檢測(cè)地中海貧血相關(guān)基因突變的試劑盒及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及引物組及其應(yīng)用、試劑盒及其應(yīng)用。該用于擴(kuò)增地中海貧血基因核苷酸片段的引物組包括引物組A和/或引物組B。該引物對(duì)組相關(guān)基因位點(diǎn)所在基因片段進(jìn)行擴(kuò)增。該引物組和試劑盒能夠有效地檢測(cè)α和β地中海貧血的野生型和突變型結(jié)果，可行性好，靈敏度高。
【專利說(shuō)明】檢測(cè)地中海貧血相關(guān)基因突變的試劑盒及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及引物組及其應(yīng)用、試劑盒及其應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 珠蛋白生成障礙性貧血，原名地中海貧血，又稱海洋性貧血，是一組遺傳性溶血性 貧血疾病。由于遺傳的基因缺陷致使血紅蛋白中一種或一種以上珠蛋白鏈合成缺如或不足 所導(dǎo)致的貧血或病理狀態(tài)。緣于基因缺陷的復(fù)雜性與多樣性，使缺乏的珠蛋白鏈類型、數(shù)量 及臨床癥狀變異性較大。
[0003] 珠蛋白鏈的分子結(jié)構(gòu)及合成是由基因決定的。Υ、δ、ε和β珠蛋白基因組成 "β基因族"，ξ和α珠蛋白組成"α基因族"。正常人自父母雙方各繼承2個(gè)α珠蛋白 基因 （α α/α α)合成足夠的α珠蛋白鏈；自父母雙方各繼承1個(gè)β珠蛋白基因合成足 夠的β珠蛋白鏈。由于珠蛋白基因的缺失或點(diǎn)突變，肽鏈合成障礙導(dǎo)致發(fā)病。地中海貧血 分為α型、β型、δ β型和δ型4種，其中以β和α地中海貧血較為常見。
[0004] β珠蛋白生成障礙性貧血（簡(jiǎn)稱β地貧）的發(fā)生的分子病理相當(dāng)復(fù)雜，已知有 100種以上的β基因突變，主要是由于基因的點(diǎn)突變，少數(shù)為基因缺失。大多數(shù)α珠蛋白 生成障礙性貧血（地中海貧血）（簡(jiǎn)稱α地貧）是由于α珠蛋白基因的缺失所致，少數(shù)由 基因點(diǎn)突變?cè)斐?。白基因的缺失所致，少?shù)由基因點(diǎn)突變?cè)斐伞?br> [0005] 對(duì)于少見類型和各種類型重疊所致的復(fù)合體則非常復(fù)雜，臨床表現(xiàn)各異，僅根據(jù) 臨床特點(diǎn)和常規(guī)實(shí)驗(yàn)室血液學(xué)檢查是無(wú)法診斷的。而且由于基因調(diào)控水平的差異，相同基 因突變類型的患者不一定有相同的臨床表現(xiàn)。血紅蛋白電泳檢查是診斷本病的必備條件， 但輸血治療后的血液學(xué)檢查會(huì)與實(shí)際結(jié)果有所不同。所以進(jìn)行遺傳學(xué)和分子生物學(xué)檢查才 能最后確診。遺傳學(xué)檢查可確定為純合子、雜合子以及雙重雜合子等。
[0006] 但是目前生物學(xué)檢查檢測(cè)單一、靈敏度不高，因此提供一種檢測(cè)地中海貧血的引 物組及試劑盒具有現(xiàn)實(shí)意義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 有鑒于此，本發(fā)明提供一種引物組及其應(yīng)用、試劑盒及其應(yīng)用。該引物對(duì)組相關(guān)基 因位點(diǎn)所在基因片段進(jìn)行擴(kuò)增。該引物組和試劑盒能夠有效地檢測(cè)α和β地中海貧血的 野生型和突變型結(jié)果，可行性好，靈敏度高。
[0008] 為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：
[0009] 本發(fā)明提供了一種用于擴(kuò)增地中海貧血基因核苷酸片段的引物組，其包括引物組 A和/或引物組B ;
[0010] 所述引物組A包括如下序列的引物：
[0011]

【權(quán)利要求】
1.用于擴(kuò)增地中海貧血基因核苷酸片段的引物組，其特征在于，其包括引物組A和/或 引物組B ; 所述引物組4包括如5￡〇10吣.1?5￡〇10吣.45、如5￡〇10吣.63?5￡〇10吣.74 所示序列的引物： 其中， 針對(duì)突變位點(diǎn)nt29設(shè)計(jì)的引物具有如SEQ ID No. 1?SEQ ID No. 3所示的序列； 針對(duì)突變位點(diǎn)CD71/72設(shè)計(jì)的引物具有如SEQ ID No. 4?SEQ ID No. 6所示的序列； 針對(duì)突變位點(diǎn)Cap設(shè)計(jì)的引物具有如SEQ ID No. 7?SEQ ID No. 9所示的序列； 針對(duì)突變位點(diǎn)Int設(shè)計(jì)的引物具有如SEQ ID No. 10?SEQ ID No. 12所示的序列； 針對(duì)突變位點(diǎn)⑶14/15設(shè)計(jì)的引物具有如SEQ ID No. 13?SEQ ID No. 15所示的序 列； 針對(duì)突變位點(diǎn)⑶17設(shè)計(jì)的引物具有如SEQ ID No. 16?SEQ ID No. 18所示的序列； 針對(duì)突變位點(diǎn)⑶26設(shè)計(jì)的引物具有如SEQ ID No. 19?SEQ ID No. 21所示的序列； 針對(duì)突變位點(diǎn)CD27/28設(shè)計(jì)的引物具有如SEQ ID No. 22?SEQ ID No. 24所示的序 列； 針對(duì)突變位點(diǎn)IVS 1-1設(shè)計(jì)的引物具有如SEQ ID No. 25?SEQ ID No. 27所示的序 列； 針對(duì)突變位點(diǎn)IVS 1-5設(shè)計(jì)的引物具有如SEQ ID No. 28?SEQ ID No. 30所示的序 列； 針對(duì)突變位點(diǎn)CD41/42設(shè)計(jì)的引物具有如SEQ ID No. 31?SEQ ID No. 33所示的序 列； 針對(duì)突變位點(diǎn)⑶43設(shè)計(jì)的引物具有如SEQ ID No. 34?SEQ ID No. 36所示的序列； 針對(duì)突變位點(diǎn)⑶30設(shè)計(jì)的引物具有如SEQ ID No. 37?SEQ ID No. 39所示的序列； 針對(duì)突變位點(diǎn)nt28設(shè)計(jì)的引物具有如SEQ ID No. 40?SEQ ID No. 42所示的序列； 針對(duì)突變位點(diǎn)IVS 11-654設(shè)計(jì)的引物具有如SEQ ID No. 43?SEQ ID No. 45所示的 序列； 針對(duì)突變位點(diǎn)nt30設(shè)計(jì)的引物具有如SEQ ID No. 63?SEQ ID No. 65所示的序列； 針對(duì)突變位點(diǎn)IVS II-5設(shè)計(jì)的引物具有如SEQ ID No. 66?SEQ ID No. 68所示的序 列； 針對(duì)突變位點(diǎn)CD37設(shè)計(jì)的引物具有如SEQ ID No. 69?SEQ ID No. 71所示的序列； 針對(duì)突變位點(diǎn)nt32設(shè)計(jì)的引物具有如SEQ ID No. 72?SEQ ID No. 74所示的序列； 所述引物組B包括如SEQ ID No. 46?SEQ ID No. 62所示序列的引物： 其中， 針對(duì)突變位點(diǎn)a 142設(shè)計(jì)的引物具有如SEQ ID No. 46?SEQ ID No. 48所示的序列； 針對(duì)突變位點(diǎn)a 122設(shè)計(jì)的引物具有如SEQ ID No. 49?SEQ ID No. 51所示的序列； 針對(duì)突變位點(diǎn)a 125設(shè)計(jì)的引物具有如SEQ ID No. 52?SEQ ID No. 54所示的序列； 針對(duì)突變位點(diǎn)2 a設(shè)計(jì)的引物具有如SEQ ID No. 55?SEQ ID No. 56所示的序列； 針對(duì)突變位點(diǎn)SEA設(shè)計(jì)的引物具有如SEQ ID No. 57?SEQ ID No. 58所示的序列； 針對(duì)突變位點(diǎn)4. 2設(shè)計(jì)的引物具有如SEQ ID No. 59?SEQ ID No. 60所示的序列； 針對(duì)突變位點(diǎn)3. 7設(shè)計(jì)的引物具有如SEQ ID No. 61?SEQ ID No. 62所示的序列。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的引物組在檢測(cè)地中海貧血基因突變中的應(yīng)用。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述地中海貧血為a地中海貧血和/或 3地中海貧血。
4. 一種檢測(cè)地中海貧血基因突變的試劑盒，其特征在于，包括如權(quán)利要求1所述的引 物組。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于，還包括芯片和探針。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述探針包括探針組C和/或探針組 D ； 所述探針組 C 包括如 SEQ ID No. 75 ?SEQ ID No. 104、如 SEQ ID No. 115 ?SEQ ID No. 122所示序列的探針： 其中， 針對(duì)位點(diǎn)nt29設(shè)計(jì)的探針具有如SEQ ID No. 75?SEQ ID No. 76所示的序列； 針對(duì)位點(diǎn)CD71/72設(shè)計(jì)的探針具有如SEQ ID No. 77?SEQ ID No. 78所示的序列； 針對(duì)位點(diǎn)Cap設(shè)計(jì)的探針具有如SEQ ID No. 79?SEQ ID No. 80所示的序列； 針對(duì)位點(diǎn)Int設(shè)計(jì)的探針具有如SEQ ID No. 81?SEQ ID No. 82所示的序列； 針對(duì)位點(diǎn)CD14/15設(shè)計(jì)的探針具有如SEQ ID No. 83?SEQ ID No. 84所示的序列； 針對(duì)位點(diǎn)CD 17設(shè)計(jì)的探針具有如SEQ ID No. 85?SEQ ID No. 86所示的序列； 針對(duì)位點(diǎn)CD26設(shè)計(jì)的探針具有如SEQ ID No. 87?SEQ ID No. 88所示的序列； 針對(duì)位點(diǎn)CD27/28設(shè)計(jì)的探針具有如SEQ ID No. 89?SEQ ID No. 90所示的序列； 針對(duì)位點(diǎn)IVS 1-1設(shè)計(jì)的探針具有如SEQ ID No. 91?SEQ ID No. 92所示的序列； 針對(duì)位點(diǎn)IVS 1-5設(shè)計(jì)的探針具有如SEQ ID No. 93?SEQ ID No. 94所示的序列； 針對(duì)位點(diǎn)⑶41/42設(shè)計(jì)的探針具有如SEQ ID No. 95?SEQ ID No. 96所示的序列； 針對(duì)位點(diǎn)CD43設(shè)計(jì)的探針具有如SEQ ID No. 97?SEQ ID No. 98所示的序列； 針對(duì)位點(diǎn)CD30設(shè)計(jì)的探針具有如SEQ ID No. 99?SEQ ID No. 100所示的序列； 針對(duì)位點(diǎn)nt28設(shè)計(jì)的探針具有如SEQ ID No. 101?SEQ ID No. 102所示的序列； 針對(duì)位點(diǎn)IVS 11-654設(shè)計(jì)的探針具有如SEQ ID No. 103?SEQ ID No. 104所示的序 列； 針對(duì)位點(diǎn)nt30設(shè)計(jì)的探針具有如SEQ ID No. 115?SEQ ID No. 116所示的序列； 針對(duì)位點(diǎn)IVS II-5設(shè)計(jì)的探針具有如SEQ ID No. 117?SEQ ID No. 118所示的序列； 針對(duì)位點(diǎn)CD37設(shè)計(jì)的探針具有如SEQ ID No. 119?SEQ ID No. 120所示的序列； 針對(duì)位點(diǎn)nt32設(shè)計(jì)的探針具有如SEQ ID No. 121?SEQ ID No. 122所示的序列； 所述探針組D包括如SEQ ID No. 105?SEQ ID No. 114所示序列的探針： 其中， 針對(duì)位點(diǎn)a 142設(shè)計(jì)的探針具有如SEQ ID No. 105?SEQ ID No. 106所示的序列； 針對(duì)位點(diǎn)a 122設(shè)計(jì)的探針具有如SEQ ID No. 107?SEQ ID No. 108所示的序列； 針對(duì)位點(diǎn)a 125設(shè)計(jì)的探針具有如SEQ ID No. 109?SEQ ID No. 110所示的序列； 針對(duì)位點(diǎn)2 a設(shè)計(jì)的探針具有如SEQ ID No. Ill所示的序列； 針對(duì)位點(diǎn)SEA設(shè)計(jì)的探針具有如SEQ ID No. 112所示的序列； 針對(duì)位點(diǎn)4. 2設(shè)計(jì)的探針具有如SEQ ID No. 113所示的序列； 針對(duì)位點(diǎn)3. 7設(shè)計(jì)的探針具有如SEQ ID No. 114所示的序列。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于，還包括表面化學(xué)質(zhì)控探針、雜交質(zhì)控探 針和陰性對(duì)照探針。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征在于，所述表面化學(xué)質(zhì)控探針具有如SEQ ID No. 123所不的序列； 所述雜交質(zhì)控探針具有如SEQ ID No. 124所示的序列； 所述陰性對(duì)照探針具有如SEQ ID No. 125所示的序列。
9. 根據(jù)權(quán)利要求4至8任一項(xiàng)所述的試劑盒在檢測(cè)地中海貧血基因突變中的應(yīng)用。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于，所述地中海貧血為a地中海貧血和/或 3地中海貧血。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104372100SQ201410707836
【公開日】2015年2月25日 申請(qǐng)日期:2014年11月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月28日
【發(fā)明者】李陽(yáng), 項(xiàng)光新, 邢婉麗 申請(qǐng)人:博奧生物集團(tuán)有限公司, 清華大學(xué)