艱難梭菌二元毒素的lamp檢測方法及其專用引物與試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種艱難梭菌二元毒素的LAMP檢測方法及其專用引物與試劑盒。本發(fā)明是根據(jù)艱難梭菌特異性保守基因cdtA和cdtB設計引物，然后以待測物的基因組DNA為模板，在獲得引物的引導下進行LAMP擴增，再通過反應液的顏色變化或反應液濁度變化來快速定性檢測待測樣品是否攜帶艱難梭菌二元毒素；本發(fā)明可實現(xiàn)單獨或同時檢測艱難梭菌cdtA或/和cdtB，不需要復雜儀器即可在等溫條件下快速、方便、同步、高效、高特異、高靈敏地檢測，可為艱難梭菌二元毒素的檢測及毒素分型提供新的技術平臺，指導臨床診療及預防艱難梭菌高毒力菌株的暴發(fā)性流行，用于基層醫(yī)療衛(wèi)生單位和各疾病預防控制中心篩查和檢測艱難梭菌二元毒素，具有廣闊的市場前景和較大的經(jīng)濟、社會效益。
【專利說明】艱難梭菌二元毒素的LAMP檢測方法及其專用引物與試劑 合 Sl

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種艱難梭菌二元毒素的LAMP檢測方法及其專用引物與試劑盒，屬 于生物【技術領域】中細菌的分子生物學檢測方法【技術領域】。

【背景技術】
[0002] 艱難梭菌（Clostridium difficile, Cd)為革蘭陽性厭氧芽孢桿菌，廣泛分布于 水、土壤等自然環(huán)境及動物和人的糞便中。艱難梭菌是一種條件致病菌，本身沒有侵襲性， 當人體腸道正常微環(huán)境遭到破壞時，部分產(chǎn)毒細菌通過分泌毒素 A、毒素 B以及二元毒素引 起抗生素相關性腹瀉、結腸炎甚至致死性偽膜性腸炎，統(tǒng)稱為艱難梭菌感染（Clostridium difficile infection, CDI)〇
[0003] 艱難梭菌可分為產(chǎn)毒株和不產(chǎn)毒株，不產(chǎn)毒株不引起臨床癥狀。艱難梭菌產(chǎn)毒株 的產(chǎn)毒因子主要包括毒素 A和毒素 B,由tcdA和tcdB編碼,而tcdA和tcdB受負向調節(jié)基 因 tcdC、正向調節(jié)基因 tcdD以及膜孔蛋白基因 tcdE調節(jié)，以上基因共同構成了致病決定 區(qū)。毒素 A又稱腸毒素，易導致回腸腸壁中性粒細胞浸潤，釋放淋巴因子，引起液體大量分 泌和出血性壞死；毒素 B又稱細胞毒素，能使肌動蛋白解聚，損壞細胞骨架，導致細胞固縮 壞死，直接損傷腸壁細胞。tcdC基因的多態(tài)性或部分堿基缺失可導致毒素 A、B產(chǎn)生增加。 此外，在北美洲和歐洲引起廣泛暴發(fā)流行的027型艱難梭菌可以產(chǎn)生更強的毒素，即二元 毒素 （binary toxin，⑶T)。⑶T由⑶T a和⑶T b這兩種獨立蛋白鏈組成，由致病性決定 區(qū)外的2個染色體基因 cdt A基因和cdt B基因編碼。cdtA是一種ADP核糖轉移酶，可阻 斷肌動蛋白片段的合成而誘導細胞死亡，cdtB是一種運輸?shù)鞍祝唤z氨酸蛋白酶激活后， cdtB通過與宿主細胞結合，把cdtA轉移至細胞液中，誘導細胞骨架解聚，生成微管突出物， 增強艱難梭菌的定植。
[0004] 據(jù)美國疾病預防控制中心報道，艱難梭菌共有150個PCR核酸型和24個毒素型， 而毒力較強的菌株是027/B1/NAP1 (核酸電泳分型為027,限制性內切酶分型為BI，脈沖場 凝膠電泳分型為NAP1)，它產(chǎn)生毒素 A、毒素 B和⑶T。該型tcdC基因存在18個堿基的缺失， 導致毒力增強和毒素的增加，產(chǎn)生的毒素 A和毒素 B分別是傳統(tǒng)毒株的16倍和23倍，特別 該毒素 III型的出現(xiàn)及暴發(fā)性流行，導致該病的嚴重病例數(shù)、復發(fā)率和病死率均明顯增高，耐 藥菌株也在增多。在荷蘭分離出艱難梭菌菌株〇78/BK/NAP7,8 (核酸電泳分型為078,限制 性內切酶分型為BK，脈沖場凝膠電泳分型為NAP7,8)，該菌株也產(chǎn)生毒素 A、毒素 B和CDT， 該型tcdC基因有39bp缺失，并含第184位點突變，導致終止密碼子提前產(chǎn)生。有證據(jù)表明， 近年來艱難梭菌078型感染率逐年遞增，人類和動物之間艱難梭菌078型基因序列高度一 致，這意味著人和動物之間艱難梭菌078可能不存在種族壁壘，更有利于艱難梭菌078型的 傳播。此外，除了艱難梭菌023、045、130、122、267型等菌株含有^1'，^1'還廣泛存在于產(chǎn) 氣莢膜梭菌E、螺旋形梭狀芽胞桿菌、肉毒梭菌等梭菌中。
[0005] 2000年至2003年，027/B1/NAP1型艱難梭菌在美國7個州8所醫(yī)院暴發(fā)性流行。 2009年艱難梭菌027型已在全美國流行，在芝加哥分離率為61%。2008年抽取歐洲34個 國家106所醫(yī)院進行CDI流行病學調查研究后發(fā)現(xiàn)，雖然歐洲各國CDI流行情況不一致，但 總體呈增加趨勢是比較肯定的（〇.(Γ36. 3,平均4. 1/10000病人日）。日本、韓國、臺灣、科威 特等國家和地區(qū)的研究也支持CDI增加的結論。雖然各地報道的CDI發(fā)病率不一致，總的 來說，加拿大醫(yī)院感染監(jiān)測中心估計，世界范圍內的成人⑶I發(fā)病率呈增加趨勢（4. 6/1000 個入院患者，或者65/100000病人日）。隨著⑶I暴發(fā)頻率增多、發(fā)病率增高、危害性變強， 國民經(jīng)濟負擔也隨之加重。據(jù) Ghantoji 等（Ghantoji SS，Sail K，Lairson DR et al. Economic healthcare costs of Clostridium difficile infection: a systematic review. JHosp Infect 2010; 74:309 - 318.)的系統(tǒng)回顧分析，2010年美國用于控制CDI 的費用是43. 3千萬-79. 7千萬/年。相繼在歐洲和北美多次暴發(fā)和流行，中國艱難梭菌產(chǎn) 毒株分離率達66. 7%，近年在香港和廣州有027型艱難梭菌的報道 (Wang P, Zhou, Y et al. Identification of Clostridium difficile ribotype 027 for the first time in Mainland China. Infect Control Hosp Epidemiol, 2014, 35(1): 95-98)，這意味著高毒力027型菌株有可能在中國暴發(fā)性流行。目前鑒于其暴發(fā)頻 率、感染人數(shù)、危害性、國民的經(jīng)濟負擔，迫切需要對艱難梭菌二元毒素進行有效的診斷和 控制。
[0006] 艱難梭菌二元毒素診斷的有效性依賴于檢測方法的可靠性，目前國際流行的診斷 方法包括脈沖電場凝膠電泳（PFGE)、限制性核酸內切酶分析（REA)、核酸檢測(普通PCR和 多重實時PCR)，尚無統(tǒng)一的診斷"金標準"。脈沖電場凝膠電泳（PFGE)是根據(jù)不同大小的 DNA片段在一定大小孔徑的瓊脂糖凝膠中，由于電場的不斷變化而改變其泳動方向的時間 不同而將其分離。這種技術已被用于細菌和真菌的分型，顯示出較好的鑒別力和重復性。不 足之處：分型時間長、電泳條件復雜、需特殊的儀器和價格較高的試劑。限制性核酸內切酶 分析（REA)是用高頻裂解限制性核酸內切酶切割后，改變其片段的長度和數(shù)目，用常規(guī)凝膠 電泳和溴乙啶染色，在紫外光下攝影可得不同圖譜，根據(jù)流行病相關的菌株會產(chǎn)生相同或 相似圖譜的原理，用于細菌的分型。不足之處：DNA圖譜條帶太多，難以分辨，容易污染。目 前國內最常用普通PCR和多重實時PCR檢測艱難梭菌中的二元毒素，但因實驗設備要求高、 操作復雜、速度慢，擴增完成后，需要對產(chǎn)物進行電泳、顯影等一些繁瑣步驟，不適合基層醫(yī) 院及現(xiàn)場快速檢測的應用。因此，尋找快速、特異、敏感檢測艱難梭菌中的二元毒素有助于 及早篩選強毒力菌株，指導臨床診療。
[0007] 隨著分子診斷技術的不斷進步，T. Notomi (Notomi T，Okayama H，MasubuchiH, et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res 2000; 28(12): 63.)發(fā)明的一種新型核酸擴增技術一環(huán)介導恒溫擴增技術（LAMP)，該技術針對 靶基因的6個區(qū)域設計4條特異引物，在恒溫（63飛7°C)的條件下，利用高活性鏈置換DNA 聚合酶（Bst DNA聚合酶)，使得鏈置換DNA合成在不停地自我循環(huán)，大量合成目標DNA的 同時伴隨有副產(chǎn)物一白色的焦磷酸鎂沉淀產(chǎn)生，從而實現(xiàn)對目的基因的快速檢測。該方法 檢測時間短（3(T60min)，無需特殊儀器，操作簡便，配合相應顯色試劑還能實現(xiàn)肉眼判別結 果。LAMP方法目前已經(jīng)成功應用于細菌、病毒及寄生蟲的定性和定量檢測、胎兒性別鑒定和 其他方面，成為常用的臨床快速檢驗方法之一。但是迄今為止，市場上還未見用于檢測艱難 梭菌二元毒素的LAMP專用引物與試劑盒問世。


【發(fā)明內容】

[0008] 本發(fā)明的目的是提供一種艱難梭菌二元毒素的LAMP檢測方法以及一種特異性和 靈敏度較高的、用于上述檢測艱難梭菌二元毒素的LAMP檢測方法的專用引物。
[0009] 本發(fā)明的目的還在于提供一種用于檢測艱難梭菌二元毒素的LAMP試劑盒。
[0010] 本發(fā)明的技術方案如下：一種艱難梭菌二元毒素的LAMP檢測方法，包括如下步 驟： (1) 引物的設計：分別對艱難梭菌cdtA和cdtB重復序列通過BLAST軟件進行同源性分 析獲得艱難梭菌特異保守序列，再根據(jù)艱難梭菌特異保守DNA序列，用軟件Primer design V4設計分別得到用于對艱難梭菌cdtA和cdtB進行LAMP檢測的引物； (2) LAMP擴增：以待測物的基因組DNA為模板，在上述引物的引導下進行LAMP擴增；所 述待測物為人及動物的糞便或培養(yǎng)分離的菌株； (3) 擴增反應結束后進行結果判定：擴增反應前，事先在反應液中添加鈣黃綠素指示 齊U，根據(jù)反應后反應液的顏色變化判斷結果，反應液的顏色變綠色表示待測物樣品中存在 艱難梭菌二元毒素，反應液的顏色變橙色表示待測樣品中不存在艱難梭菌二元毒素；或者 不添加鈣黃綠素指示劑直接用濁度儀檢測反應前后反應液的濁度變化來判斷結果，反應液 濁度上升表示待測物樣品中存在艱難梭菌二元毒素，反應液濁度無變化表示待測樣品中不 存在艱難梭菌二元毒素。
[0011] 經(jīng)上述檢測艱難梭菌二元毒素的LAMP檢測方法步驟（1)設計優(yōu)化獲得用于對艱 難梭菌cdtA和cdtB進行LAMP檢測的專用引物如下： (1) 用于對艱難梭菌cdtA進行LAMP檢測的cdtA引物為以下三組引物對混合的引物 組合，第一組引物對：引物I (F3)與引物2 (B3);第二組引物對：引物3 (FIP)與引物4 (BIP);第三組引物對：引物5 (LF)與引物6 (LB);所述各引物序列如下： F3 ：TCTGGTCCTCAAGAATTTGG B3 ：AATAGCTGATAGATAAGCTCCA FIP ：GCTTGTCCTTCCCATTTTGATTTAATTTTTAACTCTTACTTCCCCTGA BIP ：ATTGGTAGTGTGAATATGAGTGCATTACCTTTAGGTATAGTTATACGTAGT LF ：AAATCATATTCAGGGGAA LB ：TTTGCTAAAAGAAAAATAGTACTAC 所述〇社4引物中三組引物對^1?和81?):(1^和1^):斤3和83)的摩爾比為8 :4:1; (2) 用于對艱難梭菌cdtB進行LAMP檢測的cdtB引物為以下兩組引物對混合的引物 組合，第一組引物對：引物I (F3)與引物2 (B3);第二組引物對：引物3 (FIP)與引物4 (BIP);所述各引物序列如下： F3 ：GAGTCAAATACTGCTGGAGA B3 ：TAGTAGCTCTGGAAACAGTT FIP ：CGGATCTCTTGCTTCAGTCTTTTTTCAGATTATGAAAAAGCTTCAGGTT BIP ：AGTTGCAGCATATCCAATTGTTGGTTTCCTTGATCAGTAGAGGCATG 所述cdtB引物中兩組引物對（FIP和BIP): (F3和B3)的摩爾比為8: 1。
[0012] 采用本發(fā)明的檢測方法，以上述專用引物進行LAMP擴增反應條件可為：檢測cdtA 時，擴增反應在57-64°C下恒溫90min ;檢測cdtB時，擴增反應在57-68°C下恒溫90min。
[0013] 優(yōu)選的，以上述專用引物進行LAMP擴增反應條件為：檢測cdtA時，擴增反應在 60°C下恒溫90min ;檢測cdtB時，擴增反應在63°C下恒溫90min ;若同時檢測艱難梭菌cdtA 和cdtB，擴增反應條件為：61°C恒溫90min。
[0014] 本發(fā)明的檢測方法中所述鈣黃綠素指示劑的添加量為?μ? (終反應體系為26μ1)， 所述鈣黃綠素指示劑包含有0.5 mM鈣黃綠素和10 mM氯化錳。
[0015] 以上述專用引物進行LAMP擴增時采用的LAMP擴增反應總體系優(yōu)選如下：待測物 的基因組DNA 2μ1、20 mM Tris .HCl (pH 8.8)、10 mM KC1、10 mM (NH4)2S04、0. 1% Tween20、 0.8 M 甜菜堿、8 mM MgS04、L4 mM dNTP each、8U Bst DNA 聚合酶、cdtA 引物或 cdtB 弓丨 物，加雙蒸水至體系總體積為25 μ L ;所述引物加入量為：檢測cdtA時，加入cdtA引物：40 pmol (FIP 和 BIP)、20 pmol (LF 和 LB)、5 pmol (F3 和 B3);檢測 cdtB 時，加入 cdtB 引物： 40 pmol (FIP 和 BIP)、5 pmol (F3 和 B3)。
[0016] 一種用于檢測艱難梭菌二元毒素的LAMP試劑盒，包括上述用于對艱難梭菌二元 毒素進行LAMP檢測的cdtA引物及cdtB引物。
[0017] 所述試劑盒中還包括陽性對照和陰性對照；所述陽性對照為含二元毒素艱難梭菌 的基因組DNA，所述陰性對照為不含DNA的LAMP擴增體系，如雙蒸水。
[0018] 優(yōu)選的，所述試劑盒中包括：20 mM Tris · HCl (pH 8. 8)、10 mM KC1、10 mM (NH4)2S04、0. 1% Tween 20、0·8 M 甜菜堿、8 mM MgS04、L4 mM dNTP each、8U Bst DNA 聚合 酶、cdtA引物及cdtB引物、鈣黃綠素指示劑、含二元毒素艱難梭菌的基因組DNA和雙蒸水； 其中，cdtA引物為以下引物組合40 pmol (FIP和BIP)、20 pmol (LF和LB)、5 pmol (F3和 B3);所述cdtB引物為以下引物組合：40 pmol (FIP和BIP)、5 pmol (F3和B3)。
[0019] 所述試劑盒可單獨定性檢測艱難梭菌cdtA或cdtB，還可以同時檢測檢測艱難梭 菌 cdtA 和 cdtB。
[0020] 本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術的有益效果如下：采取以上設計，本發(fā)明具有以下優(yōu)點： (1) 高特異性：6條引物對艱難梭菌靶序列的8個特異區(qū)域的識別保證了 LAMP擴增的 高度特異性，即LAMP能從相差僅一個核苷酸的基因標本中找出相應的靶序列進行擴增； (2) 高靈敏度：靈敏度比普通PCR高10倍； (3) 結果鑒定簡便：可通過肉眼觀察結果(鈣黃綠素顯色)，或可以直接用濁度儀判斷結 果(通過測定反應液的濁度判定的原理：LAMP反應的過程中會產(chǎn)生焦磷酸鎂，焦磷酸鎂是 一種白色沉淀，濁度儀可以根據(jù)濁度的變化來判斷LAMP反應，濁度上升表示待測樣品中存 在待測毒素（陽性)，濁度無變化表示待測樣品中不存在待測毒素（陰性)）； (4) 操作簡單：只要將檢測樣品(靶核酸）和檢測試劑一起放入60-62°C恒溫水浴鍋或 金屬浴中90分鐘后就可以判斷結果； (5) 快速、高效擴增：整個LAMP擴增反應90分鐘內即可完成，且產(chǎn)率可達到0. 5mg/mL ; (6) 同步：可按實驗需要單獨或同步檢測cdtA和cdtB，快速檢測艱難梭菌二元毒素攜 帶情況。
[0021] 本發(fā)明可以在等溫條件下快速、方便、同步、高效、高特異、高靈敏地檢測到艱難梭 菌二元毒素攜帶情況，不需要復雜儀器，為艱難梭菌二元毒素的檢測及毒素分型提供了新 的技術平臺，為臨床診療及預后提供指導，可用于基層醫(yī)療衛(wèi)生單位和各疾病預防控制中 心篩查和檢測艱難梭菌二元毒素，具有廣闊的市場前景和較大的經(jīng)濟、社會效益，適于大范 圍推廣應用。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0022] 圖1為實施例2艱難梭菌CdtA的LAMP檢測方法最佳溫度篩選的濁度儀檢測結果。
[0023] 圖2為實施例2艱難梭菌CdtB的LAMP檢測方法最佳溫度篩選的濁度儀檢測結果。
[0024] 圖3為實施例3艱難梭菌CdtA的LAMP檢測方法特異性的濁度儀檢測結果。
[0025] 圖4為實施例3艱難梭菌CdtB的LAMP檢測方法特異性的濁度儀檢測結果。
[0026] 圖5為實施例3艱難梭菌CdtA的LAMP檢測方法特異性的鈣黃綠素染色檢測結果。
[0027] 圖6為實施例3艱難梭菌CdtB的LAMP檢測方法特異性的鈣黃綠素染色檢測結果。
[0028] 圖7為實施例4艱難梭菌CdtA的LAMP檢測方法靈敏度的濁度儀檢測結果。
[0029] 圖8為實施例4艱難梭菌CdtB的LAMP檢測方法靈敏度的濁度儀檢測結果。
[0030] 圖9為實施例4艱難梭菌cdtA的LAMP檢測方法靈敏度的鈣黃綠素染色檢測結果。
[0031] 圖10為實施例4艱難梭菌CdtB的LAMP檢測方法靈敏度的鈣黃綠素染色檢測結 果。
[0032] 圖11為實施例4艱難梭菌cdtA的LAMP檢測方法靈敏度的PCR檢測結果。
[0033] 圖12為實施例4艱難梭菌CdtB的LAMP檢測方法靈敏度的PCR檢測結果。

【具體實施方式】
[0034] 下面通過實施例對本發(fā)明做進一步詳細說明，這些實施例僅用來說明本發(fā)明，并 不限制本發(fā)明的范圍。
[0035] 下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法。
[0036] 實施例1通過以下步驟實施本發(fā)明： 1、用于對艱難梭菌二元毒素進行LAMP檢測的引物設計 (1)用于對艱難梭菌cdtA進行LAMP檢測的引物設計：從美國基因數(shù)據(jù)庫檢索獲得艱 難梭菌cdtA重復序列（GenBank: HQ639673. 1)通過BLAST軟件進行同源性分析得知是艱 難梭菌特異保守序列（序列表中SEQ ID NO: 1)，再根據(jù)該保守靶DNA序列，用軟件Primer design V4設計用于對艱難梭菌cdtA進行LAMP檢測的引物，結果優(yōu)化得到三組引物對，F(xiàn)3 和B3為第一組，F(xiàn)IP和BIP為第二組，LF和LB為第三組，具體各條引物的序列如表1。
[0037] 表1用于對艱難梭菌進行LAMP檢測的cdtA引物

【權利要求】
1. 一種艱難梭菌二元毒素的LAMP檢測方法，其特征在于：包括如下步驟： (1) 引物的設計：分別對艱難梭菌cdtA和cdtB重復序列通過BLAST軟件進行同源性分 析獲得艱難梭菌特異保守序列，再根據(jù)艱難梭菌特異保守DNA序列，用軟件Primer design V4設計分別得到用于對艱難梭菌cdtA和cdtB進行LAMP檢測的引物； (2) LAMP擴增：以待測物的基因組DNA為模板，在上述引物的引導下進行LAMP擴增；所 述的待測物為人及動物的糞便或培養(yǎng)分離的菌株； (3) 擴增反應結束后進行結果判定：擴增反應前預先在反應液中添加鈣黃綠素指示劑， 根據(jù)反應后反應液的顏色變化判斷結果，反應液的顏色變綠色表示待測物樣品中存在艱難 梭菌二元毒素，反應液的顏色變橙色表示待測樣品中不存在艱難梭菌二元毒素；或者不添 加鈣黃綠素指示劑直接用濁度儀檢測反應前后反應液的濁度變化來判斷結果，反應液濁度 上升表示待測物樣品中存在艱難梭菌二元毒素，反應液濁度無變化表示待測樣品中不存在 艱難梭菌二元毒素。
2. 根據(jù)權利要求1所述的艱難梭菌二元毒素的LAMP檢測方法，其特征在于：經(jīng)所述步 驟（1)設計優(yōu)化獲得用于對艱難梭菌cdtA和cdtB進行LAMP檢測的專用引物如下： (1) 用于對艱難梭菌cdtA進行LAMP檢測的cdtA引物為以下三組引物對混合的引物 組合，第一組引物對：引物1 (F3)與引物2 (B3);第二組引物對：引物3 (FIP)與引物4 (BIP);第三組引物對：引物5 (LF)與引物6 (LB);所述各引物序列如下： F3 ：TCTGGTCCTCAAGAATTTGG B3 ：AATAGCTGATAGATAAGCTCCA FIP ：GCTTGTCCTTCCCATTTTGATTTAATTTTTAACTCTTACTTCCCCTGA BIP ：ATTGGTAGTGTGAATATGAGTGCATTACCTTTAGGTATAGTTATACGTAGT LF ：AAATCATATTCAGGGGAA LB ：TTTGCTAAAAGAAAAATAGTACTAC 所述cdtA引物中三組引物對（FIP和BIP): (LF和LB): (F3和B3)的摩爾比為8:4:1 ; (2) 用于對艱難梭菌cdtB進行LAMP檢測的cdtB引物為以下兩組引物對混合的引物 組合，第一組引物對：引物1 (F3)與引物2 (B3);第二組引物對：引物3 (FIP)與引物4 (BIP);所述各引物序列如下： F3 ：GAGTCAAATACTGCTGGAGA B3 ：TAGTAGCTCTGGAAACAGTT FIP ：CGGATCTCTTGCTTCAGTCTTTTTTCAGATTATGAAAAAGCTTCAGGTT BIP ：AGTTGCAGCATATCCAATTGTTGGTTTCCTTGATCAGTAGAGGCATG 所述cdtB引物中兩組引物對（FIP和BIP): (F3和B3)的摩爾比為8: 1。
3. 根據(jù)權利要求1或2所述的艱難梭菌二元毒素的LAMP檢測方法，其特征在于：所 述步驟（1)獲得的引物按步驟（2)進行LAMP擴增的反應條件為：檢測cdtA時，擴增反應在 57-64°C下恒溫90min ;檢測cdtB時，擴增反應在57-68 °C下恒溫90min。
4. 根據(jù)權利要求3所述的艱難梭菌二元毒素的LAMP檢測方法，其特征在于：所述LAMP 擴增的反應條件為：檢測cdtA時，擴增反應在60°C下恒溫90min ;檢測cdtB時，擴增反應在 63°C下恒溫90min ;同時檢測艱難梭菌cdtA和cdtB的擴增反應條件為：61°C恒溫90min。
5. 根據(jù)權利要求1所述的艱難梭菌二元毒素的LAMP檢測方法，其特征在于：所述鈣黃 綠素指示劑的添加量為1W，所述鈣黃綠素指示劑包含有0.5 mM鈣黃綠素和10 mM氯化 猛。
6. 根據(jù)權利要求2所述的艱難梭菌二元毒素LAMP檢測方法，其特征在于：以上所述 專用引物進行LAMP擴增時采用的LAMP擴增反應總體系如下：待測物的基因組DNA 2沿、20 mM Tris .HC1 (pH 8.8)、10 mM KC1、10 mM (NH4)2S04、0. 1% Tween20、0.8 M 甜菜堿、8 mM MgS04、1.4 mM dNTP each、8U Bst DNA聚合酶、cdtA引物或cdtB引物,加雙蒸水至體系總體 積為25iiL;所述專用引物及其加入量為：檢測cdtA時，加入cdtA引物為：40 pmol(FIP和 BIP)、20 pmol (LB 和 LF)，5 pmol (F3 and B3);檢測 cdtB 時，加入 cdtB 引物為：40 pmol (FIP 和 BIP)、5 pmol (F3 和 B3)。
7. -種用于檢測艱難梭菌二元毒素的LAMP試劑盒，其特征在于：包括權利要求2所述 的用于對艱難梭菌二元毒素進行LAMP檢測的cdtA引物或cdtB引物。
8. 根據(jù)權利要求7所述的用于檢測艱難梭菌二元毒素的LAMP試劑盒，其特征在于：所述試劑盒中還包括陽性對照和陰性對照；所述陽性對照為含二元毒素艱難梭菌的基因組 DNA，所述陰性對照為不含DNA的LAMP擴增體系。
9. 根據(jù)權利要求7所述的用于檢測艱難梭菌二元毒素的LAMP試劑盒，其特征在于：所 述試劑盒中包括：20 mM Tris.HCl(pH 8.8)、10 mM KC1、10 mM (NH4)2S04、0. 1% Tween 20、 0.8 M 甜菜堿、8 mM MgS04、1.4 mM dNTP each、8U Bst DNA 聚合酶、cdtA 引物或 cdtB 弓丨 物、鈣黃綠素指示劑、含二元毒素艱難梭菌的基因組DNA和雙蒸水；所述cdtA引物為以下 引物組合：40 pmol (FIP 和 BIP)、20 pmol (LF 和 LB)、5 pmol (F3 和 B3);所述 cdtB 引物 為以下引物組合：40 pmol (FIP 和 BIP)、5 pmol (F3 和 B3)。
10. 根據(jù)權利要求7、中任一項所述的用于檢測艱難梭菌二元毒素的LAMP試劑盒，其 特征在于：所述試劑盒可單獨或同時定性檢測艱難梭菌cdtA或/和cdtB。
【文檔編號】C12R1/145GK104328206SQ201410673919
【公開日】2015年2月4日 申請日期:2014年11月21日 優(yōu)先權日:2014年11月21日
【發(fā)明者】陳燁, 林敏怡, 王浦, 譚嘉圣, 周有連, 袁靜, 劉威 申請人:南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院