一種補料生產(chǎn)l-茶氨酸的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種補料生產(chǎn)L-茶氨酸的方法，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明所解決的技術(shù)問題是提供了恒速補料和變速補料的工藝，可以提高L-茶氨酸在高濃度底物下的轉(zhuǎn)化率，降低生產(chǎn)成本，技術(shù)方案為：采用來源于枯草芽胞桿菌來源的γ-GGTase生產(chǎn)L-茶氨酸；按照1:5到1:15的比例配制L-谷氨酰胺和乙胺鹽酸鹽，設(shè)定溫度30-45℃，調(diào)pH 9.0-11.0后，按照每毫升反應(yīng)液2-20個單位的量加入γ-GGTase，每2小時補加一定量的底物，反應(yīng)10-20小時，得到較高濃度的L-茶氨酸。
【專利說明】一種補料生產(chǎn)[-茶氨酸的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種補料生產(chǎn)卜茶氨酸的方法，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002]1-茶氨酸([-1116)，又稱乙基-V -谷氨酰胺(54-61:1171- V 此肅丨加)或V -谷氨酰乙胺(V，由日本科學(xué)家于1949年首次從綠茶中分離得到，是茶葉中特有的游離氨基酸，也是茶葉的主要風(fēng)味物質(zhì)。1 811880^等首次將該酶從茶的籽根中成功分離，并證明其對1-1116、乙胺及八I？具有較高的親和性，但該酶穩(wěn)定性差，在體外極易失活。
[0003]近年來，據(jù)越來越多的研究報道，1-茶氨酸具有鎮(zhèn)靜減壓、提高認知、增強免疫力以及預(yù)防腫瘤等重要生理功能，同時作為食品添加劑廣泛應(yīng)用于飲料、糖果、餅干、冰激凌等廣品中，起到改善食品風(fēng)味和提聞營養(yǎng)價值等作用。
[0004]在醫(yī)藥領(lǐng)域已用于預(yù)防癌癥、預(yù)防阿爾茨海默癥、控制抑郁癥等方面；在保健食品中用于鎮(zhèn)靜放松、抗疲勞、提高學(xué)習(xí)記憶能力等方面；在普通食品中用于改善食品風(fēng)味、強化營養(yǎng)等，也有報道用1-1116進行飲用水進化、除臭、抗腐蝕劑及抗酸化劑的例子。1-1110在市場的需求日漸廣泛，需求量也越來越大，因此開發(fā)低成本、大規(guī)模制備匕茶氨酸技術(shù)的要求日漸迫切。
[0005]1-1116的制備方法主要有從綠茶中直接提取法、化學(xué)合成法和微生物酶法。
[0006]直接提取[-11?的方法有傳統(tǒng)的化學(xué)試劑沉淀法和隨后發(fā)展起來的離子交換層析法?；瘜W(xué)試劑沉淀法的主要采用熱水浸泡茶葉而形成茶湯或冷乙醇提取獲得提取液，加入堿式碳酸銅使1-1116與之反應(yīng)析出形成1-1116-銅鹽沉淀，使用稀硫酸溶解后通入43氣體去除后加入一定量83 (0?) 2沉淀液體中3042—等雜質(zhì)，得到較純的1-1116液體，最后對液體通過抽濾、濃縮、結(jié)晶、精制等步驟，獲得高純1^-1116粉末或晶體。離子交換法采用合適的溶液1)?使目標(biāo)氨基酸帶上相應(yīng)的電荷，并通過離子交換柱達到分離提取的目的。直接提取法生產(chǎn)1-1116具有原料成本高、提取工序復(fù)雜、得率低等缺點，不能滿足低成本、大規(guī)模制備高純卜了“的市場要求。
[0007]化學(xué)合成法主要分為三條合成路線:1.吡咯烷酮酸或焦谷氨酸法，利用乙胺和1-吡咯烷酮酸生成卜茶氨酸。1 110^6118^6111等于1942年在實驗室中用乙胺和卜吡咯烷酮酸在水溶液中反應(yīng)，合成1-1116，但收率較低；后人嘗試用吡咯烷酮酸和無水乙胺在低溫下反應(yīng)或營造惰性環(huán)境等，提高了 1-1116的收率取代谷氨酸酯和乙胺水解反應(yīng)產(chǎn)生化取代茶氨酸:3.取代谷氨酸酐法，首先利用保護基保護谷氨酸中的0 -氨基，然后進行分子內(nèi)脫水形成環(huán)狀谷氨酸酐，再與乙胺作用生產(chǎn)化取代茶氨酸，最后去除保護基團得到1-1116。化學(xué)合成法存在反應(yīng)時間長、收率低等缺點，同時由于需要采用高壓、惰性氣體保護和保護基團等方式，增加生產(chǎn)成本。
[0008]微生物酶法合成具有操作簡單，構(gòu)型專一，放大生產(chǎn)容易等優(yōu)點，是降低生產(chǎn)成本，提高生產(chǎn)強度的有效途徑，現(xiàn)已逐漸代替直接提取法和化學(xué)合成法，成為[-1116大規(guī)模生產(chǎn)的主流方法。然而，現(xiàn)有的研究存在Y-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(Y-GGT)的酶種開發(fā)較少，野生酶酶活較低，對L-The生產(chǎn)應(yīng)用的效果有待提高，在高底物濃度下反應(yīng)的研究較少等缺點，這些不足限制了其工業(yè)化應(yīng)用進程。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明所解決的技術(shù)問題是提供了一種生物法生產(chǎn)L-The的工藝，降低了 L-The的生產(chǎn)成本。
[0010]為解決上述問題，本發(fā)明技術(shù)方案為:
[0011]采用來源于Bacillus subtilis的Y-GGT重組酶生產(chǎn)L-The:L_谷氨酰胺(L-Gln)和乙胺鹽酸鹽按照一定比例配制成底物溶液，調(diào)pH 9-11后，按照每毫升反應(yīng)液2-20個單位的量加入來源于枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis),中國典型微生物保藏中心，CCTCC AB 130001) GGTase，充分反應(yīng)10-20小時，采用恒速和變速補料工藝提高L-The產(chǎn)量。
[0012]所述恒速補料方法為=L-Gln和乙胺鹽酸鹽按照一定比例配制成底物溶液，調(diào)pH
9-11后，按照每毫升反應(yīng)液2-20個單位的量加入GGTase，每2h補加一定量的底物，反應(yīng)
10-20小時生產(chǎn)L-The。
[0013]所述變速補料方法為=L-Gln和乙胺鹽酸鹽按照一定比例配制成底物溶液，調(diào)pH9-11后，按照每毫升反應(yīng)液2-20個單位的量加入GGTase，每2h測定底物消耗量并補加底物至初始濃度，反應(yīng)10-20小時生產(chǎn)L-The。
[0014]所述微生物發(fā)酵生產(chǎn)GGTase的方法為，在一定培養(yǎng)條件下，微生物發(fā)酵一定時間(Xingyi Chen, Lingqia Su, Danffu, Jing ffu.Applicat1n ofrecombinantBacillus subtilis Y-glutamyltranspeptidase to the product1n ofL-theanine[J].ProcessB1chemistry, 2014，49:1429 - 1439)，得到含有GGTase的發(fā)酵液，發(fā)酵液經(jīng)過粗過濾、精過濾、濃縮、干燥等全部工藝或部分工藝后得到GGTase粉沫或者粗酶液。
[0015]所述GGTase的最適反應(yīng)溫度為30°C _40°C，溫度通過影響酶對底物的催化效率，從而影響酶的活力，溫度過高或過低都會影響酶的作用效果。從降低生產(chǎn)成本考慮，應(yīng)該將生產(chǎn)工藝的溫度設(shè)定在酶最適溫度附近，這樣大大降低加入的酶量，從而降低生產(chǎn)成本。
[0016]所述GGTase的最適pH范圍為9.0-11.0，pH對GGTase活力的影響較大，從降低成本的角度考慮，應(yīng)該將生產(chǎn)工藝的溫度設(shè)定在酶最適反應(yīng)PH附近。
[0017]L-The的分析采用高效液相色譜。色譜條件:Waters 600HPLC色譜儀，Waters自動進樣器，檢測系統(tǒng):Agilent 1200,色譜柱:Eclipse XDB-C185 μ m(4.6mmX 150mm);流動相A相為無水醋酸鈉4.52g,加入IL去離子水，再加入225 μ L三乙胺，醋酸調(diào)節(jié)pH到7.2±0.05，后加入5mL四氫呋喃。B相為無水醋酸鈉4.52g加去離子水定容為200mL，醋酸調(diào)節(jié)pH到7.2±0.05，再加400mL甲醇和400mL乙腈。流速0.8mL/min,柱溫40°C。處理樣品用10% (w/v)的三氯乙酸等體積稀釋,室溫放置l_2h, 12000r.min-1離心1min,再用
0.22 μ m水相針式濾器過濾后上機分析。
[0018]所述L-Gln與乙胺鹽酸鹽的配比可以為1:5到1:15之間。在L-Gln與乙胺鹽酸鹽合成L-The的反應(yīng)中，L-Gln分子與乙胺分子的反應(yīng)比例為1:1，而由于GGT受體活性位點的特異性較低，除乙胺外，水分子，L-Gln等均能結(jié)合在受體的活性中心，與乙胺形成競爭關(guān)系，而降低目標(biāo)產(chǎn)物L(fēng)-The的產(chǎn)量。因此，在實踐過程中，往往需要使乙胺過量于L-Gln，來提高L-The產(chǎn)量。
[0019]本發(fā)明的技術(shù)原理如下:
[0020]采用GGTase轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)L-The時，底物濃度過高會導(dǎo)致L-The轉(zhuǎn)化率下降，其原因主要是因為高濃度的底物L(fēng)-Gln對GGTase具有抑制作用，因此考慮使用較低的初始底物濃度，通過補料策略將底物濃度維持在較低的條件下，反應(yīng)速率快，提高了 L-The的轉(zhuǎn)化率。
[0021]本發(fā)明是根據(jù)GGTase以及產(chǎn)物L(fēng)-The的特點生產(chǎn)L-The的工藝，相對于現(xiàn)有技術(shù)，具有以下優(yōu)點:
[0022]I)提供一種高轉(zhuǎn)化率、低成本的L-The的生產(chǎn)方法，填補了該【技術(shù)領(lǐng)域】內(nèi)的空白，為L-The大規(guī)模的生物法生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)；
[0023]2)酶反應(yīng)的溫度比較低，不需要進行大量的升溫降溫控制，低能耗，特別適合工業(yè)化生產(chǎn)；
[0024]3)采用恒速補料的工藝，定時補加底物，提高L-The的轉(zhuǎn)化率，達到65%左右；
[0025]4)采用變速補料的工藝，定時補加消耗的底物量，提高L-The的轉(zhuǎn)化率，達到75%
左右；
[0026]5)本反應(yīng)總的反應(yīng)周期短，只需要10-20小時，適合工業(yè)化生產(chǎn)；
[0027]總體來講，本發(fā)明具有生產(chǎn)成本低、原料轉(zhuǎn)化率高、產(chǎn)品濃度高、工藝流程簡單、生產(chǎn)周期短等諸多優(yōu)點。
[0028]實施例1
[0029]底物配制:
[0030]L-Gln濃度為200mmol/L，按照1:10的比例加入乙胺鹽酸鹽，用緩沖液調(diào)pH到10.0。
[0031]酶法生產(chǎn)工藝:
[0032]底物溶液配制好后將溫度調(diào)至37°C，按照每毫升反應(yīng)液加入6單位的Y -GGTase,然后每反應(yīng)2小時補加200mmol L-Gln,并定時補加乙胺鹽酸鹽保持過量,共反應(yīng)14小時；
[0033]所述L-The的分析采用高效液相色譜。色譜條件:Waters 600HPLC色譜儀,Waters自動進樣器，檢測系統(tǒng):Agilent 1200,色譜柱:Eclipse XDB-C185 μ m(4.6mmX 150mm);流動相A相為無水醋酸鈉4.52g,加入IL去離子水，再加入225 μ L三乙胺，醋酸調(diào)節(jié)pH到7.2±0.05，后加入5mL四氫呋喃。B相為無水醋酸鈉4.52g加去離子水定容為200mL，醋酸調(diào)節(jié)PH到7.2±0.05，再加400mL甲醇和400mL乙腈。流速0.8mL/min,柱溫40°C。處理樣品用10% (w/v)的三氯乙酸等體積稀釋,室溫放置l_2h, 12000r.min-1離心1min,再用0.22 μ m水相針式濾器過濾后上機分析。底物L(fēng)-Gln總濃度為lOOOmmol/L，L-The總轉(zhuǎn)化率可達56.2%。
[0034]實施例2
[0035]底物配制:
[0036]同實施例1
[0037]酶法生產(chǎn)工藝:
[0038]底物溶液配制好后將溫度調(diào)至37°C，按照每毫升反應(yīng)液加入6單位的Y -GGTase,然后每反應(yīng)2小時補加15011111101 ，并定時補加乙胺鹽酸鹽保持過量，共反應(yīng)14小時；
[0039]1-茶氨酸檢測方法:
[0040]同實施例1
[0041]底物[-以!!總濃度為95011111101/1，[-11?總轉(zhuǎn)化率可達63.7%。
[0042]實施例3
[0043]底物配制:
[0044]同實施例1
[0045]酶法生產(chǎn)工藝:
[0046]底物溶液配制好后將溫度調(diào)至371，按照每毫升反應(yīng)液加入6單位的V -661^86,然后每反應(yīng)2小時補加10011111101 ，并定時補加乙胺鹽酸鹽保持過量，共反應(yīng)16小時；
[0047]1-茶氨酸檢測方法:
[0048]同實施例1
[0049]底物[-以!!總濃度為90011111101/1，總轉(zhuǎn)化率可達67.8%。
[0050]實施例4
[0051]底物配制:
[0052]同實施例1
[0053]酶法生產(chǎn)工藝:
[0054]底物溶液配制好后將溫度調(diào)至371，按照每毫升反應(yīng)液加入6單位的V -661^86,然后每反應(yīng)2小時測定卜以!!消耗量，并補加卜以!!至初始濃度，并定時補加乙胺鹽酸鹽保持過量，共反應(yīng)16小時；
[0055]1-1116 檢測方法:
[0056]同實施例1
[0057]底物總濃度為60011111101/1，總轉(zhuǎn)化率可達 74.3%。
【權(quán)利要求】
1.一種補料生產(chǎn)L-茶氨酸的方法，屬于生物技術(shù)【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明所解決的技術(shù)問題是提供了恒速補料和變速補料的工藝，降低了 L-茶氨酸的生產(chǎn)成本，提高了轉(zhuǎn)化率。技術(shù)方案為:采用來源于枯草芽胞桿菌來源的Y-GGTase生產(chǎn)L-茶氨酸；按照1:5到1:15的比例配制L-谷氨酰胺和乙胺鹽酸鹽，設(shè)定溫度30-45°C，調(diào)pH 9.0-11.0后，按照每毫升反應(yīng)液2-20個單位的量加入Y-GGTase，每2小時補加底物100-200mmol，反應(yīng)10-20小時，最終底物濃度為600-1000mmol/L，得到L-茶氨酸轉(zhuǎn)化率達到60-80%。
【文檔編號】C12P13/04GK104372046SQ201410666004
【公開日】2015年2月25日 申請日期:2014年11月19日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月19日
【發(fā)明者】吳敬, 陳晟, 傅嘉懿 申請人:江南大學(xué)