一種高產(chǎn)谷氨酰胺的發(fā)酵生產(chǎn)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)一種高產(chǎn)谷氨酰胺的發(fā)酵生產(chǎn)方法，包括以下步驟：步驟一、種子培養(yǎng)；步驟二、將步驟一得到的菌種接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)；發(fā)酵過(guò)程中，控制發(fā)酵培養(yǎng)基的葡萄糖含量、溫度、pH值、溶氧等條件；步驟三、發(fā)酵結(jié)束后，從發(fā)酵液中提取、精制谷氨酰胺。本發(fā)明提供的高產(chǎn)谷氨酰胺的發(fā)酵生產(chǎn)方法，該方法原料成本低、控制易于實(shí)現(xiàn)，發(fā)酵產(chǎn)酸高，平均產(chǎn)酸高達(dá)79.8g/L。
【專利說(shuō)明】一種高產(chǎn)谷氨酰胺的發(fā)酵生產(chǎn)方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵生產(chǎn)領(lǐng)域，具體涉及一種高產(chǎn)谷氨酰胺的發(fā)酵生產(chǎn)方法。

【背景技術(shù)】
[0002]L-谷氨酰胺是人體條件必需性氨基酸，有提高人體免疫力，對(duì)腦機(jī)能和胃腸道功能的發(fā)揮有明顯促進(jìn)作用等特殊功效。目前在食品保健、飼料添加劑、醫(yī)藥衛(wèi)生等領(lǐng)域有較廣泛的應(yīng)用和良好的發(fā)展前景。
[0003]谷氨酰胺主要采用工業(yè)微生物發(fā)酵的方法進(jìn)行生產(chǎn)，目前我國(guó)真正實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)L-谷氨酰胺的企業(yè)很少，菌株產(chǎn)酸水平與國(guó)外先進(jìn)水平相比有較大差距。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種高產(chǎn)谷氨酰胺的發(fā)酵生產(chǎn)方法，該方法原料成本低、控制易于實(shí)現(xiàn)，發(fā)酵產(chǎn)酸高，平均產(chǎn)酸高達(dá)79.8g/L。
[0005]本發(fā)明實(shí)現(xiàn)上述目的采用的技術(shù)方案是:一種高產(chǎn)谷氨酰胺的發(fā)酵生產(chǎn)方法，包括以下步驟:
步驟一、先采用生產(chǎn)谷氨酰胺的菌種進(jìn)行種子培養(yǎng)，在培養(yǎng)過(guò)程的7-9h控制風(fēng)量和轉(zhuǎn)速使溶氧降低至15-20%，培養(yǎng)結(jié)束得到菌種，備用；
步驟二、按照10-15%的接種量將步驟一得到的菌種接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵開(kāi)始
2-5h后，控制發(fā)酵培養(yǎng)基的葡萄糖含量為0.5-1.5%，在發(fā)酵過(guò)程的6-10h內(nèi)流加培養(yǎng)基重量1-1.5%的(NH4)2SO4, 1h后停止流加，發(fā)酵過(guò)程的前30h控制溫度為33_35°C，30h后發(fā)酵罐內(nèi)平均溫度升高0.8-1.2V，當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)至OD值接近最高值時(shí)，調(diào)節(jié)pH值為5.6-6.0，降低溶氧至10-15% ；
所述的發(fā)酵培養(yǎng)基中，除水外以下?tīng)I(yíng)養(yǎng)成分的按照質(zhì)量百分?jǐn)?shù)計(jì)含有分別為葡萄糖
3-7%、玉米漿1-3%,NH4Cl2-4%,KH2PO40.2-0.4%,MgSO40.08-0.2%、和 KC10.1-0.2%，按照每升發(fā)酵培養(yǎng)基中還含有計(jì)，以下?tīng)I(yíng)養(yǎng)成分的添加量分別為酵母粉1-1.5g/L、FeS0410-20mg/L、CuS042-10mg/L、和硫胺素l-10mg/L ;所述的發(fā)酵培養(yǎng)基中還添加有質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為0.1-0.2%的抑制劑，以及谷氨酰胺合成酶的激活劑；
步驟三、發(fā)酵結(jié)束后，從發(fā)酵液中提取、精制谷氨酰胺，即完成高產(chǎn)谷氨酰胺的發(fā)酵生產(chǎn)。
[0006]所述的抑制劑為檸檬酸。
[0007]所述的谷氨酰胺合成酶的激活劑由MnCl2和ZnSO4組成，添加量分別為MnCl250-150mg/L 和 ZnS0410_80mg/L。
[0008]本發(fā)明的有益效果
本發(fā)明提供的谷氨酰胺的發(fā)酵生產(chǎn)方法首次將EMP途徑的代謝流與谷氨酰胺的代謝流統(tǒng)籌考慮，通過(guò)抑制EMP循環(huán)，減少丙氨酸、乙酸等雜酸產(chǎn)生，減少碳架損耗，同時(shí)增強(qiáng)HMP途徑以提供足量的還原力，增強(qiáng)谷氨酰胺合成的代謝流，從而達(dá)到提高產(chǎn)酸、降低成本的目的，本發(fā)明提供的發(fā)酵方法可達(dá)到平均產(chǎn)酸79.8g/L。
[0009]本發(fā)明在谷氨酰胺的培養(yǎng)過(guò)程中，通過(guò)調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH、增加酶的激活劑，來(lái)綜合提高谷氨酰胺合成酶的活性，抑制谷氨酸脫氫酶和谷氨酸合成酶活性。底料中NH4Cl含量較低，形成氮饑餓，6-10h后再流加(NH4)2SO4提供充足銨根離子以便于谷氨酰胺合成，避免初始銨離子濃度過(guò)高抑制谷氨酰胺合成酶活性，同時(shí)提高氯離子含量能夠增加谷氨酸泌出細(xì)胞外的難度。

【具體實(shí)施方式】
[0010]一種高產(chǎn)谷氨酰胺的發(fā)酵生產(chǎn)方法，包括以下步驟:
步驟一、先采用生產(chǎn)谷氨酰胺的菌種進(jìn)行種子培養(yǎng)，在培養(yǎng)過(guò)程的7-9h控制風(fēng)量和轉(zhuǎn)速使溶氧降低至15-20%，培養(yǎng)結(jié)束得到菌種，備用；
步驟二、按照10-15%的接種量將步驟一得到的菌種接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵開(kāi)始
2-5h后，控制發(fā)酵培養(yǎng)基的葡萄糖含量為0.5-1.5%，在發(fā)酵過(guò)程的6-10h內(nèi)流加培養(yǎng)基重量1-1.5%的(NH4)2SO4, 1h后停止流加，發(fā)酵過(guò)程的前30h控制溫度為33_35°C，30h后發(fā)酵罐內(nèi)平均溫度升高0.8-1.2V，當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)至OD值接近最高值時(shí)，調(diào)節(jié)pH值為5.6-6.0，降低溶氧至10-15% ；
所述的發(fā)酵培養(yǎng)基中，除水外以下?tīng)I(yíng)養(yǎng)成分的按照質(zhì)量百分?jǐn)?shù)計(jì)含有分別為葡萄糖
3-7%、玉米漿1-3%,NH4Cl2-4%,KH2PO40.2-0.4%,MgSO40.08-0.2%、和 KC10.1-0.2%，按照每升發(fā)酵培養(yǎng)基中還含有計(jì)，以下?tīng)I(yíng)養(yǎng)成分的添加量分別為酵母粉1-1.5g/L、FeS0410-20mg/L、CuS042-10mg/L、和硫胺素l-10mg/L ;所述的發(fā)酵培養(yǎng)基中還添加有質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為0.1-0.2%的抑制劑，以及谷氨酰胺合成酶的激活劑；
步驟三、發(fā)酵結(jié)束后，從發(fā)酵液中提取、精制谷氨酰胺，即完成高產(chǎn)谷氨酰胺的發(fā)酵生產(chǎn)。
[0011]所述的抑制劑為檸檬酸。
[0012]所述的谷氨酰胺合成酶的激活劑由MnCl2和ZnSO4組成，添加量分別為MnCl250-150mg/L 和 ZnS0410_80mg/L。
[0013]以下結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明:
實(shí)施例1:
一種高產(chǎn)谷氨酰胺的發(fā)酵生產(chǎn)方法，包括以下步驟:
步驟一、先采用谷氨酸棒桿菌YG-3131進(jìn)行種子培養(yǎng)，在培養(yǎng)過(guò)程的7-9h控制風(fēng)量和轉(zhuǎn)速使溶氧降低至15-20%，培養(yǎng)結(jié)束得到菌種，備用；
步驟二、按照10%的接種量將步驟一得到的菌種接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基中，除水外，按照質(zhì)量百分?jǐn)?shù)計(jì)含有葡萄糖7%、玉米漿1%、NH4Cl2%, KH2PO40.2%、MgSO40.08%、KC10.1%，按照每升計(jì)，每升發(fā)酵培養(yǎng)基中還含有酵母粉lg/L、FeS0420mg/L、CuS042mg/L和硫胺素lmg/L ;所述的發(fā)酵培養(yǎng)基中還添加有質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為0.1%的抑制劑檸檬酸，以及谷氨酰胺合成酶的激活劑，谷氨酰胺合成酶的激活劑由MnCl2和ZnSO4組成，添加量分別為 MnCl250mg/L 和 ZnS0480mg/L ；
發(fā)酵開(kāi)始2-5h后，控制發(fā)酵培養(yǎng)基的葡萄糖含量為0.5-1.5%，在發(fā)酵過(guò)程的6-10h內(nèi)流加培養(yǎng)基重量1-1.5%的(NH4)2SO4, 1h后停止流加，發(fā)酵過(guò)程的前30h控制溫度為33°C，30h后發(fā)酵罐內(nèi)平均溫度升高1.2°C，當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)至OD值接近最高值時(shí)，調(diào)節(jié)pH值為5.6-6.0,降低溶氧至10-15% ；
步驟三、發(fā)酵結(jié)束后，從發(fā)酵液中提取、精制谷氨酰胺，即完成高產(chǎn)谷氨酰胺的發(fā)酵生產(chǎn)。
[0014]本實(shí)施例最終產(chǎn)酸量為80.0g/L。
[0015]實(shí)施例2:
一種高產(chǎn)谷氨酰胺的發(fā)酵生產(chǎn)方法，包括以下步驟:
步驟一、先采用谷氨酸棒桿菌YG-3131進(jìn)行種子培養(yǎng)，在培養(yǎng)過(guò)程的7-9h控制風(fēng)量和轉(zhuǎn)速使溶氧降低至15-20%，培養(yǎng)結(jié)束得到菌種，備用；
步驟二、按照15%的接種量將步驟一得到的菌種接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基中，按照質(zhì)量百分?jǐn)?shù)計(jì)含有葡萄糖3%、玉米漿1%、NH4Cl2%, KH2PO40.2%、MgSO40.2%、KC10.2%，按照每升計(jì)，每升發(fā)酵培養(yǎng)基中還含有酵母粉1.5g/L、FeS0410mg/L、CuS0410mg/L和硫胺素10mg/L ;所述的發(fā)酵培養(yǎng)基中還添加有質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為0.2%的抑制劑檸檬酸，以及谷氨酰胺合成酶的激活劑，谷氨酰胺合成酶的激活劑由MnCl2和ZnSO4組成，添加量分別為MnCl2150mg/L 和 ZnS0410mg/L ；
發(fā)酵開(kāi)始2-5h后，控制發(fā)酵培養(yǎng)基的葡萄糖含量為0.5-1.5%，在發(fā)酵過(guò)程的6-10h內(nèi)流加培養(yǎng)基重量1-1.5%的(NH4)2SO4, 1h后停止流加，發(fā)酵過(guò)程的前30h控制溫度為350C，30h后發(fā)酵罐內(nèi)平均溫度升高0.8°C，當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)至OD值接近最高值時(shí)，調(diào)節(jié)pH值為5.6-6.0,降低溶氧至10-15% ；
步驟三、發(fā)酵結(jié)束后，從發(fā)酵液中提取、精制谷氨酰胺，即完成高產(chǎn)谷氨酰胺的發(fā)酵生產(chǎn)。
[0016]本實(shí)施例最終產(chǎn)酸量為79.0g/L。
[0017]實(shí)施例3:
一種高產(chǎn)谷氨酰胺的發(fā)酵生產(chǎn)方法，包括以下步驟:
步驟一、先采用谷氨酸棒桿菌YG-3131進(jìn)行種子培養(yǎng)，在培養(yǎng)過(guò)程的7-9h控制風(fēng)量和轉(zhuǎn)速使溶氧降低至15-20%，培養(yǎng)結(jié)束得到菌種，備用；
步驟二、按照13%的接種量將步驟一得到的菌種接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基中，按照質(zhì)量百分?jǐn)?shù)計(jì)含有葡萄糖5%、玉米漿2%、NH4Cl3%, KH2PO40.3%、MgSO40.1%、KC10.15%，按照每升計(jì)，每升發(fā)酵培養(yǎng)基中還含有酵母粉1.2g/L、FeS0415mg/L、CuS046mg/L和硫胺素6mg/L ;所述的發(fā)酵培養(yǎng)基中還添加有質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為0.15%的抑制劑檸檬酸，以及谷氨酰胺合成酶的激活劑，谷氨酰胺合成酶的激活劑由MnCl2和ZnSO4組成，添加量分別為MnCl210mg/!和 ZnS0445mg/L ；
發(fā)酵開(kāi)始2-5h后，控制發(fā)酵培養(yǎng)基的葡萄糖含量為0.5-1.5%，在發(fā)酵過(guò)程的6-10h內(nèi)流加培養(yǎng)基重量1-1.5%的(NH4)2SO4, 1h后停止流加，發(fā)酵過(guò)程的前30h控制溫度為34°C，30h后發(fā)酵罐內(nèi)平均溫度升高1°C，當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)至OD值接近最高值時(shí)，調(diào)節(jié)pH值為5.6-6.0,降低溶氧至10-15% ；
步驟三、發(fā)酵結(jié)束后，從發(fā)酵液中提取、精制谷氨酰胺，即完成高產(chǎn)谷氨酰胺的發(fā)酵生產(chǎn)。
[0018]本實(shí)施例最終產(chǎn)酸量為80.4g/L。
【權(quán)利要求】
1.一種高產(chǎn)谷氨酰胺的發(fā)酵生產(chǎn)方法，其特征在于:包括以下步驟: 步驟一、先采用生產(chǎn)谷氨酰胺的菌種進(jìn)行種子培養(yǎng)，在培養(yǎng)過(guò)程的7-9h控制風(fēng)量和轉(zhuǎn)速使溶氧降低至15-20%，培養(yǎng)結(jié)束得到菌種，備用； 步驟二、按照10-15%的接種量將步驟一得到的菌種接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵開(kāi)始2-5h后，控制發(fā)酵培養(yǎng)基的葡萄糖含量為0.5-1.5%，在發(fā)酵過(guò)程的6-10h內(nèi)流加培養(yǎng)基重量1-1.5%的(NH4)2SO4, 1h后停止流加，發(fā)酵過(guò)程的前30h控制溫度為33-35°C，30h后發(fā)酵罐內(nèi)平均溫度升高0.8-1.2V，當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)至OD值接近最高值時(shí)，調(diào)節(jié)pH值為5.6-6.0，降低溶氧至10-15% ； 所述的發(fā)酵培養(yǎng)基中，按照質(zhì)量百分?jǐn)?shù)計(jì)含有葡萄糖3-7%、玉米漿1-3%、NH4Cl2-4%,KH2PO40.2-0.4%、MgSO40.08-0.2%和KC10.1-0.2%，每升發(fā)酵培養(yǎng)基中還含有酵母粉1-1.5g/L、FeS0410-20mg/L、CuS042-10mg/L 和硫胺素 1-lOmg/L ;所述的發(fā)酵培養(yǎng)基中還添加有質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為0.1-0.2%的抑制劑，以及谷氨酰胺合成酶的激活劑； 步驟三、發(fā)酵結(jié)束后，從發(fā)酵液中提取、精制谷氨酰胺，即完成高產(chǎn)谷氨酰胺的發(fā)酵生產(chǎn)。
2.如權(quán)利要求1所述的一種高產(chǎn)谷氨酰胺的發(fā)酵生產(chǎn)方法，其特征在于:所述的抑制劑為朽1檬酸。
3.如權(quán)利要求1所述的一種高產(chǎn)谷氨酰胺的發(fā)酵生產(chǎn)方法，其特征在于:所述的谷氨酰胺合成酶的激活劑由MnCl2和ZnSO4組成，添加量分別為MnCl250_150mg/L和ZnS0410_80mg/L。
【文檔編號(hào)】C12R1/15GK104404097SQ201410678732
【公開(kāi)日】2015年3月11日 申請(qǐng)日期:2014年11月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月24日
【發(fā)明者】岳貴龍, 孫朝陽(yáng), 徐曉鵬 申請(qǐng)人:河南巨龍生物工程股份有限公司