH7. 0?9. 0緩沖溶液。 3) 電泳純條帶檢測(cè)：對(duì)接收液進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，當(dāng)接收管所對(duì)應(yīng)條帶為單一條帶 時(shí)，其接收管直接進(jìn)入下一步的質(zhì)譜鑒定；當(dāng)接收管對(duì)應(yīng)條帶雜而多時(shí)，其接收管利用凝膠 柱層析進(jìn)一步分離純化，同樣再進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，對(duì)單條帶所對(duì)應(yīng)的接收管保留。 4) 質(zhì)譜鑒定：對(duì)所有單條帶對(duì)應(yīng)的接收管均進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)，即可得到確切的單酶組 分。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的纖維素酶蛋白的分離提純方法，其纖維素酶是指商業(yè)酶制 齊IJ、各種微生物發(fā)酵培養(yǎng)所產(chǎn)酶液或其復(fù)配的酶液。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的纖維素酶蛋白的分離提純方法，其步驟1)中所用的PH4.0? 6. 0緩沖液是指pH4. 0?6. 0能使酶蛋白處于適宜環(huán)境中，保持酶蛋白活力的緩沖液。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的纖維素酶蛋白的分離提純方法，其步驟1)中調(diào)節(jié)纖維素酶液 蛋白濃度至3mg/mL?8mg/mL。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的纖維素酶蛋白的分離提純方法，其步驟2)中所用的pH7.0? 9. 0緩沖液是指pH7. 0?9. 0能使酶蛋白顆粒帶負(fù)電荷的緩沖液。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的纖維素酶蛋白的分離提純方法，其步驟2)中純化所用陰離子 交換柱是指Mono Q 5/50GL及能與纖維素酶蛋白發(fā)生離子交換作用的高精度強(qiáng)陰離子柱。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的纖維素酶蛋白的分離提純方法，其步驟3)中進(jìn)一步分離純化 根據(jù)接收管條帶是否單一而定，當(dāng)接收管所對(duì)應(yīng)條帶為單一條帶時(shí)，其接收管直接進(jìn)入下 一步的質(zhì)譜鑒定；當(dāng)接收管對(duì)應(yīng)條帶雜而多時(shí)，其接收管進(jìn)行真空冷凍濃縮至凍干粉，再用 pH4. 0?6. 0緩沖溶液進(jìn)行溶解，進(jìn)行凝膠柱層析，層析緩沖液為pH4. 0?6. 0緩沖溶液。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的纖維素酶蛋白的分離提純方法，其步驟3)中純化所用凝膠柱 是指Surperdex? 7510/300L及對(duì)纖維素酶蛋白起分子篩作用的葡聚糖凝膠層析柱。
【文檔編號(hào)】C12N9/42GK104371990SQ201410665840
【公開(kāi)日】2015年2月25日 申請(qǐng)日期:2014年11月19日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月19日
【發(fā)明者】孫付保, 白仁惠, 張?jiān)撇? 張震宇, 沈松, 周邦煒 申請(qǐng)人:江南大學(xué)