一種pTerm-SC質粒及其構建方法和應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種pTerm-SC質粒及其構建方法和應用，所述的pTerm-SC質粒包括repE基因、sopA基因、sopB基因、sopC基因、ori2復制子、oriⅤ復制子、原核生物轉錄終止子以及抗生素抗性基因。本發(fā)明的pTerm-SC質粒具有拷貝數(shù)很低、容量大、穩(wěn)定性高等特點，可用于結構復雜基因、包括重復序列、不穩(wěn)定基因以及長片段基因的克隆、篩選、測序和基因組的構建等基因工程領域，對基因的高效率、高質量合成具有重要的作用。
【專利說明】一種pTerm-SC質粒及其構建方法和應用

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術及基因工程領域，具體涉及一種低拷貝、大容量、高穩(wěn)定性的 pTerm-SC質粒及其構建方法和應用。

【背景技術】
[0002] 質粒是染色質外的遺傳因子，能夠進行自主復制，是一種能獨立復制的復制子。質 粒是一種雙鏈共價閉合環(huán)形DNA分子，可自然形成超螺旋結構，不同質粒大小在2kb-300kb 之間。
[0003] 質粒雖然不是宿主生存所必需的遺傳元件，但是能夠給予宿主細胞某些特殊的性 質，例如抗藥性等。質?？梢宰鳛檩d體用于克隆外源基因，廣泛應用于基因克隆、測序及基 因合成等領域。人們一方面不斷從自然界發(fā)現(xiàn)新質粒，另一方面也不斷在已有質粒的基礎 上構建衍生質粒，作為基因工程的載體。
[0004] 所謂復制子，即是一個遺傳單位，包括DNA復制起點（ori)及其相關的調控原件。 每個質粒DNA上都含有ori，在質粒中ori是一段特定的DNA序列，長約幾百堿基對，只有 or i能被宿主細胞復制及蛋白質識別的質粒才能在該種細胞中復制，不同質粒復制控制狀 況主要與ori的序列結構相關。
[0005] 根據(jù)質粒復制的特點，質粒被分為嚴緊型和松弛型兩類。嚴緊型質粒也稱低拷貝 數(shù)質粒，每個細胞中拷貝數(shù)有限，大約一個至十幾個；松弛型質粒也稱高拷貝數(shù)質粒，其拷 貝數(shù)較多，可達幾百個。恒定的拷貝數(shù)與質粒復制控制系統(tǒng)、宿主細胞遺傳背景及生長條件 有關。尤其是高拷貝數(shù)質粒更是因其分子量小、拷貝數(shù)高、操作方便、易于大量制備等優(yōu)點 而成為實驗中的首選。
[0006] 質粒復制控制系統(tǒng)首先通過調節(jié)ori來控制拷貝數(shù)，調節(jié)因素包括阻遏蛋白、反 義RNA和某些順向重復序列等，一旦質粒上與調控有關的基因位點突變，可使拷貝數(shù)明顯 增加或減少。在質粒復制時，首先合成前RNA II即前引物，并與DNA形成雜交體；而后RNase H切割前RNA II，使之成為成熟的RNA II，并形成三葉草二級結構，該引物引導質粒的復制。 形成的RNA I可控制RNA II形成二級結構，同時Rop增強RNA I的作用，從而控制質粒的拷 貝數(shù)。削弱RNA I和RNA II之間相互作用的突變，將增加帶有pMBl或（ColEl)復制子的拷 貝數(shù)。
[0007] 松弛型質粒（高拷貝數(shù)質粒）通常帶有藍白斑篩選功能（例如PUC系列載體），這 個特點給基因克隆帶來了極大的方便。用于藍白斑篩選的載體具有一段稱為Iacz'的基 因 ，Iacz '中包括：一段β-半乳糖苷酶的啟動子序列；編碼α肽鏈的序列；一個多克隆位 點（MCS)。MCS位于編碼α肽鏈的序列中，是外源DNA的插入位點。設計適用于藍白斑篩 選的基因工程菌為β-半乳糖苷酶缺陷型菌株，這種宿主菌的染色體基因組中編碼β-半 乳糖苷酶的基因突變，造成其編碼的β -半乳糖苷酶失去正常N段一個146個氨基酸的短 肽（即α肽鏈），從而不具有生物活性，即無法作用于X-gal產(chǎn)生藍色物質。雖然上述缺陷 株基因組無法單獨編碼有活性的半乳糖苷酶，但當菌體中含有帶lacz'的質粒后，質粒 lacz'基因編碼的α肽鏈和菌株基因組表達的N端缺陷的β-半乳糖苷酶突變體互補，具 有與完整半乳糖苷酶相同的作用，能夠使X-gal生成藍色物質，這種現(xiàn)象即α-互補。 以上是攜帶空載體的菌株產(chǎn)生的表型。當外源DNA與含lacz'的載體連接時，會插入進MCS， 使α肽鏈讀碼框破壞，這種重組質粒不再表達α肽鏈，將它導入宿主缺陷菌株則無 α互 補作用，不產(chǎn)生有活性β -半乳糖苷酶，即不可分解培養(yǎng)基中的X-gal產(chǎn)生藍色，培養(yǎng)表型 呈現(xiàn)白色菌落。
[0008] 雖然帶有藍白斑篩選功能的高拷貝數(shù)質粒給基因克隆提供了極大的方便，但是其 β-半乳糖苷酶的啟動子屬于強啟動子，能夠大量啟動外源基因的轉綠、翻譯，這也導致了 某些結構復雜的基因、轉錄或翻譯產(chǎn)物對宿主有毒性的基因無法克隆。目前通常使用以下 兩種方式克隆這類"難度"基因：①選用低拷貝或單拷貝質粒作為克隆載體；②選用可以降 低質?？截悢?shù)的菌株，例如ΕΡΙ400。盡管這些方法可以成功克隆部分"難度"基因，但是仍 有很多基因無法克隆，宄其原因是因為這些載體盡管拷貝數(shù)低，但是通常還是帶有藍白斑 篩選功能，仍具有大量啟動外源基因的轉綠、翻譯的強啟動子，并且即使質粒中不帶有藍白 斑篩選功能，不具有相應的強啟動子，質粒中其它啟動子（例如抗生素抗性基因啟動子）也 可以啟動外源基因的低量轉錄、翻譯，因此，如何克服現(xiàn)有質粒載體存在的上述缺陷，提高 克隆"難度"基因的成功率是很多科研人員需要解決的首要問題。


【發(fā)明內容】

[0009] 本發(fā)明解決的問題在于提供一種能夠有效遏制外源基因的轉錄、翻譯，更為穩(wěn)定 的低拷貝書細菌致育因子（Fertility factor)衍生載體pTerm-SC質粒，并進一步公開其 構建方法及應用。
[0010] 本發(fā)明的目的將通過以下技術方案得以實現(xiàn)：
[0011] -種pTerm-SC質粒，所述質粒包括repE基因、sopA基因、sopB基因、sopC基因、 〇ri2復制子、ori V復制子、抗生素抗性基因以及原核生物轉錄終止子；所述原核生物轉錄 終止子為至少兩個不依賴P因子的原核生物轉錄終止子；所述原核生物轉錄終止子設置 于多克隆位點的兩端。
[0012] 優(yōu)選的，所述抗生素抗性基因為編碼氯霉素乙酰轉移酶的Cm基因。
[0013] 優(yōu)選的，所述質粒的拷貝數(shù)為7-10個。
[0014] 優(yōu)選的，所述質粒具有如SEQ ID NO. 5所示的氨基酸序列，所述質粒中，自5'端 第 4366bp_5540bp 為 sopA 基因，5541bp_6512bp 為 sopB 基因，6608bp_7062bp 為 sopC 基 因，542bp-1201bp 為 Cm 基因，2438bp-3193bp 為 r印E 基因，1573bp-2079bp 為 ori V 復 制子，2135bp-2344bp為ori2復制子，lbp-412bp及3608bp-4201bp為轉錄終止子區(qū)域， 3915bp-3956bp為多克隆位點。
[0015] -種構建pTerm-SC質粒的方法，包括以下步驟：
[0016] 步驟一：分別設計并人工合成具有SEQ ID NO. 1所示序列結構的SopA-SopB基因 片段、具有SEQ ID NO. 2所示序列結構的SopC-原核生物轉錄終止子基因片段、具有SEQ ID NO. 3所示序列結構的Cm-ori V _ori2基因片段以及具有SEQ ID NO. 4所示序列結構的 r印E-原核生物轉錄終止子基因片段；
[0017] 步驟二：運用多段重組法將所述SopA-SopB基因片段、SopC-原核生物轉錄終止子 基因片段、Cm-ori V _ori2基因片段、r印E-原核生物轉錄終止子基因片段連接環(huán)化，最終 得到環(huán)形的質粒。
[0018] 優(yōu)選的，所述SopA-SopB基因片段、SopC-原核生物轉錄終止子基因片段、 Cm-ori V _ori2基因片段、repE-原核生物轉錄終止子基因片段之間具有30bp的重疊互補 區(qū)。
[0019] 優(yōu)選的，所述多段重組法為Gibson重組方法，按1:1:1:1的摩爾比取所述 SopA-SopB基因片段、SopC-原核生物轉錄終止子基因片段、Cm-ori V _ori2基因片段、 repE-原核生物轉錄終止子基因片段，加入滅菌去離子水及Gibson Assembly Master Mix 試劑，50°C下反應至得到環(huán)形質粒。
[0020] 上述所述方法構建得到的pTerm-SC質粒。
[0021] 所述pTerm-SC質粒在基因克隆、篩選和測序領域中的應用。
[0022] 優(yōu)選的，所述pTerm-SC質粒在結構復雜、含有重復序列以及不穩(wěn)定序列基因的克 隆、篩選和測序中的應用。
[0023] 優(yōu)選的，所述pTerm-SC質粒在長片段基因的克隆、篩選、測序和基因組合成中的 應用。
[0024] 本發(fā)明利用人工合成的方法，合成一種低拷貝pTerm-SC質粒，主要技術手段是刪 除眾多克隆質粒所具有的藍白斑篩選基因及相應的強啟動子，并且在多克隆位點兩端添加 了多個防止外源DNA序列從上游質粒啟動子過多轉錄的原核生物轉錄終止子，即不依賴P 因子的原核生物轉錄終止子，因此能夠有效遏制外源基因的轉錄、翻譯，從而使該質粒能夠 克隆高拷貝、低拷貝、單拷貝載體所不能克隆的基因及對宿主細胞有毒害的基因。該質粒轉 化可誘導表達TrfA菌株后，在誘導劑，如阿拉伯糖，存在的情況下，TrfA可激活ori V復制 起點，并使質?？截悢?shù)由每個細胞1-10拷貝提高到每個細胞30-50拷貝從而提高質粒抽提 量。
[0025] 本發(fā)明所述pTerm-SC質?？梢钥寺?. lkb-150kb的基因片段，容量較大：并且 具有可供轉化子選擇的標記抗生素抗性基因；同時具有兩個大腸桿菌復制子，在不能表達 trfA的菌株中以低拷貝形式復制以提高質粒的穩(wěn)定性；在能夠表達trfA的菌株中ori V 可以啟動質粒的高拷貝復制，方便后續(xù)質粒制備等實驗操作；所述質粒在沒有選擇壓力的 情況下，連續(xù)培養(yǎng)120代，質粒的保持率均為100%，具有較高的穩(wěn)定性，且能夠克隆高拷 貝、低拷貝、單拷貝載體所不能克隆的外源基因。
[0026] 本發(fā)明的pTerm-SC質粒具有拷貝數(shù)很低、容量大、穩(wěn)定性高等特點，可用于結構 復雜基因、包括重復序列、不穩(wěn)定基因以及長片段基因的克隆、篩選、測序和基因組的構建 等基因工程領域，對基因的高效率、高質量合成具有重要的作用。利用PTerm-SC質粒已經(jīng) 成功構建出約72kb的Ostreococcus tauri葉綠體基因組片段。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0027] 為了使本發(fā)明的內容更容易被清楚的理解，下面根據(jù)本發(fā)明的具體實施例并結合 附圖，對本發(fā)明作進一步詳細的說明，其中
[0028] 圖1為pTerm-SC質粒的物理圖譜；
[0029] 圖2為pTerm-SC質粒構建流程模式圖；
[0030] 圖3為PTerm-SC載體構建肺炎鏈球菌DNA序列重組質粒的酶切驗證圖，其中I 為重組質粒對照；2為重組質粒用限制性內切酶Xho I和Mlu I酶切結果；3為IKB DNA Marker ；
[0031] 圖4為Ostreococcus tauri葉綠體基因組重組質粒的酶切驗證圖，其中1為重組 質粒對照，2為重組質粒用限制性內切酶Not I和Asc I的酶切結果，3為IKB DNA Marker。

【具體實施方式】
[0032] 實施例1 :質粒pTerm-SC的構建
[0033] 質粒pTerm-SC的結構如圖1所示，其構建流程模式圖如圖2所示，具體方法如下：
[0034] 1.設計并合成SopA-SopB基因，基因序列如序列表中的序列1所示，序列全長 2250bp，其中 66-1240bp 為 SopA 基因，編碼 SopA 蛋白，1241-2212bp 為 SopB 基因，編碼 SopB 蛋白；
[0035] 2.設計并合成SopC-Terminator基因，基因序列如序列表中的序列2所示，序列 全長1266bp，其中序列88-542bp為SopC順式作用區(qū)域，797-1208bp為原核生物轉錄終止 子；
[0036] 3.設計并合成Cm-ori V _ori2基因，基因序列如序列表中的序列3所示，序列 全長1960bp，其中102-761為氯霉素抗性基因，編碼氯霉素乙酰轉移酶，1133-1639bp為 ori V復制子基因，1695_1904bp為ori2復制子基因；
[0037] 4.設計并合成repE-Terminator基因，基因序列如序列表中的序列4所示，序列全 長1960bp，其中68-823bp為r印E基因，編碼r印E蛋白，1238-1831bp為原核生物轉錄終止 子；
[0038] 5.分別合成以上四個基因片段，由于四個片段之間具有30bp重疊互補區(qū)，因此使 用Gibson Assembly? Master Mix(NEB)試劑盒將它們組裝起來最終得到環(huán)形的質粒，記 為pTerm-SC，其測序序列如SEQ ID No. 5所示。
[0039] Gibson Assembly? Master Mix反應體系及條件：四個基因片段各1 μ 1，滅菌去 離子水 6 μ 1，Gibson Assembly? Master Mix :10 μ 1，5(TC反應 1 小時。
[0040] 測序結果表明構建出的質粒與預期相符，質粒的長度為7316bp。質粒中主 要元件的位置分別是：sopA 基因，4366bp_5541bp ;sopB 基因，5541bp_6512bp ;sopC 基 因，6608bp-7062bp ;Cm 基因，542bp-1201bp ;r印E 基因，2438bp-3193bp ;ori V 復制子， 1573bp-2079bp ;ori2復制子，2135bp-2344bp ;原核生物轉錄終止子區(qū)域，lbp-412bp及 3608bp-4201bp ;其中多克隆位點在 3915bp-3956bp 處。
[0041] 實施例2 :質粒pTerm-SC穩(wěn)定性檢測
[0042] 將質粒pTerm-SC轉化到大腸桿菌T0P10P感受態(tài)細胞中，挑取單克隆菌落在含 有氯霉素抗生素（25-50 μ g/μ 1)的LB培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，之后對培養(yǎng)的菌液在含有氯霉 素抗生素（25-50 μ g/μ 1)的平板上劃線培養(yǎng)，對劃線得到的單克隆重新在含有氯霉素抗 生素（25-50 μ g/μ 1)的平板上再進行一次劃線培養(yǎng)，由此得到純的陽性轉化克隆。
[0043] 將得到的純的陽性轉化克隆接種到不含有抗生素的LB培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)20 代（約7h)后，從中取100 μ 1接種至新的不含有抗生素的培養(yǎng)基LB中，37°C繼續(xù)培養(yǎng)20 代，如此重復6次。最后分別得到40代、60代、80代、100代和120代的細菌，取上述各代 菌液100 μ 1，稀釋100倍后分別接種至不含有抗生素的LB平板上和含有氯霉素抗生素 (25-50 μ g/ μ 1)的LB平板上，37 °C培養(yǎng)過夜。
[0044] 無抗生素條件下質粒的保持率=含有氯霉素抗生素（25-50 μ g/ μ 1)的LB平板上 的存活菌落數(shù)/不含有抗生素的LB平板上的存活菌落數(shù)。
[0045] 在沒有選擇壓力的情況下，連續(xù)培養(yǎng)120代，質粒pTerm-SC的保持率為100%。表 明合成的PTerm-SC具有較強的穩(wěn)定性，適用于作為基因工程的克隆載體。
[0046] 實施例3 :質粒pTerm-SC拷貝數(shù)檢測
[0047] 分別轉化pUC57和pTerm-SC質粒到大腸桿菌TOPlOP感受態(tài)細胞中，分別挑 取四個單克隆菌落到4ml LB培養(yǎng)基中，37°C 200rpm過夜培養(yǎng)12小時，第二天提取質粒， 最終質粒溶解到50 μ 1滅菌TE中，測質粒的濃度得到pUC57的濃度分別是：396ng/ μ 1、 377ng/ μ l、385ng/ μ l、397ng/ μ 1，pTerm-SC 質粒的濃度分別是：14. Ong/ μ 1、14· 5ng/ μ 1、13. 9ng/ μ 1、16. 9ng/ μ 1，根據(jù)所測質粒濃度計算pUC57和pTerm-SC的摩爾濃度。
[0048] 腺嘌呤（A)、鳥嘌呤（G)、胞嘧啶（C)、胸腺嘧啶（T)分子量分別為313. 2、304· 2、 329. 2、289. 2(g/mol)，則：
[0049] pUC57 的分子量=313. 2g/mol X672+304. 2g/mol X691+329. 2g/ mol X 683+289. 2g/molX664 = 837545g/mol ；
[0050] pTerm-SC 的分子量=313. 2g/molX1788+304. 2g/molX 1820+329. 2g/ mol X 1742+289. 2g/molX1966 = 2255679g/mol ；
[0051] 檢測得到質粒pUC57的平均濃度=388. 75ng/ μ I，pTerm-SC的平均濃度= 14.825ng/μ I ;
[0052] 質粒 pUC57 的摩爾濃度=388. 75ng/ μ l + 837545g/mol = 4· 6415416485E-7mol/ L ；
[0053] 質粒 pTerm-SC 的摩爾濃度=14. 825ng/ μ I+ 2255679g/mol = 6.5723004026E-9mol/L ；
[0054] pUC57為高拷貝質粒，每個細胞中質粒的拷貝數(shù)為500個-700個，由此可以計算出 質粒pTerm-SC的拷貝數(shù)=pTerm-SC的摩爾濃度X (500-700) +pUC57的摩爾濃度；
[0055] pTerm-SC 的拷貝數(shù)=6· 5723004026E-9X (500-700)+4. 6415416485E-7 = 7-10 (個）；S卩質粒pTerm-SC的拷貝數(shù)為7個-10個，為低拷貝質粒。
[0056] 實施例4 :利用質粒pTerm-SC構建肺炎鏈球菌DNA序列
[0057] 肺炎鏈球菌于1881年首次由巴斯德（Louis Pasteur)及G. M. Sternberg分別在 法國及美國從患者痰液中分離出，為革蘭氏陽性菌，菌體似矛頭狀，成雙或成短鏈狀排列的 雙球菌。有毒株菌體外有化學成分為多糖的莢膜，5%-10%正常人上呼吸道中攜帶此菌，有 毒株是引起人類疾病的重要病原菌。肺炎鏈球菌主要的致病物質是肺炎鏈球菌溶血素及莢 膜，莢膜具有抗原性，是肺炎鏈球菌分型的依據(jù)，此菌可引起大葉性肺炎、腦膜炎、支氣管炎 等疾病。
[0058] 將 15337bp 的肺炎鏈球菌 DNA 序列（GenBank 登錄號：CR931658 ;Range : 7959-23295)分成首尾重疊互補的4個約4kb的DNA片段，標記為4kb-l，4kb-2,4kb-3， 4kb-4,再根據(jù)這4個DNA片段設計寡核苷酸鏈，使用PCR方法分別將寡核苷酸鏈拼接獲得 這4個DNA片段；
[0059] 分別以 pUC57、pCA 為模板，F(xiàn)-pUC57/pCA、R-pUC57/pCA 為引物，通過 PCR 使 pUC57、 pCA載體帶有肺炎鏈球菌DNA序列兩端的同源序列及Kpn I、Mlu I酶切位點，PCR產(chǎn)物通 過膠回收純化。
[0060] F-pUC57/pCA ：AAGAGTAAAATTGAACGTATTTGATGGACGCGTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCT CA ；
[0061] R-pUC57/pCA ：GGTACTTGATATTTCTTGGTATGAACACGGTACCGTCGTGACTGGGAAAACCCTGG CGo
[0062] 以 pTerm-SC 為模板，F(xiàn)-pTerm-SC、R-pTerm-SC 為引物，通過 PCR 使 pTerm-SC 載體 帶有肺炎鏈球菌DNA序列兩端的同源序列及Kpn I、Mlu I酶切位點，PCR產(chǎn)物通過膠回收 純化。
[0063] F-pTerm-SC ：
[0064] AAGAGTAAAATTGAACGTATTTGATGGACGCGTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCGC ；
[0065] R-pTerm-SC ：
[0066] GGTACTTGATATTTCTTGGTATGAACACGGTACCGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGGCo
[0067] 使用 Gibson Assembly? Master Mix (NEB)試劑盒將 4kb_l，4kb_2,4kb_3， 4kb-4,與膠回收純化的pUC57、pCA以及pTerm-SC載體分別進行組裝。
[0068] Gibson Assembly? Master Mix 反應體系及條件：四個 DNA 片段及 pUC57(pCA 或 pTerm-SC)各 1 μ 1，滅菌去離子水 5 μ 1，Gibson Assembly? Master Mix : 10 μ 1，50°C 反應I小時。
[0069] 將5 μ 1反應產(chǎn)物轉化TOPlOF '大腸桿菌感受態(tài)細胞，第二天早上各挑選24個單 克隆進行菌檢PCR，結果顯示使用pTerm-SC載體的克隆菌檢陽性率為100%，而使用pUC57、 PCA載體的克隆菌檢陽性率為0。將使用pTerm-SC載體菌檢到的陽性克隆搖菌并抽質粒然 后進行酶切驗證，酶切驗證圖如圖3所示，其中1為肺炎鏈球菌DNA重組質粒對照；2為重組 質粒用限制性內切酶Xho I和Mlu I的酶切結果，條帶大小和理論值（1712bp、4946bp)相 符；3為IKB DNA Marker，此圖說明肺炎鏈球菌DNA序列已經(jīng)成功克隆進pTerm-SC載體，將 酶切正確質粒進行測序驗證，測序結果顯示序列完全正確。實驗結果表明pTerm-SC可以用 于克隆PUC57高拷貝類型載體及pC系列低拷貝類型載體無法克隆的不穩(wěn)定序列。
[0070] 實施例5 :利用質粒pTerm-SC構建Ostreococcus tauri葉綠體基因組
[0071] Ostreococcus tauri是世界上最小的能夠自由生活的真核細胞，也是地球上的 一種很古老的生物，可以追溯到15億年前。Ostreococcus tauri能進行光合作用，幫助 碳循環(huán)，是海洋里的光合作用能手，其通過光合作用產(chǎn)生的生物量要比藍藻多。因此對 Ostreococcus tauri葉綠體基因組的研宄能夠為生物體進行光合作用所需的最小基因 組尺寸提供重要線索，而通過人工合成該基因組無疑能夠為該項研宄提供有力手段。本 實施例對Ostreococcus tauri葉綠體基因組的構建參考文獻《J. Progress in Modern Biomedicine. 13, 6204-6209 (LIU Wei-qiang，et al. (2013)·)中的方法。
[0072] Ostreococcus tauri 葉綠體基因組全長 71666bp (GenBank 登錄號： CR954199)，經(jīng)過分析我們將該基因組分成首尾重疊互補的12個約6kb的DNA片段， 標記為 genome-6kb_l， genome-6kb_2， genome-6kb_3， genome-6kb_4， genome-6kb_5， genome-6kb_6， genome-6kb_7， genome-6kb_8， genome-6kb_9， genome-6kb_10， genome-6kb_ll，genome-6kb_12。根據(jù)這12個DNA片段設計寡核苷酸鏈，使用電化學DNA 芯片合成儀合成了 564條150bp的Oligo Mix，并成功擴增分離了其中96%的Oligo序列， 剩下的基因組序列是通過傳統(tǒng)的固相亞磷酰胺三脂合成法進行合成。首先將得到的150bp Oligo通過PCR拼接的方法得到正確的I. 5kb序列，再將4個I. 5kb片段拼接得到6kb序 列，分別為 genome-6kb_l，genome-6kb_2，genome-6kb_3，genome-6kb_4，genome-6kb_5， genome-6kb_6， genome-6kb_7， genome-6kb_8， genome-6kb_9， genome-6kb_10， genome-6kb_ll，genome-6kb_12，然后使用 Gibson Assembly? Master Mix(NEB)試劑 盒將 genome-6kb_l，genome-6kb_2，genome-6kb_3，genome-6kb_4 與 pTerm_SC(BamH I、 Hind III酶切后膠回收）組裝得到環(huán)形質粒genome-24kb-l-pTerm_SC，將genome-6kb_5， genome-6kb_6，genome-6kb_7，genome-6kb_8 與 pTerm_SC(BamH I、Hind III酶切后膠回 收）組裝得到環(huán)形質粒 genome-24kb-2-pTerm_SC，將 genome-6kb_9，genome-6kb_10， genome-6kb_ll，genome-6kb_12 與 pTerm_SC(BamH I、Hind III 酶切后膠回收）組裝 得到環(huán)形質粒 genome-24kb-3-pTerm_SC，最后將 genome-24kb_l， genome-24kb_2， genome-24kb-3，pTerm-SC(BamH I、Hind III酶切后膠回收）用 Gibson Assembly? Master Mix(NEB)組裝得到完整的 Ostreococcus tauri 葉綠體基因組 genome-72kb-pTerm_SC。將 質粒genome-72kb-pTerm_SC用Not I和Asc I酶切，酶切驗證圖如圖4所示，其中1為重組 質粒對照，2為重組質粒用限制性內切酶Not I和Asc I的酶切結果，3為IKB DNA Marker， 此圖說明Ostreococcus tauri葉綠體基因組已經(jīng)成功克隆進pTerm-SC載體，將酶切正確 質粒進彳丁測序驗證，測序結果顯不序列完全正確。
[0073] 將重組質粒用Not I和Asc I酶切并酚氯仿異丙醇純化基因片段，再分別以 pUC57、pCA、pTerm-HK、pTerm-LK、pCCl (EPICENTRE 公司單拷貝載體）質粒為模板，通過 PCR 使各個載體帶有肺炎鏈球菌DNA序列兩端的同源序列及Kpn I、Mlu I酶切位點，PCR產(chǎn)物 通過膠回收純化，然后將純化的基因片段與帶有同源臂的pUC57、pCA、pTerm-HK、pTerm-LK、 pCCl 載體用 Gibson Assembly? Master Mix(NEB)進行組裝。
[0074] Gibson Assembly? Master Mix 反應體系及條件：基因片段 9 μ l，pUC57(pCA 或 pTerm-HK 或 pTerm-LK 或 pCCl) 1 μ l，Gibson Assembly? Master Mix :10 μ 1，5CTC反應 I 小時。
[0075] 取5 μ I反應產(chǎn)物轉化TOPlOF ^大腸桿菌感受態(tài)細胞，第二天早上各挑選24個單 克隆進行菌檢PCR，結果所有載體的克隆菌檢陽性率為0,這些實驗結果表明pTerm-SC載體 能夠用于克隆高拷貝、低拷貝、單拷貝載體所不能克隆的外源基因。
[0076] 顯然，上述實施例僅僅是為清楚地說明所作的舉例，而并非對實施方式的限定。對 于所屬領域的普通技術人員來說，在上述說明的基礎上還可以做出其它不同形式的變化或 變動。這里無需也無法對所有的實施方式予以窮舉。而由此所引伸出的顯而易見的變化或 變動仍處于本發(fā)明的保護范圍之中。
【權利要求】
1?一種pTerm-SC質粒，其特征在于，所述質粒包括repE基因、sopA基因、sopB基因、 sopC基因、ori2復制子、ori V復制子、抗生素抗性基因以及原核生物轉錄終止子；所述原 核生物轉錄終止子為至少兩個不依賴P因子的原核生物轉錄終止子；所述原核生物轉錄 終止子設置于多克隆位點的兩端。
2. 根據(jù)權利要求1所述的pTerm-SC質粒，其特征在于，所述抗生素抗性基因為編碼氯 霉素乙酰轉移酶的Cm基因。
3. 根據(jù)權利要求1或2所述的一種pTerm-SC質粒，其特征在于，所述質粒的拷貝數(shù)為 7-10 個。
4. 根據(jù)權利要求1-3任一所述的pTerm-SC質粒，其特征在于，所述質粒具有如SEQ ID NO. 5所示的DNA序列，所述質粒中，自5'端第4366bp-5540bp為sopA基因，5541bp-6512bp 為 sopB 基因，6608bp-7062bp 為 sopC 基因，542bp-1201bp 為 Cm 基因，2438bp-3193bp 為 repE 基因，1573bp_2079bp 為 ori V 復制子，2135bp_2344bp 為 ori2 復制子，lbp_412bp 及 3608bp-4201bp為轉錄終止子區(qū)域，3915bp-3956bp為多克隆位點。
5. -種構建權利要求1-4任一所述的pTerm-SC質粒的方法，其特征在于，包括以下步 驟： 步驟一：分別設計并人工合成具有SEQ ID NO. 1所示序列結構的SopA-SopB基因片段、 具有SEQ ID NO. 2所示序列結構的SopC-原核生物轉錄終止子基因片段、具有SEQ ID NO. 3 所示序列結構的Cm-〇riV_ori2基因片段以及具有SEQ ID NO. 4所示序列結構的repE-原 核生物轉錄終止子基因片段； 步驟二：運用多段重組法將所述SopA-SopB基因片段、SopC-原核生物轉錄終止子基因 片段、Cm-ori V _ori2基因片段、r印E-原核生物轉錄終止子基因片段連接環(huán)化，最終得到 環(huán)形的質粒。
6. 根據(jù)權利要求5所述的構建方法，其特征在于，所述SopA-SopB基因片段、SopC-原 核生物轉錄終止子基因片段、Cm-ori V _ori2基因片段、r印E-原核生物轉錄終止子基因片 段之間具有30bp的重疊互補區(qū)。
7. 根據(jù)權利要求5或6所述的構建方法，其特征在于，所述多段重組法為Gibson重組 方法，按1:1:1:1的摩爾比取所述SopA-SopB基因片段、SopC-原核生物轉錄終止子基因片 段、Cm-ori V _ori2基因片段、r印E-原核生物轉錄終止子基因片段，加入滅菌去離子水及 Gibson Assembly Master Mix試劑，50°C下反應至得到環(huán)形質粒。
8. 根據(jù)權利要求5-7任一所述方法構建得到的pTerm-SC質粒。
9. 權利要求1-4任一或8所述pTerm-SC質粒在基因克隆、篩選和測序領域中的應用。
【文檔編號】C12Q1/68GK104480130SQ201410669218
【公開日】2015年4月1日 申請日期:2014年11月20日 優(yōu)先權日:2014年11月20日
【發(fā)明者】薛高旭, 馮愛華, 孫中平, 廖國娟 申請人:蘇州金唯智生物科技有限公司