基于類石墨相碳化氮納米材料的熒光傳感器的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種基于類石墨相碳化氮納米材料的熒光傳感器的制備方法，將類石墨相碳化氮納米材料，結(jié)合酶切循環(huán)信號(hào)放大技術(shù)，制成熒光傳感器。該熒光傳感器包括類石墨相碳化氮納米片（g-C3N4-NF），Ag+，Nb.BsmI切刻內(nèi)切酶，探針基因、靶標(biāo)基因（Cerb B-2相關(guān)基因短片段）。該熒光傳感器經(jīng)雜交、酶切水解、再雜交的循環(huán)過(guò)程，使得一條靶標(biāo)基因即可釋放出多個(gè)發(fā)夾結(jié)構(gòu)探針基因上的Ag+，使得溶液中游離的Ag+量增多，導(dǎo)致碳化氮的熒光猝滅程度增強(qiáng)，熒光信號(hào)明顯減弱。通過(guò)這種多次循環(huán)信號(hào)放大的技術(shù)，可實(shí)現(xiàn)對(duì)靶標(biāo)基因的高靈敏度檢測(cè)。
【專利說(shuō)明】基于類石墨相碳化氮納米材料的熒光傳感器的制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于熒光傳感器的制備領(lǐng)域，具體涉及一種基于類石墨相碳化氮納米材料的熒光傳感器的制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002]乳腺癌是全世界女性發(fā)病率最高的惡性腫瘤之一。早期診斷是提高乳腺癌治愈率的關(guān)鍵。到目前為止，乳腺癌診斷的基本方法主要有乳腺鉬靶、乳腺B超、動(dòng)態(tài)增強(qiáng)核磁共振等。然而以上檢查方法或容易造成漏診；或操作繁瑣、耗時(shí)、設(shè)備昂貴，難以推廣應(yīng)用于大規(guī)模的乳腺癌普查。而作為乳腺癌診斷的金標(biāo)準(zhǔn)一基于穿刺活檢的病理組織學(xué)診斷法具有創(chuàng)傷性，不僅使病人身體疼痛，還會(huì)引起病人因長(zhǎng)時(shí)間等待檢測(cè)報(bào)告所產(chǎn)生的焦慮和恐懼。因此，研宄一種更準(zhǔn)確、靈敏、經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便、更人性化的無(wú)創(chuàng)檢測(cè)新技術(shù)，并將其用于臨床乳腺癌的早期診斷無(wú)疑具有重要的意義。腫瘤標(biāo)志物在正常組織或良性疾病中不產(chǎn)生或產(chǎn)生的量極少。
[0003]在腫瘤發(fā)生的早期，當(dāng)其他檢查還未發(fā)現(xiàn)時(shí)，血液中腫瘤標(biāo)志物已有不同程度的升高，因此，具有無(wú)創(chuàng)特點(diǎn)的腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)技術(shù)是目前有效的早期發(fā)現(xiàn)無(wú)癥狀腫瘤的方法。人類表皮生長(zhǎng)因子受體2 (Cerb B-2)是一種常見(jiàn)的乳腺癌腫瘤標(biāo)記物，它是一種原癌基因，又稱HER-2或neu，它是表皮生長(zhǎng)因子家族中主要成員，其蛋白產(chǎn)物具有酪氨酸激酶活性，能夠啟動(dòng)自身磷酸化過(guò)程，可促使乳腺腫瘤細(xì)胞向惡性轉(zhuǎn)化，研宄表明，Cerb B-2基因的檢測(cè)在乳腺癌的確診分期、監(jiān)測(cè)和判斷預(yù)后中起著重要的作用。可是一般在乳腺癌的早期，Cerb B-2基因的濃度在實(shí)際樣本中一般較低，直接進(jìn)行檢測(cè)的效果差，所以近年來(lái)，應(yīng)用信號(hào)放大檢測(cè)技術(shù)來(lái)提高檢測(cè)靈敏度受到越來(lái)越多的關(guān)注。早期的信號(hào)放大是利用聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)(PCR)，此項(xiàng)技術(shù)從1985年問(wèn)世以來(lái)被廣泛的應(yīng)用在臨床試驗(yàn)中，可是具有易造成假陽(yáng)性、易被污染等缺點(diǎn)。滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)(RCA)和生物條碼技術(shù)是近年來(lái)發(fā)展的通過(guò)放大信號(hào)來(lái)檢測(cè)DNA的新方法，它們雖然大大的提高了檢測(cè)的靈敏度，但是仍然存在操作過(guò)程復(fù)雜、費(fèi)用高等缺點(diǎn)。因此，我們需要尋找一種簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、靈敏的方法來(lái)檢測(cè)實(shí)際樣本中的Cerb B-2基因。
[0004]近年來(lái)，利用切刻內(nèi)切酶輔助信號(hào)放大的方法用在DNA的檢測(cè)引起越來(lái)越多的學(xué)者關(guān)注。切刻內(nèi)切酶是一種特殊的限制性核酸內(nèi)切酶，它能夠識(shí)別雙鏈DNA中的特異核酸序列，只切割其中的一條DNA鏈。這類酶被發(fā)現(xiàn)后，引起了科研工作者們的廣泛關(guān)注，近年來(lái)，已有一些學(xué)者利用切刻內(nèi)切酶輔助信號(hào)放大技術(shù)用于DNA的檢測(cè)，雖然這種技術(shù)有效的提高了檢測(cè)的靈敏度，但是由于這些方法需要使用分子信標(biāo)技術(shù)，因此存在操作復(fù)雜、價(jià)格昂貴等缺點(diǎn)。因此，在此基礎(chǔ)上有必要繼續(xù)研宄一種既簡(jiǎn)便又經(jīng)濟(jì)的生物傳感新方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種基于類石墨相碳化氮納米材料的熒光傳感器的制備方法。本發(fā)明利用類石墨相碳化氮納米片在Ag+、DNA探針和目標(biāo)序列存在下的熒光“關(guān)-開(kāi)-關(guān)”的性質(zhì)，可以實(shí)現(xiàn)DNA的靈敏特異性檢測(cè)，檢測(cè)限低，經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便、實(shí)用。
[0006]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:
基于類石墨相碳化氮納米材料的熒光傳感器的制備方法，包括以下步驟:
(1)將50UL I μ M探針基因與10 UL 10 mM的Ag+溶液混合，用Tris-HNO 3緩沖液稀釋至100 μ L，混勻并反應(yīng)Ih;
(2)將混合體系加入到900UL的類石墨相碳化氮納米片混懸液中，混勻，測(cè)其熒光強(qiáng)度；
(3)繼續(xù)往上述體系中加入含有不同濃度的靶標(biāo)基因和10U的Nb.BsmI切刻切割酶的混合體系，混勻反應(yīng)lh，檢測(cè)熒光強(qiáng)度的變化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)附圖4，由圖可知，一定范圍內(nèi)，隨著目標(biāo)DNA濃度增加，發(fā)夾結(jié)構(gòu)的探針基因因雜交繼而酶切作用所釋放出的Ag+量越多，猝滅碳化氮的熒光程度越強(qiáng)，熒光信號(hào)越弱；碳化氮的發(fā)射波長(zhǎng)為396 nm。測(cè)定的條件:測(cè)定介質(zhì)為Tris-HNO3緩沖溶液，pH =7.9。
[0007]依據(jù)上述方法得到熒光傳感器。
[0008]所述的類石墨相碳化氮納米片的制備方法為:
(1)微波合成類石墨相碳化氮粉末:往微波管中加入2mL甲酰胺，置于微波合成儀中，180-200 °C下反應(yīng)30 min，得到黑色的類石墨相碳化氮，用雙蒸水洗凈，真空干燥得類石墨相碳化氮黑色粉末；
(2)納米片的制備:用去離子水溶解類石墨相碳化氮，超聲剝離24h ;將超聲后的液體轉(zhuǎn)移至離心管中，置于離心機(jī)中15000 r/min離心I h，取上清液得到類石墨相碳化氮納米片混懸液。
[0009]步驟(I)中所述的探針基因其序列為5’ -CCCCCCAACTGCATTCCAACAAGTCTCCCCCC-3’(購(gòu)于上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)。
[0010]步驟(3)中所述的靶標(biāo)基因其序列為5’-AGACTTGTTGGAATGCAGTT-3’(購(gòu)于上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)。
[0011]步驟(I)中所述的Tris-HNO3 緩沖液是由 25 mM Tris,50 mM NaNOjP 15 mM MgNO3配制而成的，并用5 mol/L的HNO3調(diào)至pH 7.9。
[0012]所述的制備方法制得的熒光傳感器用于乳腺癌相關(guān)基因片段的檢測(cè)，熒光分析法測(cè)定參數(shù):λεχ=330 nm, λ em=396 nm，激發(fā)和發(fā)射光狹縫值均為5 nm，PMT檢測(cè)電壓為600Vo其線性范圍為:5 fM~0.1 ρΜο回歸方程為F=183.97744 — 1.52594C，線性相關(guān)系數(shù)r為0.9970，該方法對(duì)特定序列DNA的最低檢測(cè)下限為0.2 fM。具體檢測(cè)方法為:在含有探針基因、Ag+和類石墨相碳化氮納米片的混合體系中加入含有一定濃度的互補(bǔ)或單堿基錯(cuò)配或不互補(bǔ)DNA和10 U Nb.BsmI切刻內(nèi)切酶的混合液，進(jìn)行雜交反應(yīng)；上述反應(yīng)液用熒光分析法檢測(cè)。
[0013]本發(fā)明采用微波合成法制備類石墨相碳化氮納米材料，并結(jié)合酶切循環(huán)信號(hào)放大技術(shù)制成熒光傳感器，用于乳腺癌Cerb B-2相關(guān)基因片段的檢測(cè)。其具體機(jī)理為:Ag+可與類石墨相碳化氮納米片結(jié)合并使其熒光猝滅，即熒光處于“關(guān)”的狀態(tài)。探針基因加入后，Ag+與探針基因上的胞啼啶共價(jià)結(jié)合形成更穩(wěn)定的C- Ag+-C錯(cuò)配結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致Ag+與類石墨相碳化氮納米片的結(jié)合量減少，熒光猝滅程度低，即熒光處于“開(kāi)”的狀態(tài)。當(dāng)再加入互補(bǔ)靶標(biāo)基因時(shí)，其與探針基因雜交形成雙鏈DNA，經(jīng)過(guò)Nb.BsmI切刻內(nèi)切酶切割循環(huán)，發(fā)夾結(jié)構(gòu)探針基因上的Ag+完全釋放出來(lái)，使得Ag +與類石墨相碳化氮納米片的結(jié)合量增加，熒光猝滅程度高，即熒光處于“關(guān)”的狀態(tài)，從而成功實(shí)現(xiàn)酶切循環(huán)信號(hào)放大技術(shù)的熒光生物傳感器的研制。通過(guò)這種循環(huán)信號(hào)放大的技術(shù)，可實(shí)現(xiàn)對(duì)Cerb B-2相關(guān)基因的高靈敏度檢測(cè)，并有望推廣應(yīng)用于其他類型腫瘤的早期診斷及篩選抗腫瘤新藥工作中，因而本發(fā)明具有巨大的潛在應(yīng)用價(jià)值和深遠(yuǎn)的意義。
[0014]本發(fā)明的有益效果在于:
1)本發(fā)明采用微波合成法制得的類石墨相碳化氮納米材料具有較高的水溶性和較強(qiáng)的熒光信號(hào)，用于熒光傳感器中能增強(qiáng)熒光信號(hào)；
2)利用類石墨相碳化氮納米片在Ag+、DNA探針和目標(biāo)序列存在下的熒光“關(guān)-開(kāi)-關(guān)”的性質(zhì)，可以實(shí)現(xiàn)DNA的靈敏特異性檢測(cè)；
3)在最佳條件下，該熒光傳感器的線性范圍為5fM~0.1 pM，檢測(cè)限達(dá)到0.2 fM，且具有良好的選擇性。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0015]圖1是類石墨相碳化氮納米材料的原子力顯微鏡圖；
圖2是類石墨相碳化氮納米材料的傅里葉變換紅外光譜(FTIR)圖；
圖3為加入Ag+或不同的DNA雜交后類石墨相碳化氮熒光信號(hào)的變化，圖中:(a)碳化氮的焚光信號(hào)，Cd)碳化氮中加入Ag+的焚光信號(hào)，(b)碳化氮中加入Ag + 和探針DNA后的焚光信號(hào)，(c)碳化氮中加入Ag+和探針DNA后再加入互補(bǔ)革E標(biāo)DNA的焚光信號(hào)；
圖4為本發(fā)明的熒光信號(hào)檢測(cè)圖。

【具體實(shí)施方式】
[0016]本發(fā)明用下列實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不限于下列實(shí)施例。
[0017]本發(fā)明的熒光傳感器包括類石墨相碳化氮納米片(g-C3N4_NF)，Ag+，Nb.BsmI切刻內(nèi)切酶，探針基因。在探針基因溶液中加入Ag+，Ag+與探針基因上的胞嘧啶共價(jià)結(jié)合形成更穩(wěn)定的C-Ag+-C錯(cuò)配結(jié)構(gòu)，使得探針基因回折形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。繼續(xù)加入類石墨相碳化氮納米片混懸液，由于溶液中游離的Ag+減少甚至幾乎為零，導(dǎo)致Ag+與碳化氮的結(jié)合量減少，所以碳化氮的熒光猝滅程度低，熒光信號(hào)較強(qiáng)。當(dāng)互補(bǔ)靶標(biāo)基因存在時(shí)，其與探針基因雜交形成雙鏈DNA，導(dǎo)致探針基因的發(fā)夾結(jié)構(gòu)打開(kāi)并釋放出Ag+。同時(shí)，雜交所形成的DNA雙鏈可產(chǎn)生Nb.BsmI切刻內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，Nb.BsmI切刻內(nèi)切酶切割雙鏈中含有特殊序列的探針基因鏈，使得探針基因被酶水解，靶標(biāo)基因被釋放出來(lái)并可繼續(xù)與下一個(gè)探針基因雜交。由此所形成的雜交、酶切水解、再雜交的循環(huán)過(guò)程，使得一條靶標(biāo)基因即可釋放出多個(gè)發(fā)夾結(jié)構(gòu)探針基因上的Ag+，使得溶液中游離的Ag+量增多，導(dǎo)致碳化氮的熒光猝滅程度增強(qiáng)，熒光信號(hào)明顯減弱。通過(guò)這種多次循環(huán)信號(hào)放大的技術(shù)，可實(shí)現(xiàn)對(duì)靶標(biāo)基因的高靈敏度檢測(cè)。
[0018]實(shí)施例1
I)類石墨相碳化氮納米片的制備:往微波管中加入2 mL甲酰胺，置于微波合成儀中，190 °C下反應(yīng)30 min，得到黑色的類石墨相碳化氮，用雙蒸水洗凈，真空干燥即得類石墨相碳化氮黑色粉末。用去離子水溶解類石墨相碳化氮，超聲剝離24 h;將超聲后的液體轉(zhuǎn)移至離心管中，置于離心機(jī)中15000 r/min離心I h，取上清液即可得到類石墨相碳化氮納米片(g-C3N4-NF)混懸液；
2 )探針基因:5’ -CCCCCCAACTGCATTCCAACAAGTCTCCCCCC-3’ (由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成)；靶標(biāo)基因:5’-AGACTTGTTGGAATGCAGTT-3’為特定序列DNA (由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成的Cerb B-2相關(guān)基因短片段)；將探針基因和靶標(biāo)基因分別溶于TriS-HNO3緩沖液中制成100 μΜ的探針溶液和100 μΜ的靶標(biāo)溶液；
3)50 UL I μ M探針基因與10 UL 10 mM的Ag+溶液混合，用Tris-HNO 3緩沖液稀釋至100 μ L，混勻并反應(yīng)I h。將此混合體系加入到900 μ L的類石墨相碳化氮納米片懸浮液中，混勻，測(cè)其熒光強(qiáng)度。繼續(xù)往上述體系中加入50 UL I μΜ靶標(biāo)基因和10 U的Nb.BsmI切刻切割酶的混合液，混勻反應(yīng)lh，檢測(cè)其熒光強(qiáng)度的變化。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知(見(jiàn)附圖3)，當(dāng)Ag+不存在時(shí)，碳化氮的熒光信號(hào)較強(qiáng)(a);Ag+存在時(shí)，與碳化氮的CNj^合從而使得碳化氮的熒光猝滅，熒光信號(hào)明顯減弱(d)。當(dāng)探針基因加入后，熒光信號(hào)增強(qiáng)(b)，這是由于Ag+與探針基因上的胞啼啶共價(jià)結(jié)合形成更穩(wěn)定的C- Ag +-C錯(cuò)配結(jié)構(gòu)，使得Ag+與碳化氮的結(jié)合量減少。當(dāng)互補(bǔ)靶標(biāo)基因存在時(shí)，熒光信號(hào)明顯減弱(c)，這是由于靶標(biāo)基因與探針基因互補(bǔ)雜交形成雙鏈DNA，導(dǎo)致探針基因的發(fā)夾結(jié)構(gòu)打開(kāi)并釋放出Ag+，使得Ag+與碳化氮的結(jié)合量增多；同時(shí)，雜交所形成的DNA雙鏈可產(chǎn)生Nb.BsmI切刻內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，Nb.BsmI切刻內(nèi)切酶切割雙鏈中含有特殊序列的探針基因鏈，使得探針基因被酶水解，靶標(biāo)基因被釋放出來(lái)并可繼續(xù)與下一個(gè)探針基因雜交。
[0019]以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，凡依本發(fā)明申請(qǐng)專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范圍。
【權(quán)利要求】
1.基于類石墨相碳化氮納米材料的熒光傳感器的制備方法，其特征在于:包括以下步驟: (1)將50UL I μ M探針基因與10 UL 10 mM的Ag+溶液混合，用Tris-HNO 3緩沖液稀釋至100 μ L，混勻并反應(yīng)Ih; (2)將混合體系加入到900UL的類石墨相碳化氮納米片混懸液中，混勻，測(cè)其熒光強(qiáng)度； (3)繼續(xù)往上述體系中加入含有不同濃度的靶標(biāo)基因和10U的Nb.BsmI切刻切割酶的混合體系，混勻反應(yīng)lh，檢測(cè)熒光強(qiáng)度的變化。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于類石墨相碳化氮納米材料的熒光傳感器的制備方法，其特征在于:所述的類石墨相碳化氮納米片的制備方法為: (1)微波合成類石墨相碳化氮粉末:往微波管中加入2mL甲酰胺，置于微波合成儀中，180-200 °C下反應(yīng)30 min，得到黑色的類石墨相碳化氮，用雙蒸水洗凈，真空干燥得類石墨相碳化氮黑色粉末； (2)納米片的制備:用去離子水溶解類石墨相碳化氮，超聲剝離24h ;將超聲后的液體轉(zhuǎn)移至離心管中，置于離心機(jī)中15000 r/min離心I h，取上清液得到類石墨相碳化氮納米片混懸液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于類石墨相碳化氮納米材料的熒光傳感器的制備方法，其特征在于:步驟(I)中所述的探針基因其序列為5’ -CCCCCCAACTGCATTCCAACAAGTCTCCCCCC-3，。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于類石墨相碳化氮納米材料的熒光傳感器的制備方法，其特征在于:步驟(3)中所述的靶標(biāo)基因其序列為5’ -AGACTTGTTGGAATGCAGTT-3’。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于類石墨相碳化氮納米材料的熒光傳感器的制備方法，其特征在于:步驟(I)中所述的Tris-HNO3緩沖液是由25 mM Tris,50 mM NaNOjP 15 mMMgNO3配制而成的，并用5 mo I/L的HNO 3調(diào)至pH 7.9。
6.一種如權(quán)利要求1所述的制備方法制得的熒光傳感器的應(yīng)用，其特征在于:用于乳腺癌相關(guān)基因片段的檢測(cè)。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104480201SQ201410699219
【公開(kāi)日】2015年4月1日 申請(qǐng)日期:2014年11月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月28日
【發(fā)明者】陳敬華, 李春艷, 趙燕蘋, 林佳, 劉智晶, 吳冬枝, 蔡淑賢, 羅敏 申請(qǐng)人:福建醫(yī)科大學(xué)