一種毒蛾屬昆蟲的物種鑒別方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種毒蛾屬昆蟲的物種鑒別方法，涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明方法包括如下步驟：找出毒蛾屬每個種線粒體COI基因序列的差異位點，形成毒蛾屬每個種的標準序列；將毒蛾屬待測樣品的線粒體COI基因序列與每個種的標準序列進行比對，取最大相似度值，待測昆蟲隸屬于最大值對應(yīng)的種。本發(fā)明能夠鑒定毒蛾屬的昆蟲，操作簡單、準確性高、耗時短、特異性高，為毒蛾屬昆蟲的鑒定提供技術(shù)支撐。使用線粒體COI基因序列的差異位點規(guī)律作為種的鑒定特征，為物種建立身份證，準確區(qū)分近似種。本發(fā)明取待測序列各子序列依次與標準序列進行比對打分，更加合理、準確、嚴謹。
【專利說明】-種毒蛾屬昆蟲的物種鑒別方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種毒蛾屬昆蟲的物種鑒別方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 舞毒蛾（Lymantria dispar，縮寫為 L. dispar)屬鱗翅目（Lepidoptera)毒蛾科 (Lymantriidae)毒蛾屬（Lymantria)，是一種雜食性農(nóng)林害蟲。根據(jù)地理分布、生物學習性 和形態(tài)特征，舞毒蛾（L. dispar)現(xiàn)在被分為亞洲亞種（L. dispar asiatica Vnukovskii)、 歐洲亞種（L. dispar dispar Linnaeus)和日本亞種（L. dispar japonica Motschulsky)。
[0003] 由于亞洲型舞毒蛾成蟲具飛行能力且寄主范圍比歐洲型大等原因，美國有關(guān)部 門認為亞洲型舞毒蛾比歐洲型舞毒蛾對其威脅更大，為了防止亞洲型舞毒蛾傳入美國，從 1991年開始，美國在其港口及附近地區(qū)對該蟲開展監(jiān)測，并先后對來自俄羅斯遠東、日本高 風險港口的船舶實施特別檢疫措施。2009年，北美植物保護組織（NAPP0)通過了《來自亞 洲舞毒蛾疫區(qū)船舶及貨物操作管理指南》（NAPP0植物衛(wèi)生措施區(qū)域標準第33號），對來自 中國相關(guān)港口的船舶也實施特別檢疫措施。隨后，墨西哥、澳大利亞、新西蘭等國也對中國 船舶采取了同樣做法。特別檢疫對象也從單一的舞毒蛾擴大到模毒蛾、櫟毒蛾等毒蛾屬昆 蟲。為此，我國必須克服相關(guān)技術(shù)問題，盡快研究出舞毒蛾及毒蛾屬內(nèi)其它近似種的鑒定方 法，加快通關(guān)速度，避免貿(mào)易摩擦，以適應(yīng)對外貿(mào)易發(fā)展的需要。
[0004] 目前，毒蛾屬昆蟲鑒定還是依賴成蟲形態(tài)學方法。船舶上經(jīng)常發(fā)現(xiàn)的是幼蟲和卵， 用形態(tài)學方法很難準確鑒定，這對口岸舞毒蛾的檢驗檢疫工作增加了難度。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種毒蛾屬昆蟲的物種鑒別方法，該方法能夠鑒定毒蛾屬昆 蟲，操作簡單、準確性高、耗時短、特異性高。
[0006] 本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案予以實現(xiàn)。
[0007] -種毒蛾屬昆蟲的物種鑒別方法，包括以下步驟：
[0008] (1)下載毒蛾屬昆蟲的線粒體C0I基因序列，進行多重序列比對，將所有序列轉(zhuǎn)化 為長度為U bp的序列，找出毒蛾屬每個種的差異位點，形成毒蛾屬每個種的標準序列；所 述標準序列保留每個種的差異位點，其他位點用"N"補足使其長度為U bp ;所述每個種的 差異位點是指線粒體C0I基因序列在種內(nèi)保守、種間差異的堿基位點；
[0009] (2)擴增待測樣品的線粒體C0I基因，進行序列檢測，所述待測樣品的線粒體C0I 基因序列長度為L 2bp ;在所述待測樣品線粒體C0I基因序列的3'端補充"M"至長度為 (Li+I^-Ijbp，得到待比對序列；
[0010] (3)將待比對序列與每個種的標準序列進行比對，計算相似度S ;所述S (%> =

【權(quán)利要求】
1. 一種毒蛾屬昆蟲的物種鑒別方法，其特征在于該方法包括以下步驟： ⑴下載毒蛾屬昆蟲的線粒體COI基因序列，進行多重序列比對，將所有序列轉(zhuǎn)化為長 度為Libp的序列，找出毒蛾屬每個種的差異位點，形成毒蛾屬每個種的標準序列；所述標準 序列保留每個種的差異位點，其他位點用"N"補足使其長度為Ubp;所述每個種的差異位點 是指線粒體COI基因序列在種內(nèi)保守、種間差異的堿基位點； (2) 擴增待測樣品的線粒體COI基因，進行序列檢測，所述待測樣品的線粒體COI基因 序列長度為L2bp;在所述待測樣品線粒體COI基因序列的3'端補充"M"至長度為（LJL2-I) bp，得到待比對序列； (3) 將待比對序列與每個種的標準序列進行比對，計算相似度S;所述S(%) Nm =ixlOO%，Nm表示待比對序列與每個種的標準序列堿基匹配的位點數(shù)，Nt表示每個種 bit 的標準序列中除"N"外的堿基數(shù)量。 (4) 待測樣品隸屬于與最大相似度S相對應(yīng)的種。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述毒蛾屬昆蟲的物種鑒別方法，其特征在于，步驟（3)的具體方法 如下：設(shè)η為序列中堿基的位置；首先，η取1?L1中的所有自然數(shù)，待比對序列取第1至 第η位堿基形成待比對序列的第η個子序列，每個種的標準序列取第Q-n+l至第L1位堿基 形成每個種標準序列的第η個子序列，將待比對序列的第η個子序列與每個種標準序列的 ] 第η個子序列進行比對，根據(jù)相似度S= 1X100%計算相似度S，其中Nml表示待比對序 Nt 列的第η個子序列與每個種標準序列的第η個子序列堿基匹配的位點數(shù)，Nt表示每個種的 標準序列中除"Ν"外的堿基數(shù)量；隨后，η取2?L2中的所有自然數(shù)，待比對序列取第η至 第!!+L1-I位堿基形成待比對序列的第!!+L1-I個子序列，將待比對序列的第!!+L1-I個子序 PJffi1J 列與每個種的標準序列進行比對，根據(jù)相似度S= 17^x100%計算相似度S，其中Nm2表 iVl 示待比對序列的第!!+L1-I個子序列與每個種的標準序列堿基匹配的位點數(shù)，Nt表示每個種 的標準序列中除"N"外的堿基數(shù)量。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述一種毒蛾屬昆蟲的物種鑒別方法，其特征在于步驟（1)從BOLD 數(shù)據(jù)庫下載毒蛾屬昆蟲的線粒體COI基因序列。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述一種毒蛾屬昆蟲的物種鑒別方法，其特征在于步驟（1)中的多 重比對使用的軟件為MEGA軟件包中ClustalW軟件。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種毒蛾屬昆蟲的物種鑒別方法，其特征在于步驟 (2)中采用上、下游引物擴增待測樣品的線粒體COI基因，所述上游引物的序列為： 5 ' -ATTCAACCAATCATAAAGATATTGG-3 '，所述下游引物的序列為：5 '-TAAACTTCTGGATGTCCAAAA AATCA-3，。
【文檔編號】C12Q1/68GK104450898SQ201410693309
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年11月26日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月26日
【發(fā)明者】安榆林, 葉兼菱, 錢路, 徐梅, 楊曉軍, 伏建國, 吳晶, 鄭斯竹 申請人:江蘇出入境檢驗檢疫局動植物與食品檢測中心