使用穩(wěn)定輔酶的脫氫酶穩(wěn)定作用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及使用穩(wěn)定輔酶的脫氫酶穩(wěn)定作用。本發(fā)明涉及通過在穩(wěn)定輔酶的存在下貯藏酶用于使酶穩(wěn)定的方法。此外，本發(fā)明涉及使用穩(wěn)定輔酶穩(wěn)定的酶及其在用于檢測分析物的測試元件中的用途。
【專利說明】使用穩(wěn)定輔酶的脫氫酶穩(wěn)定作用
[0001] 本申請是國際申請日為2009年2月19日的國際申請PCT/EP2009/001206進入中 國、申請?zhí)枮?00980105640. 6的題為"使用穩(wěn)定輔酶的脫氫酶穩(wěn)定作用"的發(fā)明專利申請 的分案申請。

【技術領域】
[0002] 本發(fā)明涉及通過在穩(wěn)定輔酶的存在下貯藏酶使酶穩(wěn)定的方法。本發(fā)明進一步涉及 用穩(wěn)定輔酶穩(wěn)定的酶，及其在用于檢測分析物的測試元件中的用途。

【背景技術】
[0003] 生物化學測量系統(tǒng)是臨床相關的分析方法的重要組成成分。本文優(yōu)先考慮的事是 測量分析物例如代謝物或底物，其借助于酶直接或間接進行測定。分析物在這種情況下借 助于酶_輔酶復合物進行轉變，并且隨后進行定量。這需要待測定的分析物與合適的酶和 輔酶接觸，其中酶通常以催化量使用。輔酶通過酶促反應得到改變，例如被氧化或還原。這 個過程可以直接，或通過介質電化學或光度測定地進行檢測。校準提供量度和待測定的分 析物濃度之間的正相關關系。
[0004] 輔酶是與酶共價或非共價結合，并且通過分析物的轉變而改變的有機分子。輔酶 的突出例子分別是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD)和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP)，由 其通過還原分別產生NADH和NADPH。
[0005] 現(xiàn)有技術中已知的測量系統(tǒng)因對于有限時間段穩(wěn)定，以及為了達到這種穩(wěn)定性對 環(huán)境的特定需求例如冷卻貯藏或干燥貯藏而著稱。對于具體應用，例如由最終用戶自身執(zhí) 行的測試，例如在血糖的自我監(jiān)控中，通過不正確、不引人注意的錯誤貯藏發(fā)生不正確的結 果因此是可能的。通過主要包裝打開太長時間的干燥劑耗盡特別可能導致錯誤測量，這對 于一些系統(tǒng)幾乎不會被用戶鑒別出。
[0006] 用于增加生物化學測量系統(tǒng)的穩(wěn)定性的一種已知措施是使用穩(wěn)定的酶，例如使用 來自嗜熱生物的酶。進一步的可能性是通過化學修飾例如交聯(lián)或通過誘變使酶穩(wěn)定。此 夕卜，還可以添加酶穩(wěn)定劑例如海藻糖、聚乙烯吡咯烷酮和血清清蛋白，或可以在聚合物網絡 中例如通過光聚合而封入酶。
[0007] 還已進行通過使用穩(wěn)定的介質來改善生物化學測量系統(tǒng)的穩(wěn)定性的嘗試。因此， 通過使用具有盡可能低的氧化還原電位的介質，測試的特異性增加，并且在反應過程中的 干擾被消除。然而，酶/輔酶復合物的氧化還原電位形成對于介質的氧化還原電位的下限。 低于這些電位，與介質的反應減慢或甚至停止。
[0008] 可替代可能性也是使用不含介質的生物化學測量系統(tǒng)，其中例如存在輔酶例如輔 酶NADH的直接檢測。然而，此種測量系統(tǒng)的一個缺點是輔酶例如NAD和NADP是不穩(wěn)定的。
[0009] NAD和NADP是對堿不穩(wěn)定的分子，其降解途徑在文獻中得到描述 (N. J. Oppenheimer in The Pyridine Nucleotide Coenzymes,Academic Press New York, London 1982,編輯 J. Everese，B. Anderson，K. You，第 3 章，第 56-65 頁）。NAD 和 NADP 的 降解通過切割核糖和吡啶單位之間的糖基鍵分別基本上導致ADP-核糖。另一方面還原型 NADH和NADPH是對酸不穩(wěn)定的：例如，表異構化是一種已知的降解途徑。在兩種情況下， NAD/NADP和NADH/NADPH的不穩(wěn)定性都來源于核糖單位和吡啶單位之間的糖基鍵的不穩(wěn)定 性。然而，即使在不急劇的條件下，例如在水溶液中，輔酶NAD和NADP分別僅通過環(huán)境水分 而水解。這種不穩(wěn)定性可能導致分析物測量中的不精確。
[0010] 許多 NAD/NADP 衍生物例如在 B. M. Anderson in The Pyridine Nucleotide Coenzymes, Academic Press New York, London 1982,編輯 J. Everese，B. Anderson，K. You， 第4章中得到描述。然而，這些衍生物中的大多數不由酶良好接受。迄今為止因此已用于 診斷測試的唯一衍生物是3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸（乙酰NAD)，其在1956年首次得到 描述（N. 0. Kaplan，J. Biol.Chem. (1956)，221，823)。這種輔酶也顯示由酶的弱接受和氧化 還原電位中的改變。
[0011] W0 01/94370描述了具有經修飾的吡啶基團的進一步NAD衍生物的使用。然而，煙 酰胺基團的修飾一般而言對催化反應具有直接影響。在大多數情況下，這種影響是負面的。
[0012] 在關于穩(wěn)定作用的進一步想法中，核糖單位已進行改變，以從而影響糖基鍵的穩(wěn) 定性。這個程序不直接干擾煙酰胺基團的催化反應。然而，一旦酶顯示出與核糖單位的 強烈和特異性結合，就可能存在間接影響。Kaufmann等人在這方面在W0 98/33936和US 5,801，006以及冊01/49247中分別公開了許多硫代核糖（也1〇1^13〇86)-隱0衍生物。然 而，迄今為止仍未顯示出煙酰胺-核糖單位的修飾和衍生物在酶促反應中的活性之間的聯(lián) 系。
[0013] 不含糖基鍵的衍生物CarbaNAD在1988年首次得到描述（J. T. Slama， Biochemistry 1989, 27，183 和 Biochemistry 1989, 28, 7688)。其中的核糖由碳環(huán)糖單位 替換。盡管carbaNAD描述為脫氫酶的底物，但它的活性迄今為止仍未在臨床上在生物化學 檢測方法中得到證實。
[0014] 類似方法隨后由G. M. Blackburn，Chem. Comm.，1996, 2765進行描述，以用亞甲 基雙膦酸鹽化合物代替天然的焦磷酸鹽制備carbaNAD。亞甲基雙膦酸鹽顯示對于磷酸 酶增加的穩(wěn)定性并且用作ADP-核糖基環(huán)化酶的抑制劑。水解穩(wěn)定性中的增加不是目的 (J. T. Slama，G. M. Blackburn) 〇
[0015] WO 2007/012494 和 US 11/460, 366 分別公開了穩(wěn)定的 NAD/NADH和 NADP/NADPH衍 生物，這些衍生物的酶復合物及其在生物化學檢測方法和試劑盒中的用途。


【發(fā)明內容】

[0016] 本發(fā)明所基于的目的是提供用于使酶穩(wěn)定，特別是用于酶的長期穩(wěn)定作用的方 法。
[0017] 這個目的通過用于使酶穩(wěn)定的方法來達到，其中酶在穩(wěn)定輔酶的存在下進行貯 藏。已令人驚訝地發(fā)現(xiàn)借助于穩(wěn)定輔酶，在高相對濕度或甚至在液相中和在升高的溫度下 幾周或幾月的長期穩(wěn)定作用是可能的。這個認識是令人驚訝的，因為已知盡管在天然輔 酶的存在下酶具有數小時的增加的短期穩(wěn)定性（Bertoldi等人，Biochem. J. 389,（2005)， 885-898 ;van den Heuvel 等人，（J.Biol. Chem. 280(2005)，32115-32121;和 Pan 等人， (J. Chin. Biochem. Soc.第3卷（1974)，第1-8頁），但它們顯示在較長時間段期間的較低穩(wěn) 定性（Nutrition Reviews 36 (1978)，251-254)。
[0018] 與對于現(xiàn)有技術來說的這些認識相比較，令人驚訝的是，酶在穩(wěn)定輔酶的存在下 具有比酶在天然輔酶的存在下顯然增加的長期穩(wěn)定性，這尤其是因為穩(wěn)定輔酶對于酶具有 比天然輔酶更低的結合常數。
[0019] 通過本發(fā)明的方法得到穩(wěn)定的酶是輔酶依賴性酶。合適的酶的例子是選自下述的 脫氫酶：葡糖脫氫酶（E.C. 1. 1. 1. 47)、乳酸脫氫酶（E.C. 1. 1. 1. 27、1. 1. 1. 28)、蘋果酸脫氫 酶（E.C. 1. 1. 1. 37)、甘油脫氫酶（E.C. 1. 1. 1. 6)、醇脫氫酶（E.C. 1. 1. 1. 1)、a -羥丁酸脫氫 酶、山梨糖醇脫氫酶或氨基酸脫氫酶，例如L-氨基酸脫氫酶（E.C. 1. 4. 1. 5)。進一步合適的 酶是氧化酶，例如葡糖氧化酶（E.C. 1. 1. 3. 4)或膽固醇氧化酶（E.C. 1. 1. 3. 6)和氨基轉移 酶，分別地，例如天冬氨酸或丙氨酸氨基轉移酶、5'-核苷酸酶或肌酸激酶。酶優(yōu)選是葡糖 脫氫酶。
[0020] 已證明在本發(fā)明方法的背景中采用突變的葡糖脫氫酶是特別優(yōu)選的。如在本申請 的背景中使用的，術語"突變體"指天然酶的基因修飾變體，其盡管氨基酸數目是相同的，但 具有與野生型酶相比較經修飾的氨基酸序列，即在至少一個氨基酸中不同于野生型酶。一 個或多個突變的引入可以位點特異性地發(fā)生或非位點特異性地發(fā)生，優(yōu)選通過使用本領域 已知的重組方法位點特異性地發(fā)生，然而，適合于具體需求和條件，發(fā)生在天然酶的氨基酸 序列內的至少一個氨基酸交換。與野生型酶相比較，突變體特別優(yōu)選具有增加的熱或水解 穩(wěn)定性。
[0021] 突變的葡糖脫氫酶原則上可以包括通過與相對應的野生型葡糖脫氫酶相比較，在 其氨基酸序列中在任何位置處進行修飾的一個或多個氨基酸。突變的葡糖脫氫酶優(yōu)選包括 在野生型葡糖脫氫酶的氨基酸序列的位置96、170和252中至少一個處的突變，特別優(yōu)選具 有在位置96和位置170處的突變，以及在位置170和位置252處的突變的突變體。已證明 對于突變的葡糖脫氫酶不包括除這些突變外的進一步突變是有利的。
[0022] 在位置96、170和252處的突變原則上可以包括野生型酶的任何氨基酸交換，其導 致穩(wěn)定作用，例如熱或水解穩(wěn)定性中的增加。在位置96處的突變優(yōu)選包括谷氨酸對于甘氨 酸的氨基酸交換，而就位置170而言，谷氨酸對于精氨酸或賴氨酸的氨基酸交換，特別地谷 氨酸對于賴氨酸的氨基酸交換是優(yōu)選的。就在位置252處的突變而言，這優(yōu)選包括賴氨酸 對于亮氨酸的氨基酸交換。
[0023] 突變的葡糖脫氫酶可以通過衍生自任何生物學來源的野生型葡糖脫氫酶的突變 而獲得，其中術語"生物學來源"在本發(fā)明的背景中包括原核生物例如細菌，和真核生物 例如哺乳動物和其他動物。野生型葡糖脫氫酶優(yōu)選衍生自細菌，特別優(yōu)選來自巨大芽孢 桿菌（Bacillusmegaterium)、枯草芽抱桿菌（Bacillussubtilis)或蘇云金芽抱桿菌 (Bacillusthuringiensis)特別是枯草芽孢桿菌的葡糖脫氫酶。
[0024] 在本發(fā)明的一個特別優(yōu)選的實施方案中，突變的葡糖脫氫酶是通過來自枯草芽孢 桿菌的野生型葡糖脫氫酶的突變獲得的葡糖脫氫酶，其具有SEQ ID NO. :l(GlucDH_E96G_ E170K)中所示的氨基酸序列或SEQ ID NO. :2(GlucDH_E170K_K252L)中所示的那種。
[0025] 穩(wěn)定輔酶是通過與天然輔酶相比較已進行化學修飾，并且具有比天然輔酶更高的 穩(wěn)定性（例如，水解穩(wěn)定性）的輔酶。穩(wěn)定輔酶優(yōu)選在測試條件下對水解是穩(wěn)定的。與天 然輔酶相比較，穩(wěn)定輔酶可以具有對于酶減少的結合常數，例如減少二分之一或更多的結 合常數。
[0026] 穩(wěn)定輔酶的優(yōu)選例子是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD/NADH)或煙酰胺腺嘌呤二核 苷酸磷酸（NADP/NADPH)的穩(wěn)定衍生物，或截短的NAD衍生物，例如不含AMP部分或具有非 核苷殘基，例如疏水殘基。在本發(fā)明的背景中同樣優(yōu)選作為穩(wěn)定輔酶的是式（I)的化合物
[0027]

【權利要求】
1.用于使酶穩(wěn)定的方法，其特征在于所述酶在穩(wěn)定輔酶的存在下進行貯藏，其中所 述酶是選自下述的脫氫酶：葡糖脫氫酶（E.c.I. 1. 1.47)、乳酸脫氫酶（E.C.I. 1. 1.27、 I.I. 1. 28)、蘋果酸脫氫酶（E.C.I.I. 1. 37)、甘油脫氫酶（E.C.I.I. 1. 6)、醇脫氫酶 (E.C.I.I. 1. 1)、α-羥丁酸脫氫酶、山梨糖醇脫氫酶或氨基酸脫氫酶，例如L-氨基酸脫氫 酶（E.C. 1. 4. 1. 5)，且所述穩(wěn)定輔酶是通式（II)的化合物
其中 A=腺嘌呤、7-脫氮腺嘌呤、8-氮雜腺嘌呤或7-脫氮-8-氮雜腺嘌呤，其中所述7-脫 氣變體可以任選在位置7中由齒素、C1-C6-塊基、C1-C6-鏈稀基或C1-C6-燒基取代， T=在每種情況下是0， U=在每種情況下是0Η， V =OH或磷酸基，或形成環(huán)狀磷酸基的2個基團； W=。0順2或COCH3， X1= 0， X2= 0， Y = 0,且 Z=通式（III)的化合物，
其中在If和R5"之間存在單鍵，其中R4 =在每種情況下獨立地是H、F、Cl、CH3， R5=CH2, R5i =CH2、CHOH或NH， R5" =C(R4)2、CHOH或CHOCH3, R6=CH或CCH3，且R6' =CH或CCH3。
2. 根據權利要求1的方法，其特征在于將葡糖脫氫酶用作酶。
3. 根據權利要求1或2的方法，其中RY和R5"各自是CHOH。
4. 根據權利要求1-3中任一項的方法，其中RY是NH，并且R5"是CH2。
5. 根據權利要求1-4中任一項的方法，其特征在于所述穩(wěn)定輔酶是carbaNAD。
6. 根據權利要求1-5中任一項的方法，其特征在于用穩(wěn)定輔酶穩(wěn)定的酶貯藏至少2周 的時間段。
7. 根據權利要求1-6中任一項的方法，其特征在于用穩(wěn)定輔酶穩(wěn)定的酶貯藏于至少 20 °C的溫度下。
8. 根據權利要求1-7中任一項的方法，其特征在于用穩(wěn)定輔酶穩(wěn)定的酶無需干燥試劑 進行貯藏。
9. 根據權利要求1-8中任一項的方法，其特征在于用穩(wěn)定輔酶穩(wěn)定的酶貯藏于至少 50 %的相對濕度下。
10. 根據權利要求1-9中任一項的方法，其特征在于用穩(wěn)定輔酶穩(wěn)定的酶的貯藏作為 干物質發(fā)生。
11. 根據權利要求1-9中任一項的方法，其特征在于用穩(wěn)定輔酶穩(wěn)定的酶的貯藏在液 相中發(fā)生。
12. 根據權利要求1-11中任一項的方法，其特征在于用穩(wěn)定輔酶穩(wěn)定的酶在測試元件 上發(fā)生。
13. 用穩(wěn)定輔酶穩(wěn)定的酶，其特征在于它顯示在至少20°C的溫度下，在合適時連同至 少50%的相對濕度且無需干燥試劑，貯藏至少2周后，與最初水平相比較，所述酶促活性中 的下降小于50%，其中所述酶是突變的葡糖脫氫酶，且所述突變的葡糖脫氫酶與相應的野 生型葡糖脫氫酶相比具有增加的熱或水解穩(wěn)定性，其中所述突變的葡糖脫氫酶包括在相應 的野生型葡糖脫氫酶的氨基酸序列的位置96、170和252中至少一個處的突變，且其中所述 穩(wěn)定輔酶是通式（II)的化合物
其中 A=腺嘌呤、7-脫氮腺嘌呤、8-氮雜腺嘌呤或7-脫氮-8-氮雜腺嘌呤，其中所述7-脫 氣變體可以任選在位置7中由齒素、C1-C6-塊基、C1-C6-鏈稀基或C1-C6-燒基取代， T=在每種情況下是0， U=在每種情況下是0H， V=OH或磷酸基，或形成環(huán)狀磷酸基的2個基團； W=。0順2或COCH3， X1= 0， X2= 0， Y= 0,且 Z=通式（III)的化合物，
其中在If和R5"之間存在單鍵，其中R4 =在每種情況下獨立地是H、F、Cl、CH3， R5=CH2, R5i =CH2、CHOH或NH， R5" =C(R4)2、CHOH或CHOCH3, R6=CH或CCH3，且R6' =CH或CCH3。
14. 用于測定分析物的檢測試劑，其包括根據權利要求13的穩(wěn)定的酶。
15. 測試元件，其特征在于它包括根據權利要求13的穩(wěn)定的酶或根據權利要求14的檢 測試劑。
【文檔編號】C12N9/06GK104450659SQ201410680334
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2009年2月19日 優(yōu)先權日:2008年2月19日
【發(fā)明者】海因德爾 D., 霍恩 C., 加斯勒迪切 C., 霍內斯 J. 申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司