轉基因煙草及其獲得方法和應用的制作方法
【專利摘要】一種植物病原黃單胞菌ssbX轉基因煙草，是將來自稻黃單胞菌的ssbX基因通過農(nóng)桿菌介導的方式轉入煙草中，獲得ssbX轉基因煙草；所述ssbX基因序列如SEQ ID NO.1所示，序列長度為552bp；ssbX基因的蛋白質序列如SEQ ID NO.2所示，編碼183個氨基酸。ssbX基因的啟動子為CaMV 35S，其序列如SEQ ID NO.3所示，序列長度為538bp。ssbX轉基因煙草的篩選標記基因為Km，序列如SEQ ID NO.4所示，序列長度為792bp。本發(fā)明獲得的植物病原黃單胞菌ssbX轉基因煙草，在煙草植物中表達，增強了對病毒病和細菌病害的抗病性，可作為抗病育種資源。
【專利說明】植物病原黃單胞菌SSbx轉基因煙草及其獲得方法和應用

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程技術，特別涉及一株植物病原黃單胞菌SsbxR基因煙草及其 獲得方法和應用。 技術背景
[0002] 稻黃單胞菌種下的水稻條斑病菌（Xanthomonasoryzaepv.oryzicola，Xoc)和水 稻白葉枯病菌（Xanthomonasoryzaepv.oryzae)的兩個致病變種，分別引起水稻發(fā)生水稻 細菌性條斑?。ê喎Q條斑?。˙acterialLeafStreak，BLS)和水稻白葉枯?。˙acterial LeafBiight，BLB)，是水稻上的重要細菌病害。稻黃單胞菌與水稻互作，也同其他植物病原 物-植物互作一樣，存在著相互斗爭并協(xié)同進化著的過程。植物在生長發(fā)育過程中面臨著 非常復雜的生存環(huán)境和遭受病原真菌、細菌和病毒的侵染。經(jīng)過漫長進化，植物逐漸形成了 一系列復雜的主動適應機制以防御病原菌的侵染。在病原菌侵染位點，免疫性的植物產(chǎn)生 過敏反應（HypersensitiveResponse，·)，并通過活性氧（ROS)迸發(fā)、內源水楊酸（SA)的 積累和信號傳導，使植株產(chǎn)生系統(tǒng)獲得性抗性（SystemicAcquiredResistance,SAR)或 誘導性系統(tǒng)抗性（InducedSystemicResistance,ISR)。植物在抵御病原菌侵染時通常由 2個防御系統(tǒng)：第1層防御系統(tǒng)稱為病原相關分子模式觸發(fā)的免疫反應（PAMP-triggered immunity，PTI)，它通過模式識別受體（patternrecognitionreceptors，PRRs)來識別病 原菌共有的PAMPs。例如，細菌鞭毛蛋白（flagellin)、脂多糖（lipopolysaccharide，LPS)、 真菌的葡聚糖（glucans)、幾丁質（chitins)等是已經(jīng)鑒定的PAMPs。這些PAMPs可被植物 的PRRs識別，迅速觸發(fā)基礎免疫性，包括HR產(chǎn)生（有時也不產(chǎn)生HR)、活性氧迸發(fā)（ROS)、 植物保衛(wèi)素（Phytoallexin)的產(chǎn)生以及一些病程相關蛋白基因的表達。此類防御反應可 以有效地抑制病原菌的生長，阻止植物病害的發(fā)生。
[0003] 較早認識激發(fā)非寄主植物產(chǎn)生HR的是在革蘭氏陰性植物病原細菌中發(fā)現(xiàn)的。隨 后認為革蘭氏陰性植物病原細菌產(chǎn)生的harpin蛋白直接與HR產(chǎn)生相關，并認為harpin蛋 白也是PAMPs。為了進一步的明確harpin蛋白的功能及與植物互作的機制，越來越多的研 究把目光放在了尋找植物中存在的harpin蛋白的受體或互作蛋白上以及利用植物基因工 程技術研究harpin轉基因株系的抗病性。目前X.oryzaepv.oryzicola中已知的harpin 蛋白是由hrp基因族中的hpal基因編碼的。
[0004]除Hpal外，還發(fā)現(xiàn)hrp基因族外的Single-strandedDNA-bindingprotein(Ssbx) 編碼基因也具有harpin蛋白的特性：受HrpG和HrpX調控并通過T3SS途徑分泌、對熱穩(wěn)定、 對蛋白酶K敏感，能激發(fā)煙草產(chǎn)生HR，且在產(chǎn)生HR的煙草細胞中發(fā)生明顯的基因組DNA片 段化、誘導煙草中活性氧迸發(fā)和胼胝質的積累、激活植物的基礎防衛(wèi)反應基因的表達，如： HINl和HSR203J等（Lietal.，2013)。據(jù)此，將Ssbx 蛋白稱之為harpin-likeprotein B(HlpB)。


【發(fā)明內容】

[0005] 本發(fā)明的目的，是通過將過敏反應的激發(fā)子轉入煙草中，提供一種植物病原黃單 胞菌SSbx轉基因煙草及其獲得方法和應用。
[0006] 為了實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明采用了以下技術方案：
[0007] -種植物病原黃單胞菌SSbx轉基因煙草，是將來自稻黃單胞菌的SSbx基因通過農(nóng) 桿菌介導的方式轉入煙草中，獲得Ssbx轉基因煙草；所述SSbx基因序列如SEQIDN0.1所 示，序列長度為552bp;SSbx基因的蛋白質序列如SEQIDNO. 2所示，編碼183個氨基酸。
[0008] 所述SSbx基因的啟動子為CaMV35S，其序列如SEQIDNO. 3所示，序列長度為 538bp。
[0009] 所述ssbx轉基因煙草的篩選標記基因為Km，序列如SEQIDNO. 4所示，序列長度 為 792bp。
[0010] 上述植物病原黃單胞菌SSbx轉基因煙草的獲得方法，包括以下步驟：
[0011] A、將來自稻黃單胞菌的^匕基因構建在轉基因載體PCAMBIA2300上，獲得重組載 體pCSsbX;
[0012] B、將重組載體pCSsbX轉入農(nóng)桿菌EHA105中，再感染煙草葉肉細胞，在含有卡那霉 素的MS培養(yǎng)基上獲得再生植株；
[0013]C、以Ssb5^PKm基因為靶標基因，通過PCR和Southern雜交技術對煙草再生植株 進行篩選，獲得SSbx轉基因煙草植株。
[0014] 上述植物病原黃單胞菌SSbx轉基因煙草的應用，所述^匕基因轉入煙草后在煙草 中穩(wěn)定表達，顯著提高煙草對細菌和病毒病害的抗性。
[0015] 本發(fā)明將SSbx基因通過農(nóng)桿菌介導的方式轉入煙草中，整合到染色體上，獲得了 SSbx轉基因煙草，該SSbx轉基因煙草顯著提高了煙草對細菌病害和病毒病害的抗性，對于 培育抗病煙草品種，具有極大的應用價值。
[0016] 本發(fā)明中所涉及的SSbx轉基因煙草和其提高了煙草抗病性為首次報道。^匕基 因序列可在Xanthomonasresource網(wǎng)站上查詢獲得（http://www.xanthomonasorg)， CaMV35S啟動子和Km基因序列可在NCBI數(shù)據(jù)庫中查詢獲得（http://www.ncbi.nlm.nih. gov)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0017] 圖1為SSbx轉基因載體的構建過程示意圖；
[0018] 圖2為SSbx轉基因煙草的檢測和SSbx基因的表達；
[0019] 圖3為SSbx轉基因煙草生長能力測定；
[0020] 圖4為SSbx轉基因煙草抗病能力測定；
[0021] 圖5為SsbxR基因煙草中防衛(wèi)基因的表達測定。

【具體實施方式】
[0022] 下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。下列實施例中未注明具體條件的實驗 方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等分子克?。簩嶒炇沂謨裕∟ewYork:ColdSpring HarborLaboratoryPress, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0023] 實施例
[0024] 1、ssbx轉基因載體的構建
[0025] 以水稻條斑病菌RS105菌株gDNA為模板，利用引物Ssb-F(BmaHI)(SEQID N0.5):5'-CGGGATCCATGGCCCGCGGCATCAATAAAGI^PSsb-R(XbaI):(SEQIDN0.6):5'CCAAG CTTTCAGAACGGGATATCGTCGTCGGC，通過PCR擴增獲得 552bp的ssbx 基因（SEQIDN0. 1)產(chǎn)物， 測序正確后通過XbaI和BamHI雙酶切，構建在經(jīng)過XbaI和BamHI雙酶切的pCAMBIA2300 載體上，并且使其置于CaMV35S啟動子下，獲得重組載體pCSsbX(圖1A)。重組載體pCSsbX 經(jīng)XbaI和BamHI以及HindIII和SacI雙酶切驗證正確后轉化農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens)EHA105菌株中用于后續(xù)轉基因實驗（圖1B)。
[0026]質粒pCAMBIA2300 和EH105 為公知公用，見文獻Chenetal.，2009。
[0027] 2、ssbx轉基因煙早的犾得和ssbx基因表達的檢測
[0028] 將含有Ssbx轉基因的重組載體pCSsbX的農(nóng)桿菌菌株EHA105活化后，單菌落接種 于2mLYEB液體培養(yǎng)基（含Km50μg/mL和Rif25μg/mL)中，28°C震蕩培養(yǎng)過夜至對數(shù)生 長期，在無菌狀態(tài)下4,OOOrpm離心IOmin收集菌體經(jīng)洗滌后用于感染煙草葉肉愈傷細胞。
[0029]從煙草（Nicotianatobacumcv.Xanthi)完全展開的葉上取0· 5X0. 5cm2 的葉蝶， 經(jīng)70%乙醇中浸泡30sec和浸入30%的次氯酸鈉溶液中5min表面消毒以及無菌水沖洗 后，置于MS培養(yǎng)培養(yǎng)基上25°C黑暗下與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)2-3天。按照葉盤方法獲得再生植 株。再生植株置于煙草生長條件的溫室中培養(yǎng)，獲得轉基因煙草Ttl代種子。
[0030] 農(nóng)桿菌介導的轉基因煙草方法為公知公用，見文獻Horsh，etal.，1985。
[0031] 選取Ttl代煙草植株TSsbl、TSsb-2和TSsb-3,以未轉基因的煙草WT和轉空載體 PCAMBIA2300的煙草EV為對照，按照AxyPrep基因組DNA小量試劑盒（Axygen，USA)提取 gDNA后作為模板，以Ssb-F(BmaHI)(SEQIDNO. 5)和Ssb-R(XbaI)(SEQIDN0. 6)以及引 物Kana-F(SEQIDNO. 7)和Kana-R(SEQIDNO. 8)為引物，分別PCR擴增目標基因ssbx(SEQ IDNO. 1)和Km(SEQIDNO. 4)，發(fā)現(xiàn)僅在TSsb-l、TSsb-2 和TSsb-3 植株中有 552bp的ssbx 基因（圖2A)，確定TSsb-1、TSsb-2和TSsb-3植株中轉入了ssbx基因。
[0032]按照Trizol試劑盒（Invitrogen，USA)提取上述植株的RNA，經(jīng)RNase-freeDNase I試劑盒（TaKaRa，China)去除gDNA后，按照AMVandEx-TaqDNApolymerase(TaKaRa， China)方法合成cDNA并作為模板，以以Ssb-F(BmaHI)(SEQIDNO. 5)和Ssb-R(XbaI) (SEQIDNO·6)以及引物Kana-F(SEQIDNO·7)和Kana-R(SEQIDNO·8)為引物，定量PCR 方法測定ssbx轉基因煙草植株中的ssbx基因的表達。發(fā)現(xiàn)TSsb-I、TSsb-2和TSsb-3植株 中SSbx基因穩(wěn)定表達（圖2B)。
[0033] 將上述植株的gDNA，通過XbaI和BamHI雙酶切，以ssbx基因（SEQIDNO. 1)為 探針，通過Southern雜交，發(fā)現(xiàn)TSsb-I和TSsb-2植株中存在ssbx基因（圖2C)，確認TSsb-I 和TSsb-2為正確的用于后續(xù)實驗的材料。
[0034] 3、SSbx轉基因煙草生長能力測定
[0035]取WT、EV、TSsb-l和TSsb-2植株Ttl代種子50粒催芽育苗，于（25°C，光照/黑暗， 16h/8h)下培養(yǎng)20天后發(fā)現(xiàn)，SSbx轉基因煙草植株生長弱于WT和EV植株（圖3A)。洗根后 測定根長和莖長發(fā)現(xiàn)，Ssbx轉基因煙草根長和莖長顯著短于WT和EV煙草（圖3B、圖3C)。 成株期的Ssbx轉基因煙草高度也低于WT和EV煙草（圖3A)。說明Ssbx基因異源表達后 降低了煙草的生長勢。
[0036] 4、ssbx轉基因煙草抗病能力測定
[0037]待WT、EV和ssbx轉基因煙草生長至6片葉時，將病原細菌Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000的hopQl-1菌株調至I X 105CFU/mL，按照Wei等人（2007)用無針頭注 射器注入煙草葉肉細胞中，在接種〇、1、2、3、4和5天時取注射區(qū)域煙草葉，經(jīng)表面消毒后置 于ImL無菌水中研碎，按照10、10-\ 10-2梯度稀釋，取100 μ L涂板于KB培養(yǎng)基上，于25Γ 下培養(yǎng)3d后統(tǒng)計菌落數(shù)。發(fā)現(xiàn)Ssbx轉基因煙草中hopQl-Ι菌株的生長數(shù)少于WT和EV煙 草，說明Ssbx轉基因煙草提高了抗病性（圖4A)。
[0038]按照Ge et al. (2005)文獻方法，對WT、EV和Ssbx轉基因煙草進行煙草花葉病毒 (TMV)摩擦接種。TMV病毒濃度為6Xl(T3mg/mL，含600目金剛砂少許，用棉簽涂布煙草葉 表面，7天后在三生煙葉上觀察統(tǒng)計TMV產(chǎn)生的枯斑數(shù)。結果發(fā)現(xiàn)，SSbx轉基因煙草產(chǎn)生的 枯斑數(shù)顯著少于WT和EV煙（圖4B)，說明Ssbx基因提高了煙草對TMV病毒的抗性。
[0039] 5、Ssbx轉基因煙草中防衛(wèi)基因的表達測定
[0040]如上述，WT、EV和Ssbx轉基因煙草接種hopQl-Ι菌株后，于接種后的0和8小時， 取注射區(qū)域的煙草組織，按照Trizol試劑盒（InvitrogemUSA)提取上述煙草組織的RNA， 經(jīng)RNase-free DNase I試劑盒（TaKaRa，China)去除gDNA后，按照AMV and Ex-Taq DNA polymerase (TaKaRa，China)方法合成cDNA并作為模板，以Che等人（2013)報道的引物為 引物，1^&1-乜1^?〇?方法比較0和8小時點？1?11、？1?1-13、!1預1、邯1?203<1和361'1基因的 表達量。結果發(fā)現(xiàn)，Ssbx轉基因煙草中上述基因的表達量顯著高于WT和EV煙草（圖5)， 說明ssbx基因表達提尚了煙草的抗性。
[0041]關于農(nóng)桿菌介導的轉基因方法和煙草生長條件：Sohn et al.，Transgenic tobacco expressing the hrpN(EP) gene from Erwinia pyrifoliae triggers defense responses against Botrytis cinerea. Molecular Cells，2007,24 (2) :232-239.
[0042]關于基因重組分子操作和PCR技術：Sambrook J，Russell DW，Molelcular cloning，A Laboratory Manual(3rd ed)，2001，Spring Harbor Laboratory Press。
[0043]關于ssbx基因的特性以及煙草中抗病基因測定：Li et al.，A highly-conserved single-stranded DNA-binding protein in Xanthomonas functions as a harpin-like protein to trigger plant immunity. PLoS ONE,2013,8(2) :e56240〇
[0044]關于hopQl-1菌株以及接種煙草方法：Wei et al.，A Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 mutant lacking the type III effector HopQl-I is able to cause disease in the model plant Nicotiana benthamiana. Plant Journal，2007,51 (I)： 32-46.
[0045]關于TMV接種煙草方法：Ge et al.，Beta-Aminobutyric acid-mediated enhancement of resistance in tobacco against TMV and consideration of its capability in Wounded tobacco plants. Indian J Biochem Biophys，2005,42 (3)： 166-72.
[0046]關于質粒pCAMBIA2300和Ε?105的應用：Chen et al.，Expression of thymosin a I concatemer in transgenic tomato(Solanum lycopersicum)fruits. Biotechnol Appl Biochem. 2009. 52,3032312。
[0047] 序列表 <H0>上海交遘大學 <12_鞫痛黡黌攀廳菌___寧臟響纖靡_ <1修* <170> PaiaitIn version 3.5 <220> I <211>552 <252>DNA <1\>Xanthomonas oryzaepv.oryzicola <220--% <221 > CDS<222>(1M552) <400>1 etewcpg ieteMtw igiMccic gtcggcaaee ligpa?p isepae 雜 I^necce aggccggcal ggcpiciiMegciipgw Iggccaccac tm ?ΙΡΜΙΜCem^sgcaccpglggc ?cgcgtggt gttlitegia 誦 --ctecg幽cpgiie^Cgeaeggpt^piggttllggpiec 纖 acpcMM* ?UteUgga^gigg _ mm§m %?ι?ρ*ι 麵 $4〇 etcccgttctgd 552 <210>2 <211> 1S3<2i2>PRT <2I3>Xantktmonm or^mp￥,or^ieota<220> Ssbx蛋白雇 <221 > CDS <222> (1),.(183) <400>2 Mrt Ala Al* Oly He Asn Lys Val He Leu Val Oiy Asn Leu Gly AsnJ 5 10 15 Asp Pro Asp Thr Lys Tyr Thr Gln Ala G!y Met Ala He Ibr Are V-ai 20 25 Ii Ser Leu Aia Tk Thr Scr Met Aif Lys Asp Aig (51ii Gly Asn Asn GlnM m 45 Giu Aif Thr Glu Trp His Aig Val Val Phe Phe Oly Lys Leu GIy Oiu50 55 60 He Ala Oly Olii T^r Lew Aig Lys Gly Ser Gln￥alTyr VaiCjIuG1j> 65 70 ?5 ? OIu Leu ArgTytAsp Lys Tjt Thr Qly Gln Asp GIy Vai Gla Lys fyr SS M ? Ser Thr Asp He Val Ala Asn Gh Met Leu Met Leu Oly Gl^ Aig Gly Η? IOS HO Olu Gly Gly Oly Gly Cly Met GIy Gly Glu Aig Pro OIn Arg Ser Gln115 120 125 Ak Pro Aif Oln Gln Gln Gfy GIy Cly Gl| Oly Gln Gly Asp GIy GIjf
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【權利要求】
1. 一種植物病原黃單胞菌ssbx轉基因煙草，是將來自稻黃單胞菌的ssbx基因通過農(nóng) 桿菌介導的方式轉入煙草中，獲得ssbx轉基因煙草；所述ssbx基因序列如SEQ ID N0.1所 示，序列長度為552bp;SSbx基因的蛋白質序列如SEQ ID NO. 2所示，編碼183個氨基酸。
2. 權利要求1所述植物病原黃單胞菌ssbx轉基因煙草，其特征在于，所述ssbx基因的 啟動子為CaMV 35S，其序列如SEQ ID NO. 3所示，序列長度為538bp。
3. 權利要求1所述植物病原黃單胞菌ssbx轉基因煙草，其特征在于，所述ssbx轉基因 煙草的篩選標記基因為Km，序列如SEQ ID NO. 4所示，序列長度為792bp。
4. 權利要求1所述植物病原黃單胞菌ssbx轉基因煙草的獲得方法，其特征在于，包括 以下步驟： A、 將來自稻黃單胞菌的ssbx基因構建在轉基因載體pCAMBIA2300上，獲得重組載體 pCSsbX ； B、 將重組載體pCSsbX轉入農(nóng)桿菌EHA105中，再感染煙草葉肉愈傷細胞，在含有卡那霉 素的MS培養(yǎng)基上獲得再生植株； C、 以881^和Km基因為靶標基因，通過PCR和Southern雜交技術對煙草再生植株進行 篩選，獲得ssbx轉基因煙草植株。
5. 權利要求1所述植物病原黃單胞菌ssbx轉基因煙草的應用，其特征在于：所述ssbx基因轉入煙草后在煙草中穩(wěn)定表達，顯著提高煙草對細菌和病毒病害的抗性。
【文檔編號】C12N15/84GK104357481SQ201410691935
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2014年11月25日 優(yōu)先權日:2014年11月25日
【發(fā)明者】陳功友, 鄒麗芳, 孫玉靜, 馬文秀 申請人:上海交通大學