一株降解除草劑的細菌及其用途
【專利摘要】本發(fā)明公開了一株降解除草劑的細菌及其用途。該降解除草劑的細菌是根瘤菌(Rhizobium sp.)198-L-30，其在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏編號為CGMCC No.9864。本發(fā)明提供的根瘤菌(Rhizobium sp.)198-L-30 CGMCC No.9864在無機鹽培養(yǎng)基中7天對100mg/L普施特的降解率達到93.40％；對50mg/L乙草胺降解率達到88.44％；對100mg/L氯嘧磺隆降解率達到41.15％；對100mg/L雜草焚的降解率達到12.28％。這表明該菌株能降解除草劑普施特、乙草胺、氯嘧磺隆和雜草焚。CGMCC No986420141028
【專利說明】一株降解除草劑的細菌及其用途

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及微生物領域中一株可以降解除草劑的細菌及其用途，所述除草劑可為 普施特、乙草胺、氯嘧磺隆和雜草焚中的至少一種。

【背景技術】
[0002] 普施特，又名咪草煙，英文名稱Pursuit (imazethapyr-ammonium),化學名稱 (RS)-5-乙基-2-(4-異丙基-4-甲基-5-氧代-2-咪唑啉-2-基）煙酸。普施特是咪唑啉 酮類除草劑，是側鏈氨基酸合成抑制劑，芽前或芽后均可施用，對大豆和其他豆科植物農田 的禾本科雜草和某些闊葉雜草如莧菜、寥、藜、龍葵、蒼耳、稗草、狗尾草、馬唐、黍等有優(yōu)異 的防治效果。
[0003] 乙草胺，英文通用名稱acetochlor，化學名稱是2-乙基-6甲基-N-乙氧基甲 基-α-氯代乙酰替苯胺。乙草胺是內吸性酰胺類除草劑，是選擇性的芽前除草劑。能被雜 草的幼芽和幼根吸收，抑制雜草蛋白質合成，而使雜草死亡。主要用于大豆、花生、玉米、棉 花等作物防除一年生禾本科雜草和部分闊葉雜草，對大豆菟絲子有良好防效，對多年生雜 草無效。
[0004] 氯啼磺隆，英文通用名稱chlorimuron-ethyl，化學名稱2-(4-氯-6-甲氧基啼 啶-2-基氨基甲酰氨基磺酰基）苯甲酸甲酯。氯嘧磺隆是超高效的磺酰脲類除草劑，作用靶 標為植物體內的ALS(乙酰乳酸合成酶），抑制支鏈氨基酸纈氨酸、異亮氨酸的生物合成，導 致底物α - 丁酮積累，阻礙細胞分裂間期DNA合成，使有絲分裂停止，細胞不能正常生長。氯 嘧磺隆可被植物的根、莖、葉吸收，在植物體內進行上下傳導，是選擇性芽前、芽后除草劑， 主要用于大豆等農田，防除闊葉雜草和某些莎草科及禾本科雜草。
[0005] 雜草焚，又名三氟羧草醚，英文名稱acifluorfen，化學名稱5-(2-氯-α，α， α -三氟對甲苯氧基）2-硝基苯甲酸。雜草焚是二苯醚類除草劑，屬接觸性除草劑，是原卟 啉氧化酶抑制劑。通常采用25 %水劑進行大豆苗前表土處理及苗后經葉噴霧，可有效防 除大豆田闊葉雜草如蒼耳、苘麻、龍葵、莧、藜、寥、牽牛、豚草、曼陀羅、馬齒莧、鐵莧菜、鬼針 草、鼬瓣花、鴨跖草等，苗后早期處理也可防除包括狗尾草在內的一年生禾本科雜草。噴藥 后，大豆會不同程度受害，表現為葉片黃化、皺縮、褐變等，但6?7天后恢復正常。
[0006] 普施特和氯嘧磺隆為長殘效除草劑，優(yōu)點是除草效果好、殺草譜寬、用藥量少、使 用方便、用藥成本低，但它們在土壤中殘留時間長，一般可達2 - 3年，對后茬作物如甜菜、 馬鈴薯、瓜類、高梁、油菜、玉米等都會產生不同程度的藥害，使植物生長緩慢、生長點壞死、 分枝及莖基部老化、節(jié)間縮短、植株矮化、成熟期推遲，甚至導致作物死亡。主要表現為：一 是在黑龍江、吉林、內蒙古一些地方把大豆田改為水田，種植水稻受害嚴重，甚至絕產；二是 除草劑施后3 - 4年仍有藥害，導致甜菜種植業(yè)下滑；三是經濟作物發(fā)展受影響，白瓜籽、向 日葵、馬鈴薯、亞麻和蔬菜等受到傷害，嚴重者基地受毀；四是在使用過氯嘧磺隆的大豆田 中再種植向日葵，將會導致后茬向日葵大面積受害絕產。
[0007] 乙草胺和雜草焚半衰期較短，一直被認為是一種低毒的環(huán)境友好型農藥，但近年 來頻繁、過量或使用不當，對農田土壤和地下水等造成了不同程度的污染，對后茬作物的危 害也越來越嚴重。研究表明，在環(huán)境中大量施用乙草胺和雜草焚造成一定的殘留毒性，其在 地下水、地表水中可以殘留數年，進入到環(huán)境中通過食物鏈在生物體內不斷富集，對魚類有 較強的毒性，對環(huán)境污染很大。尤其乙草胺可以引起生物體的內分泌紊亂，造成不育、不正 常的性別差異甚至致癌，已被美國環(huán)保局定為致癌物。
[0008] 自然界除草劑殘留的降解主要依靠土壤中微生物來完成，但自然降解十分緩慢。 因此，有針對性地篩選高效微生物菌株，研制微生物修復劑，通過人工接種加速土壤除草劑 殘留的降解消除農田除草劑殘留藥害是一項十分必要的工作和切實可行的途徑。


【發(fā)明內容】

[0009] 本發(fā)明所要解決的技術問題是如何降解除草劑，所述除草劑可為普施特、乙草胺、 氯嘧磺隆和雜草焚中的至少一種。
[0010] 為解決上述技術問題，本發(fā)明提供了一株可以降解除草劑的細菌，所述除草劑可 為普施特、乙草胺、氯嘧磺隆和雜草焚中的至少一種。
[0011] 本發(fā)明提供的細菌是根瘤菌（Rhizobium sp. U98-L-30,該菌株已于2014年10月 28日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（簡稱CGMCC，地址為：北京市 朝陽區(qū)北辰西路1號院3號），保藏編號為CGMCC No. 9864。
[0012] 本發(fā)明的另一個目的是提供一種菌劑，該菌劑的活性成分為所述的根瘤菌 (Rhizobium sp.)198-L-30CGMCC No. 9864。
[0013] 上述菌劑可為下述1)或2)所述菌劑：
[0014] 1)用于降解除草劑普施特、乙草胺、氯嘧磺隆和雜草焚中至少一種的菌劑；
[0015] 2)用于修復土壤除草劑普施特、乙草胺、氯嘧磺隆和雜草焚中至少一種污染的菌 劑。
[0016] 所述菌劑還可以包括載體。所述載體可為固體載體或液體載體。所述固體載體可 為礦物材料、植物材料或高分子化合物；所述礦物材料可為粘土、滑石、高嶺土、蒙脫石、白 碳、沸石、硅石和硅藻土中的至少一種；所述植物材料可為玉米粉、豆粉和淀粉中的至少一 種；所述高分子化合物可為聚乙烯醇和/或聚二醇。所述液體載體可為有機溶劑、植物油、 礦物油或水；所述有機溶劑可為癸烷和/或十二烷。所述菌劑中，所述活性成分可以以被培 養(yǎng)的活細胞、活細胞的發(fā)酵液、細胞培養(yǎng)物的濾液或細胞與濾液的混合物的形式存在。所述 組合物的劑型可為多種劑型，如液劑、乳劑、懸浮劑、粉劑、顆粒劑、可濕性粉劑或水分散粒 劑。
[0017] 根據需要，所述菌劑中還可添加表面活性劑（如吐溫20、吐溫80等）、粘合劑、穩(wěn) 定劑（如抗氧化劑）、pH調節(jié)劑等。
[0018] 所述的根瘤菌（Rhizobium sp.) 198-L-30CGMCC No. 9864 或以根瘤菌（Rhizobium sp.) 198-L-30CGMCC No. 9864為活性成分的菌劑在降解除草劑普施特、乙草胺、氯嘧磺隆和 雜草焚中至少一種的應用也屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0019] 所述的根瘤菌（Rhizobium sp.) 198-L-30CGMCC No. 9864 或以根瘤菌（Rhizobium sp.) 198-L-30CGMCC No. 9864為活性成分的菌劑在修復土壤除草劑普施特、乙草胺、氯嘧磺 隆和雜草焚中至少一種污染中的應用也屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0020] 本發(fā)明的再一個目的是提供一種培養(yǎng)根瘤菌（Rhizobium sp.) 198-L-30CGMCC No. 9864的方法。
[0021] 本發(fā)明所提供的培養(yǎng)根瘤菌（Rhizobium sp.) 198-L-30CGMCC No. 9864的方法，包 括將根瘤菌（Rhizobium sp.)198-L-30CGMCC No. 9864在用于培養(yǎng)根瘤菌的培養(yǎng)基中培養(yǎng) 的步驟。
[0022] 本發(fā)明的又一個目的是提供一種以根瘤菌（Rhizobium sp.)198-L-30CGMCC No. 9864為活性成分的菌劑的制備方法。
[0023] 本發(fā)明所提供上述菌劑的制備方法，包括如下步驟：將所述的根瘤菌（Rhizobium sp.) 198-L-30CGMCC No. 9864作為活性成分，得到所述菌劑。
[0024] 本發(fā)明是從長期受到除草劑普施特、乙草胺、氯嘧磺隆和雜草焚污 染的農田采集土樣，并從中分離篩選得到的除草劑降解菌根瘤菌（Rhizobium sp.) 198-L-30CGMCCN〇. 9864。實驗證明，該菌株在無機鹽培養(yǎng)基中7天對100mg/L普施特 的降解率達到93. 40%;對50mg/L乙草胺降解率達到88. 44%;對100mg/L氯嘧磺隆降解率 達到41. 15%;對100mg/L雜草焚的降解率達到12. 28%。這表明該菌株能降解除草劑普施 特、乙草胺、氯嘧磺隆和雜草焚，在修復土壤除草劑普施特、乙草胺、氯嘧磺隆和雜草焚污染 方面具有廣闊的應用前景。
[0025] 保藏說明
[0026] 菌種名稱：根瘤菌
[0027] 拉丁名：（Rhizobium sp.)
[0028] 菌株編號=I98-L-3O
[0029] 保藏機構：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心
[0030] 保藏機構簡稱：CGMCC
[0031] 地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號
[0032] 保藏日期：2014年10月28日
[0033] 保藏中心登記入冊編號：CGMCC No. 9864

【具體實施方式】
[0034] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0035] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0036] 下述實施例中所用的培養(yǎng)基如下：
[0037] 無氮液體培養(yǎng)基：溶質及其濃度為蔗糖10g/L，NaCl 0· 12g/L，K2HPO4 · 3H20 0· 5g/ L，CaC03lg/L，MgSO4 · 7H20 0· 2g/L ;溶劑為蒸餾水；ρΗ7· 2。
[0038] 無氮固體培養(yǎng)基：向無氮液體培養(yǎng)基中加瓊脂至其含量為15_20g/L得到的培養(yǎng) 基。
[0039] 牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基：溶質及其濃度為牛肉膏5g/L、蛋白胨10g/L、NaC15g/ L;溶劑為蒸餾水；pH7.2。
[0040] 牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基：溶質及其濃度為牛肉膏5g/L、蛋白胨10g/L、NaC15g/ L、瓊脂15-20g/L ;溶劑為蒸餾水；pH7. 2。
[0041] 無機鹽液體培養(yǎng)基：溶質及其濃度為NH4Cl I. 0g/L，KH2PO4O. 5g/L，K2HPO4L 5g/L， MgSO4O. 2g/L，NaCl 0· 5g/L ;溶劑為蒸餾水；ρΗ7· 2。
[0042] 無機鹽固體培養(yǎng)基：向無機鹽液體培養(yǎng)基中加瓊脂至其含量為2%得到的培養(yǎng) 基。
[0043] 下述實施例中的根瘤菌（Rhizobium sp.)LD1616CGMCC No. 7775(簡稱根瘤菌 (Rhizobium sp.)LD1616)已在中國發(fā)明專利文獻CN 103343100B中公開。
[0044] 實施例 1、根瘤菌（Rhizobium sp.) 198-L-30CGMCC No. 9864 的分離與鑒定
[0045] 一、除草劑降解菌198-L-30的分離
[0046] 1、在IOOml無菌水中加入IOg土壤樣品（采自中國黑龍江黑河受除草劑污染的農 田），振蕩培養(yǎng)30min制成混濁液。吸取Iml上述混濁液加入盛有9ml無菌水中的試管中充 分混勻（此時稀釋度記為KT 1)，然后從此試管中吸取Iml加入到另一盛有9ml無菌水的試 管中混合均勻，以此類推制成10_2、10_ 3、10_4、10_5不同稀釋度的菌懸液。將各稀釋度取0.11111 均勻涂布在無氮固體培養(yǎng)基平板上，28°C恒溫靜置培養(yǎng)2- 3天。待菌落形成后，在無氮固 體培養(yǎng)基平板上進行菌種純化。
[0047] 2、對除草劑普施特、乙草胺、氯嘧磺隆和雜草焚降解能力的初步篩選采用平板透 明圈法。將普施特標準品（Fluka公司產品）加入無機鹽固體培養(yǎng)基使其含量為IOOOmg/ L，得到普施特平板；將乙草胺標準品（Fluka公司產品）加入無機鹽固體培養(yǎng)基使其含量 為1000mg/L，得到乙草胺平板；將氯嘧磺隆標準品（Fluka公司產品）加入無機鹽固體培養(yǎng) 基使其含量為l〇〇〇mg/L，得到氯嘧磺隆平板；將雜草焚標準品（Fluka公司產品）加入無機 鹽固體培養(yǎng)基使其含量為l〇〇〇mg/L，得到雜草焚平板。將普施特平板、乙草胺平板、氯嘧磺 隆平板和雜草焚平板進行分區(qū)，吸取步驟1純化得到的每株菌的菌懸液10 μ L和本實驗室 的根瘤菌（Rhizobium sp. )LD1616的菌懸液10 μ L(各種菌株菌懸液的菌體含量相同）分 別點種到四種平板上（每株菌在一個平板上重復3次），28°C培養(yǎng)、觀察。篩選到一株在普 施特平板、乙草胺平板、氯嘧磺隆平板和雜草焚平板上均能形成較大透明圈的菌株，將該菌 株其命名為除草劑降解菌198-L-30。根瘤菌（Rhizobium sp.)LD1616只在氯嘧磺隆平板 上形成較大透明圈，在普施特平板、乙草胺平板和雜草焚平板上均不能形成透明圈。說明除 草劑降解菌198-L-30能降解氯啼磺隆、普施特、乙草胺和雜草焚；根瘤菌（Rhizobium sp.) LD1616能降解氯嘧磺隆，不能降解普施特、乙草胺和雜草焚。
[0048] 表L除草劑降解菌198-L-30和根瘤菌（Rhizobium sp.) LD1616對四種除草劑降 解能力初篩結果

【權利要求】
1. 根瘤菌（Rhizobium sp. )198-L-30,其在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生 物中心的保藏編號為CGMCC No. 9864。
2. -種菌劑，其特征在于：所述菌劑的活性成分為權利要求1所述的根瘤菌 (Rhizobium sp.)198-L-30 CGMCC No. 9864〇
3. 根據權利要求2所述的菌劑，其特征在于：所述菌劑為下述1)或2)所述菌劑： 1) 用于降解除草劑的菌劑；所述除草劑為普施特、乙草胺、氯嘧磺隆和雜草焚中至少 一種； 2) 用于修復土壤除草劑污染的菌劑；所述除草劑為普施特、乙草胺、氯嘧磺隆和雜草 焚中至少一種。
4. 權利要求1所述的根瘤菌（Rhizobium sp.)198_L_30 CGMCC No. 9864、或權利要求 2或3所述的菌劑在降解除草劑中的應用；所述除草劑為普施特、乙草胺、氯嘧磺隆和雜草 焚中至少一種。
5. 權利要求1所述的根瘤菌（Rhizobium sp.)198-L-30 CGMCC No. 9864、或權利要求 2或3所述的菌劑在修復土壤除草劑污染中的應用；所述除草劑為普施特、乙草胺、氯嘧磺 隆和雜草焚中至少一種。
6. 培養(yǎng)權利要求1所述根瘤菌（Rhizobium sp.) 198-L-30 CGMCC No. 9864的方法，包 括將所述根瘤菌（Rhizobium sp.)198-L-30 CGMCC No. 9864在用于培養(yǎng)根瘤菌的培養(yǎng)基中 培養(yǎng)的步驟。
7. 權利要求2或3所述菌劑的制備方法，包括如下步驟：將權利要求1所述的根瘤菌 (Rhizobium sp.)198-L-30 CGMCC No. 9864作為活性成分，得到所述菌劑。
【文檔編號】C12N1/20GK104388354SQ201410704883
【公開日】2015年3月4日 申請日期:2014年11月26日 優(yōu)先權日:2014年11月26日
【發(fā)明者】高淼, 孫建光, 張磊, 孫穎飛 申請人:中國農業(yè)科學院農業(yè)資源與農業(yè)區(qū)劃研究所