一種豬流行性腹瀉病毒s基因rt-lamp檢測試劑盒及檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種豬流行性腹瀉病毒S基因RT-LAMP檢測試劑盒及檢測方法，其包含緩沖劑、Bst DNA聚合酶、dNTPs、甜菜堿、MgSO4、AMV反轉(zhuǎn)錄酶、鈣黃綠素、MnCl2、抑制劑和以下6條引物SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:6。本發(fā)明所述的豬流行性腹瀉病毒S基因RT-LAMP檢測試劑盒，大大簡化了實(shí)驗(yàn)步驟，提高了準(zhǔn)確率。本發(fā)明的豬流行性腹瀉病毒S基因的非診斷性RT-LAMP檢測方法，為野外及基層實(shí)驗(yàn)室檢測PEDV提供一種無需特殊儀器、更為簡便、快速、特異的檢測豬流行性腹瀉病毒的方法。
【專利說明】-種豬流行性腹瀉病毒S基因 RT-LAMP檢測試劑盒及檢測 方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物檢測方法【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種豬流行性腹瀉病毒S基因 RT-LAMP檢測試劑盒及檢測方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 近年來，仔豬腹瀉呈多發(fā)性趨勢，因其傳播速度快、治愈率低、死亡率高等特點(diǎn)，嚴(yán) 重制約生豬養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。腹瀉病毒感染是導(dǎo)致仔豬腹瀉最重要的原因之一。許多病 毒可致仔豬腹瀉，如諾如病毒、博卡病毒、星狀病毒等，但最常見、危害最深的是豬傳染性胃 腸炎病毒和豬流行性腹瀉病毒，而又以后者為重。
[0003] 豬流行性腹瀉（Porcine epidemic diarrhea, PED)是由豬流行性腹瀉病毒 (Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)引起的急性、接觸性、高度傳染性的消化道疾 病，不同品種、年齡的豬只都可感染發(fā)病，尤以7日齡內(nèi)仔豬易感性最強(qiáng)，患豬主要癥狀為 嘔吐、水樣腹瀉和脫水等，該病感染率為100%，死亡率一般為80% -100%，波及范圍廣，呈 世界范圍內(nèi)存在，給畜牧業(yè)生產(chǎn)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。另外，病原基因型多，而且與傳染性 胃腸炎和輪狀病毒病的臨床癥狀、流行特點(diǎn)和病理變化都極其相似，但從臨床癥狀方面很 難進(jìn)行有效地鑒別診斷，而現(xiàn)行的多數(shù)實(shí)驗(yàn)室診斷方法存在諸多弊端，故建立適合豬場和 基層實(shí)驗(yàn)室使用的、快速準(zhǔn)確的診斷方法對于發(fā)現(xiàn)、確診、監(jiān)測和防控該病意義重大。
[0004] 目前，PEDV的常規(guī)監(jiān)測方法主要有病原學(xué)檢測，包括：病毒的分離鑒定和電鏡檢 測；免疫學(xué)方法，包括：免疫熒光法、血清中和試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA)，等；分子生 物學(xué)技術(shù)，包括：核酸探針雜交，反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反（RT-PCR反應(yīng)），套式PCR，實(shí)時(shí)熒光定 量PCR (RT-qPCR)，多重PCR，等。作為傳統(tǒng)的檢測方法，PEDV的病原學(xué)檢測存和血清學(xué)檢測 存在著許多不足。
[0005] PEDV的分離鑒定和電鏡觀察只能在高水平的實(shí)驗(yàn)室中由專業(yè)的技術(shù)人員操作，所 需周期長，分離難度大；電鏡觀察病毒方法證明，在任何PEDV感染豬的腸內(nèi)容物和糞便中 可以發(fā)現(xiàn)有TGEV的存在，非特異性極低；PEDV抗體的血清學(xué)方法檢測，最常用的是SN試 驗(yàn)，技術(shù)復(fù)雜，操作繁瑣，成本極高；酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA)是當(dāng)前應(yīng)用最廣泛的一種 免疫學(xué)檢測方法，但由于單克隆抗體是針對特定抗原位點(diǎn)，而不同PEDV株這些抗原位點(diǎn)有 差異，導(dǎo)致某些樣品的漏檢。分子診斷技術(shù)的蓬勃發(fā)展給PEDV的檢測提供了更多的方法， 如RT-PCR、基因芯片技術(shù)、實(shí)時(shí)熒光RT-PCR等，但由于試驗(yàn)周期較長、操作繁瑣、靈敏度不 高等，因此，建立一種快速簡便的、適用于臨床和基層實(shí)驗(yàn)室的檢測方法十分重要。
[0006] 環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)（LAMP)是Notomi等設(shè)計(jì)并應(yīng)用的，針對靶基因的不同 區(qū)域設(shè)計(jì)4種特異引物，利用一種鏈置換DNA聚合酶（Bst DNA polymerase),于恒溫條件下 快速完成核酸的擴(kuò)增反應(yīng)，最主要的特點(diǎn)是：四種引物在靶基因上的不同部位完全匹配才 能進(jìn)行擴(kuò)增，具有很高特異性；等溫?cái)U(kuò)增，省去了昂貴的熱循環(huán)儀的費(fèi)用；多引物且不用控 制溫度變化促使鏈置換反應(yīng)使靶基因利用酶反應(yīng)系統(tǒng)搞笑擴(kuò)增，靶核酸序列呈指數(shù)擴(kuò)增， 擴(kuò)增效率高。
[0007] 逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)（RT-LAMP)是在LAMP反應(yīng)體系中加入一定量的 逆轉(zhuǎn)錄酶從而實(shí)現(xiàn)RNA到DNA的一步擴(kuò)增，不需要模板的熱變性、退火和長時(shí)間溫度循環(huán)等 過程，只需要恒溫幾十分鐘即可完成，且擴(kuò)增效率極高，一般能檢測到10拷貝以下的樣品， 故該方法具有高特異性和高敏感性的特點(diǎn)，對于低濃度的病毒或無癥狀的病毒攜帶者的檢 測敏感性也非常較高。RT-LAMP法的結(jié)果判定方法有肉眼觀察沉淀法、熒光染料顯色觀察 法、瓊脂糖凝膠電泳法和濁度儀檢測法四種。隨著科學(xué)的發(fā)展，在反應(yīng)體系中添加染料，通 過產(chǎn)物與染料的作用而使體系顏色發(fā)生變化以確定反應(yīng)發(fā)生的發(fā)生越來越被接受和使用， 而SYBR Green I和Green Finder因假陽性和無特異性而備受垢病。
[0008] 中國專利申請CN103276103A中公開了一種檢測豬流行性腹瀉病毒的RT-LAMP核 酸試紙條試劑盒及應(yīng)用，其是在反應(yīng)結(jié)束后，試紙條插入反應(yīng)液中檢測產(chǎn)物，這同添加 SYBR Green I或Green Finder染料是一樣的，需要開蓋，特別容易形成揮發(fā)性氣溶膠而污染環(huán) 境，造成假陽性。中國專利申請CN102021249A中公開了反轉(zhuǎn)錄-環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測豬流 行性腹瀉的方法其采用N基因作為引物靶基因，設(shè)計(jì)了 3對引物，通過兩步法進(jìn)行檢測，即 第一步是提取RNA后反轉(zhuǎn)錄成cDNA，第二步是將cDNA加入到LAMP反應(yīng)體系中進(jìn)行等溫反 應(yīng)，最終通過染料變色法觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果，由于N基因是保守序列，PEDV也是如此，針對N基 因的引物對于單一病毒來講特異性高，但是對于同類病毒來講存在特異性不高的情況，即 在實(shí)際應(yīng)用中可能該引物出現(xiàn)錯(cuò)誤擴(kuò)增，如基于PEDV N基因的引物擴(kuò)增出基于TGEV N基 因的引物。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種豬流行性腹瀉病毒S基因 RT-LAMP檢測試劑盒，大大簡化了實(shí)驗(yàn)步驟，提高了準(zhǔn)確率。
[0010] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種豬流行性腹瀉病毒S基因的非診斷性RT-LAMP檢 測方法，為野外及基層實(shí)驗(yàn)室檢測PEDV提供一種無需特殊儀器、更為簡便、快速、特異的檢 測豬流行性腹瀉病毒的方法。
[0011] 為解決上述問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下：
[0012] 一種豬流行性腹瀉病毒S基因 RT-LAMP檢測試劑盒，其包含緩沖劑、BstDNA聚合 酶、dNTPs、甜菜堿、MgS04、AMV反轉(zhuǎn)錄酶、鈣黃綠素、MnCl 2、抑制劑和以下6條引物SEQ ID NO:I-SEQ ID NO:6，
[0013] F3 GGCATCTGCATGAGGTCCAGACGTAAAGAGCTTCCTGAA
[0014] B3 GTTACCCGAACCTGTAGGCT
[0015] FlC GCTATCGCATGGTGAAGG
[0016] F2 CAAGGATGGTGCCATGAACAAAGCTTTGGATTCATTATTAGCAC
[0017] BlC CAAGTTGAAATTCGCCTGG
[0018] B2 ACCAACTACTCTTGGTAGTCGTG。
[0019] 具體地，本發(fā)明所述的豬流行性腹瀉病毒S基因 RT-LAMP檢測試劑盒包含 10\88七緩沖劑2.5 4 1^、88七0嫩聚合酶8比10111111〇1/1(1階138 3.5 4 1^、1111〇1/1甜菜堿 3yL、100mmol/L MgS040.5 yL、5U/yL AMV 反轉(zhuǎn)錄酶 0.5 4 1^、25(^111〇1/1鈣黃綠素 3 4 1^、 25臟〇1/1]\111(：120.5 41^、4(^/^1^抑制劑1.5 41^、4(^111〇1/1?10).5 41^、4(^111〇1/181〇 0. 5 μ L>20μ mol/L B30. 25 μ L>20μ mol/L F30.25 μ L>20μ mol/L F20.85 μ L>20μ mol/L B20.85 μ L〇
[0020] 在本發(fā)明中，在本發(fā)明中采用I丐黃綠素/氯化猛替代SYBR Green或Green Finder 作為染色劑，其原理是：將鈣黃綠素/氯化錳（Calcein/MnCl2)染色劑添加到反應(yīng)體系中 后，在未發(fā)生擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)，鈣黃綠素被氯化錳螯合，呈淬滅狀態(tài)；反應(yīng)開始后，靶基因 DNA大 量被合成，并產(chǎn)生同樣大量的焦磷酸根離子，此時(shí)焦磷酸根離子競爭性與Mn2+結(jié)合，形成穩(wěn) 定的不溶性焦磷酸鹽沉淀，鈣黃綠素被釋放而發(fā)出肉眼可見的綠色熒光；SYBR Green I是 一種結(jié)合于所有dsDNA雙螺旋小溝區(qū)域的具有綠色激發(fā)波長的染料。在游離狀態(tài)下，SYBR Green I發(fā)出微弱的熒光，但一旦與雙鏈DNA結(jié)合后，熒光大大增強(qiáng)。由兩種染料的染色原 理可知，SYBR Green I可以結(jié)合所有雙鏈DNA，包括靶基因擴(kuò)增后的DNA、引物聚合體、非特 異性DNA等，所以，其染色屬非特異性。而當(dāng)反應(yīng)在發(fā)生非特異性反應(yīng)時(shí)，S卩非靶基因有效 擴(kuò)增時(shí)，反應(yīng)產(chǎn)生的焦磷酸根離子是少量的，不足以與Mn 2+結(jié)合而促使Calcein釋放熒光， 所以，Calcein/MnCl2染料只有在靶基因有效擴(kuò)增產(chǎn)生大量DNA和焦磷酸根離子時(shí)才能發(fā) 揮染色作用，故而特異性強(qiáng)，從而可以有效避免氣溶膠污染環(huán)境，以及由此造成的假陽性現(xiàn) 象。
[0021] 一種豬流行性腹瀉病毒S基因非診斷性RT-LAMP檢測方法，其包括以下步驟：
[0022] 1)PEDV的繁殖與收獲步驟：傳代培養(yǎng)Vero細(xì)胞PEDV，待其長成單層后，將PEDV 凍干毒用DMEM稀釋后接種于Vero細(xì)胞上，經(jīng)過培養(yǎng)至出現(xiàn)明顯病變后刮取細(xì)胞收獲病毒 液；
[0023] 2)病毒RNA的提取步驟：采用TIANamp病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒在上述病 毒液中提取PEDV病毒RNA ;
[0024] 3)引物的設(shè)計(jì)與合成的步驟：根據(jù)GenBank中PEDV S基因的保守區(qū)域設(shè)計(jì)6條 LAMP 引物，6 條引物序列為 SEQ ID NO: I-SEQ ID NO:6，
[0025] F3 GGCATCTGCATGAGGTCCAGACGTAAAGAGCTTCCTGAA
[0026] B3 GTTACCCGAACCTGTAGGCT
[0027] FlC GCTATCGCATGGTGAAGG
[0028] F2 CAAGGATGGTGCCATGAACAAAGCTTTGGATTCATTATTAGCAC
[0029] BlC CAAGTTGAAATTCGCCTGG
[0030] B2 ACCAACTACTCTTGGTAGTCGTG ；
[0031] 4)配制RT-LAMP恒溫反應(yīng)體系的步驟：按照上述豬流行性腹瀉病毒S基因非診斷 性RT-LAMP檢測試劑盒配制RT-LAMP恒溫反應(yīng)體系；
[0032] 5) RT-LAMP反應(yīng)：以步驟3)提取的RNA為模板，加入到在上述RT-LAMP恒溫反應(yīng) 體系中進(jìn)行反應(yīng)；其中RNA模板量為2 μ L，并用去離子水補(bǔ)足至25 μ L ;
[0033] 6)可視化觀察RT-LAMP反應(yīng)記過，并對其結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。
[0034] 具體地，步驟1)中接Vero細(xì)胞后于37°C 5% CO2培養(yǎng)箱中吸附Ih后，棄病毒液， 加入DMEM維持液，重新置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至至出現(xiàn)明顯病變后刮取細(xì)胞收獲病毒液。
[0035] 具體地，在上述方法中，所述步驟2)病毒RNA的提取步驟如下：
[0036] a)用移液器將20 μ L蛋白酶K加入一個(gè)干凈的I. 5mL離心管中；
[0037] b)向離心管中加入200 μ L平衡至室溫的血漿/血清/淋巴液；
[0038] c)加入200 μ L Carrier RNA工作液，蓋上管蓋，渦旋振蕩15秒混勻，為了保證裂 解充分，樣品和Carrier RNA工作液需要徹底混勻；
[0039] d)在56°C孵育15分鐘，簡短離心以收集附著在管壁及管蓋的液體；
[0040] e)加入250 μ L無水乙醇，此時(shí)可能會出現(xiàn)絮狀沉淀，蓋上管蓋并渦旋振蕩15秒， 徹底混勻，在室溫放置5分鐘；
[0041] f)簡短離心以收集附著在管壁及管蓋的液體；
[0042] g)仔細(xì)將離心管中的溶液和絮狀沉淀全部轉(zhuǎn)移至RNase-free吸附柱CR2,蓋上管 蓋，6000?8000rpm離心1分鐘，棄廢液，將吸附柱放回收集管中；
[0043] h)打開吸附柱蓋子，加入500 μ L溶液RW，蓋上管蓋，靜置2分鐘，8000rpm離心1 分鐘，棄廢液，將吸附柱放回收集管；
[0044] i)重復(fù)步驟h) -次；
[0045] j)小心打開吸附柱蓋子,加入500 μ L無水乙醇,蓋上管蓋,8000rpm離心1分鐘， 棄廢液；
[0046] k)將吸附柱放回收集管中，12000rpm離心3分鐘，使吸附膜完全變干，棄廢液；
[0047] 1)將吸附柱放回2ml收集管中，打開吸附柱蓋子，室溫放置3分鐘，使吸附膜完全 變干；
[0048] m)將吸附柱放入一個(gè)RNase-free離心管中，打開吸附柱的蓋子，向膜中央加入 20-150ul RNase-free ddH20,蓋上蓋子，室溫放置5分鐘12000rpm離心1分鐘。
[0049] 具體地，步驟c)中Carrier RNA工作液按照以下公式配制：
[0050] η X 0· 22mL = y mL ymL X 28 μ L/mL = z μ L
[0051] n=同時(shí)提取的樣品個(gè)數(shù)
[0052] y =需要加入緩沖液GB的體積
[0053] z =需要加入 Carrier RNA。
[0054] 優(yōu)選的方案，本發(fā)明中步驟5)RT-LAMP反應(yīng)條件為63°C lh，80°C lOmin。
[0055] 相比現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果在于：
[0056] 1.本發(fā)明中，由于PEDV病毒的S基因與其他冠狀病毒FIPV、TGEV和CCV的同源 性較低，針對靶序列不同區(qū)域設(shè)計(jì)的6條種特異性引物特異性高、假陽性率低，更適合用作 靶基因而設(shè)計(jì)、能有效避免引物出現(xiàn)錯(cuò)誤擴(kuò)增；
[0057] 2.在本發(fā)明中，RT-LAMP反應(yīng)體系中加入Calcein+MnCl2，反應(yīng)結(jié)束后不需要再加 入SYBR Green I即可顯色，用肉眼觀察即可判斷實(shí)驗(yàn)結(jié)果；
[0058] 3.采用本發(fā)明的RT-LAMP檢測試劑盒檢測時(shí)，不需要預(yù)先的雙鏈DNA熱變性，避免 了溫度循環(huán)而造成的時(shí)間損失，核酸擴(kuò)增在Ih內(nèi)即可完成，同時(shí)觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果，快速高效；
[0059] 4.本發(fā)明的RT-LAMP檢測試劑盒對于病毒擴(kuò)增模板可達(dá)幾個(gè)拷貝，敏感度比 PCR高出幾個(gè)數(shù)量級；本試驗(yàn)優(yōu)化的RT-LAMP方法對PEDV RNA的最小檢測限為10_5稀 釋度，即6. IlX 10_5μ g/μ L，而常規(guī)一步法RT-PCR試劑盒最小檢測限為10_3稀釋度， 即6. 11 X KT3 μ g/μ L ;RT-LAMP敏感性為RT-PCR方法的100倍；且反應(yīng)體系中加入的 Calcein+MnCl2只在特異性擴(kuò)增的情況下才顯示呈綠色，且顯色明顯，靈敏度高，諸多條件 大大增加了 RT-LAMP反應(yīng)的靈敏度。
[0060] 下面結(jié)合附圖和【具體實(shí)施方式】對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0061] 圖1為PEDV RT-LAMP溫度梯度試驗(yàn)產(chǎn)物的電泳檢測結(jié)果。M :DL2000分子標(biāo)準(zhǔn)量； I ：56〇C ；2 ：58〇C ；3 ：60°C ；4 ：62〇C ；5 ：64〇C ；6 ：66〇C ；
[0062] 圖2為PEDV RT-LAMP溫度梯度試驗(yàn)產(chǎn)物的可視化結(jié)果。I :56°C ;2:58°C ;3:60°C ; 4:62〇C ；5 ：64〇C ；6:66〇C ；
[0063] 圖3為PEDV RT-LAMP 63 °C溫度梯度試驗(yàn)產(chǎn)物的電泳檢測結(jié)果；
[0064] 圖4為PEDV RT-LAMP 63°C溫度梯度試驗(yàn)產(chǎn)物的可視化結(jié)果。I :63°C ;2 :陰性對 昭.
[0065] 圖5為PEDV RT-LAMP特異性試驗(yàn)產(chǎn)物的電泳檢測結(jié)果。M :DL2000分子標(biāo)準(zhǔn)量； I :PEDV ;2 :PRRSV ;3 :PCV II ;4 :TGEV ;5 :CSFV ;6 :陰性對照；
[0066] 圖6為PEDV RT-LAMP特異性試驗(yàn)產(chǎn)物的可視化結(jié)果。I :PEDV ;2 :PRRSV ;3 :PCV II ; 4 :TGEV ;5 :CSFV ;6 :陰性對照；
[0067] 圖7為PEDV RT-LAMP敏感性試驗(yàn)產(chǎn)物的電泳檢測結(jié)果。M :DL2000分子標(biāo)準(zhǔn)量； 1-8 :PEDV RNA KT1?KT8稀釋度稀釋；
[0068] 圖8為PEDV RT-LAMP敏感性試驗(yàn)產(chǎn)物的可視化結(jié)果；1-8 :分別是PEDVRNA KT1? 1〇_8稀釋度稀釋；
[0069] 圖9為一步法RT-PCR試劑盒檢測結(jié)果，M. DL2000分子標(biāo)準(zhǔn)量；1-8 :分別是PEDV RNA KT1?KT8稀釋度稀釋。

【具體實(shí)施方式】
[0070] 以下實(shí)施例中所涉及的實(shí)驗(yàn)材料分別如下：
[0071] 1.病毒和質(zhì)粒
[0072] 病毒株P(guān)EDV CV777株、豬繁殖與呼吸綜合癥病毒（PRRSV)、豬圓環(huán)2型病毒 (PCV II )、豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV)、豬瘟病毒（CSFV)等由本實(shí)驗(yàn)室保存。
[0073] 2主要試劑
[0074] Bst DNA聚合酶（大片段）、甜菜堿（Betaine)、|丐黃綠素 Calcein購自New England Biolabs公司；AMV反轉(zhuǎn)錄酶、dNTP及one st印RT-PCR試劑盒購自TAKARA公司；TIANamp 病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒購自北京天根生化生化科技有限公司，膠體金檢測試劑盒 (韓國，品牌：Anigen Rapid,品名：PED Ag Test Kit) ;1%504、1\111(]12等化學(xué)試劑購自廣州康 龍生物科技有限公司。
[0075] 實(shí)施例1
[0076] -種豬流行性腹瀉病毒S基因 RT-LAMP檢測試劑盒，其包含緩沖劑、Bst DNA聚合 酶、dNTPs、甜菜堿、MgS04、AMV反轉(zhuǎn)錄酶、鈣黃綠素、MnCl2、抑制劑和以下6條引物：
[0077] F3 GGCATCTGCATGAGGTCCAGACGTAAAGAGCTTCCTGAA
[0078] B3 GTTACCCGAACCTGTAGGCT
[0079] FlC GCTATCGCATGGTGAAGG
[0080] F2 CAAGGATGGTGCCATGAACAAAGCTTTGGATTCATTATTAGCAC
[0081] BlC CAAGTTGAAATTCGCCTGG
[0082] B2 ACCAACTACTCTTGGTAGTCGTG ；
[0083] 其中緩沖劑、Bst DNA聚合酶、dNTPs、甜菜堿、MgS04、AMV反轉(zhuǎn)錄酶、鈣黃綠素、 MnCl2、抑制劑及6條引物的量分別為：10 X Bst緩沖劑2. 5 μ L、Bst DNA聚合酶8U、lOmmol/L dNTPs 3.5yL、lmol/L甜菜堿3yL、100mmol/L MgS040.5 yL、5U/yL AMV反轉(zhuǎn)錄酶0.5yL、 250 μ mol/L鈣黃綠素 3 μ L、25mmol/L MnCl2O. 5 μ L、40U/ μ L抑制劑 I. 5 μ L、40 μ mol/L FlC 0. 5 μ L>40μ mol/L BlC 0.5 μ L>20μ mol/L B30.25 μ L>20μ mol/L F30. 25 μ L>20μ mol/L F20. 85 μ L、20 μ mol/L B20. 85 μ L。
[0084] 實(shí)施例2
[0085] I) PEDV的繁殖與收獲步驟：傳代培養(yǎng)Vero細(xì)胞PEDV，待其長成單層后，將PEDV 凍干毒用DMEM稀釋后接種于Vero細(xì)胞上，經(jīng)過培養(yǎng)至出現(xiàn)明顯病變后刮取細(xì)胞收獲病毒 液；
[0086] 2)病毒RNA的提取步驟：采用TIANamp病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒在上述病 毒液中提取PEDV病毒RNA，具體步驟如下：
[0087] a)用移液器將20 μ L蛋白酶K加入一個(gè)干凈的I. 5mL離心管中；
[0088] b)向離心管中加入200 μ L平衡至室溫的血漿/血清/淋巴液；
[0089] c)加入200 μ L Carrier RNA工作液，蓋上管蓋，渦旋振蕩15秒混勻，為了保證裂 解充分，樣品和Carrier RNA工作液需要徹底混勻；其中Carrier RNA工作液按照以下公式 配制：
[0090] η X 0· 22mL = y mL ymL X 28 μ L/mL = z μ L
[0091] η =同時(shí)提取的樣品個(gè)數(shù)
[0092] y =需要加入緩沖液GB的體積
[0093] z =需要加入 Carrier RNA ;
[0094] d)在56°C孵育15分鐘，簡短離心以收集附著在管壁及管蓋的液體；
[0095] e)加入250 μ L無水乙醇，此時(shí)可能會出現(xiàn)絮狀沉淀。蓋上管蓋并渦旋振蕩15秒， 徹底混勻，在室溫放置5分鐘；
[0096] f)簡短離心以收集附著在管壁及管蓋的液體；
[0097] g)仔細(xì)將離心管中的溶液和絮狀沉淀全部轉(zhuǎn)移至RNase-free吸附柱CR2,蓋上管 蓋，6000?8000rpm離心1分鐘，棄廢液，將吸附柱放回收集管中；
[0098] h)打開吸附柱蓋子，加入500 μ L溶液RW，蓋上管蓋，靜置2分鐘，8000rpm離心1 分鐘，棄廢液，將吸附柱放回收集管；
[0099] i)重復(fù)步驟h) -次；
[0100] j)小心打開吸附柱蓋子,加入500 μ L無水乙醇,蓋上管蓋,8000rpm離心1分鐘， 棄廢液；
[0101] k)將吸附柱放回收集管中，12000rpm離心3分鐘，使吸附膜完全變干，棄廢液；
[0102] 1)將吸附柱放回2ml收集管中，打開吸附柱蓋子，室溫放置3分鐘，使吸附膜完全 變干；
[0103] m)將吸附柱放入一個(gè)RNase-free離心管中，打開吸附柱的蓋子，向膜中央加入 20-150ul RNase-free ddH20,蓋上蓋子，室溫放置5分鐘12000rpm離心1分鐘；
[0104] 3)引物的設(shè)計(jì)與合成的步驟：根據(jù)GenBank中PEDV S基因的保守區(qū)域設(shè)計(jì)6條 LAMP引物，6條引物序列為：
[0105] F3 GGCATCTGCATGAGGTCCAGACGTAAAGAGCTTCCTGAA
[0106] B3 GTTACCCGAACCTGTAGGCT
[0107] FlC GCTATCGCATGGTGAAGG
[0108] F2 CAAGGATGGTGCCATGAACAAAGCTTTGGATTCATTATTAGCAC
[0109] BlC CAAGTTGAAATTCGCCTGG
[0110] B2 ACCAACTACTCTTGGTAGTCGTG ；
[0111] 4)配制RT-LAMP恒溫反應(yīng)體系的步驟：按照實(shí)施例1的豬流行性腹瀉病毒S基因 非診斷性RT-LAMP檢測試劑盒配制RT-LAMP恒溫反應(yīng)體系；
[0112] 5) RT-LAMP反應(yīng)：以步驟3)提取的RNA為模板，加入到在上述RT-LAMP恒溫反應(yīng) 體系中進(jìn)行反應(yīng)；其中RNA模板量為2 μ L，并用去離子水補(bǔ)足至25 μ L ;
[0113] 6)可視化觀察RT-LAMP反應(yīng)記過，并對其結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。
[0114] 實(shí)施例3
[0115] 在實(shí)施例2的基礎(chǔ)上還包括了對RT-LAMP反應(yīng)條件的優(yōu)化；具體步驟為：將溫度 按561：、581：、601：、621：、641：、661：依次遞增，多次重復(fù)后確定最佳反應(yīng)溫度 ；配置1111〇1/ L Betaine, 250umol/L Calcein, , 5mmol/L MnCl2,100mmol/L MgSO4,連同 AMV和 Bst DNA聚 合酶對RT-LAMP反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)選；配置6條引物的工作濃度（lOmmol/mL)后對引物濃度 配比進(jìn)行優(yōu)化；對反應(yīng)時(shí)間在30min，45min，60min和75min依次增加確定最佳反應(yīng)時(shí)間。 優(yōu)化結(jié)果參見圖1-4。
[0116] 由圖1、2可知，PEDV RT-LAMP溫度梯度試驗(yàn)產(chǎn)物的電泳和可視化檢測結(jié)果表明， 本反應(yīng)在62°C -64°C時(shí)，表現(xiàn)為陽性；由圖3、4可知，PEDV RT-LAMP溫度梯度試驗(yàn)產(chǎn)物的電 泳和可視化檢測結(jié)果表明，本反應(yīng)在63°C時(shí)，陽性結(jié)果最明顯，適用于試驗(yàn)檢測。
[0117] 效果檢測
[0118] I. RT-LAMP試劑盒的特異性檢測
[0119] 用上述實(shí)施例1的豬流行性腹瀉病毒S基因 RT-LAMP檢測試劑盒對PEDV、PRRSV、 PCV II、TGEV、CSFV等樣品進(jìn)行檢測，驗(yàn)證LAMP方法的特異性，擴(kuò)增結(jié)束后觀察顏色的變化， 可視化觀察結(jié)果見圖6。由圖6可知，本實(shí)驗(yàn)所建立的RT-LAMP試驗(yàn)只能特異性的表達(dá)PEDV RNA，不能表達(dá)PRRSV、PCV II、TGEV和CSFV ;再取5 μ L反應(yīng)產(chǎn)物上樣1. 2%的瓊脂糖凝膠中 進(jìn)行電泳檢測，電泳結(jié)果見圖5,由該圖可知，本實(shí)驗(yàn)所建立的RT-LAMP試驗(yàn)只能特異性的 表達(dá)PEDV RNA，不能表達(dá)PRRSV、PCV II、TGEV和CSFV ;由結(jié)果可知，僅以PEDV為模板可擴(kuò) 增出條帶并見到綠色熒光，其它為陰性，表明該優(yōu)化的RT-LAMP方法對PEDV具有良好的特 異性。
[0120] 2. RT-LAMP方法的重復(fù)性檢測
[0121] 提取等量8份不同代的PEDV Purdue株細(xì)胞培養(yǎng)物的RNA，上述實(shí)施例1的豬流行 性腹瀉病毒S基因 RT-LAMP檢測試劑盒按照實(shí)施例2的方法進(jìn)行檢測，確定批內(nèi)重復(fù)性；4d 后再提取同樣8代培養(yǎng)物，提取病毒RNA同一反應(yīng)條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，確定批間重復(fù)性。
[0122] 8份不同代的PEDV株細(xì)胞培養(yǎng)物RNA，檢測結(jié)果均無差異，批內(nèi)重復(fù)性好；4d后再 提取的同樣8代培養(yǎng)物，檢測結(jié)果均無差異，批間重復(fù)性好。
[0123] 3. LAMP方法的敏感性檢測
[0124] 將提取的PEDV RNA經(jīng)核酸測定儀測定后，做KT1?KT8系列的倍比稀釋，各取 2 μ L模板，用上述實(shí)施例1的豬流行性腹瀉病毒S基因 RT-LAMP檢測試劑盒，按照實(shí)施例2 的方法進(jìn)行檢測；同時(shí)以2. 1的方法進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，根據(jù)該反應(yīng)的引物和所提供的反應(yīng) 條件用TaKaRa one step RT-PCR試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增，以1.2%瓊脂糖凝膠電泳觀察。通過實(shí) 驗(yàn)結(jié)果對比優(yōu)化的RT-LAMP方法和RT-PCR方法的敏感性?？梢暬^察結(jié)果見圖8,電泳結(jié) 果見圖7和圖9。
[0125] 由圖8可知，KT1-KT5稀釋后的RNA經(jīng)RT-LAMP反應(yīng)后可視化檢測表現(xiàn)為陽性， 10_ 6-10_8稀釋后的RNA經(jīng)RT-LAMP反應(yīng)后可視化檢測表現(xiàn)為陰性；再取5 μ L反應(yīng)產(chǎn)物上 樣1. 2%的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳檢測，電泳結(jié)果見圖7,由該圖可知，KT1-KT5稀釋后的 RNA經(jīng)RT-LAMP反應(yīng)后瓊脂糖電泳檢測表現(xiàn)為陽性，10_6-10_8稀釋后的RNA經(jīng)RT-LAMP反應(yīng) 后瓊脂糖電泳檢測表現(xiàn)為陰性；同時(shí)，按照梯度稀釋后的PEDV RNA模板進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)； RT-PCR引物為：
[0126] Fl 5c-TAAGGAAGGGTAAGTTGCTCAT-3c
[0127] F2 5c-ACAGGATTAAACCACCAAAGG-3c
[0128] RT-PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件為：

【權(quán)利要求】
1. 一種豬流行性腹瀉病毒S基因RT-LAMP檢測試劑盒，其特征在于，其包含緩沖劑、Bst DNA聚合酶、dNTPs、甜菜堿、MgS04、AMV反轉(zhuǎn)錄酶、鈣黃綠素、MnCl2、抑制劑和以下6條引物： F3 GGCATCTGCATGAGGTCCAGACGTAAAGAGCTTCCTGAA B3 GTTACCCGAACCTGTAGGCT F1C GCTATCGCATGGTGAAGG F2 CAAGGATGGTGCCATGAACAAAGCTTTGGATTCATTATTAGCAC B1C CAAGTTGAAATTCGCCTGG B2 ACCAACTACTCTTGGTAGTCGTG。
2. 如權(quán)利要求1所述的豬流行性腹瀉病毒S基因RT-LAMP檢測試劑盒，其特征在于，其 包含 lOXBst 緩沖劑 2.5iiL、Bst DNA 聚合酶 8U、10mmol/L dNTPs 3.5iiL、lmol/L 甜菜堿 3 ii L、100mmol/L MgS040. 5 ii L、5U/ii L AMV 反轉(zhuǎn)錄酶 0? 5 ii L、250 ii mol/L 鈣黃綠素 3 ii L、 25mmol/LMnCl20.5iiL、40U/iiI^^^!^[jL5iiL、40iimol/LFlC0.5iiL、40iimol/LBlC 0.5u L>20u mol/L B30.25u L>20u mol/L F30.25u L>20u mol/L F20.85u L>20u mol/L B20.85 u L〇
3. -種豬流行性腹瀉病毒S基因非診斷性RT-LAMP檢測方法，其包括以下步驟： 1. PEDV的繁殖與收獲步驟：傳代培養(yǎng)Vero細(xì)胞PEDV，待其長成單層后，將PEDV凍干毒 用DMEM稀釋后接種于Vero細(xì)胞上，經(jīng)過培養(yǎng)至出現(xiàn)明顯病變后刮取細(xì)胞收獲病毒液； 2) 病毒RNA的提取步驟：采用TIANamp病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒在上述病毒液 中提取PEDV病毒RNA ; 3) 引物的設(shè)計(jì)與合成的步驟：根據(jù)GenBank中PEDV S基因的保守區(qū)域設(shè)計(jì)6條LAMP 引物，6條引物序列為： F3 GGCATCTGCATGAGGTCCAGACGTAAAGAGCTTCCTGAA B3 GTTACCCGAACCTGTAGGCT F1C GCTATCGCATGGTGAAGG F2 CAAGGATGGTGCCATGAACAAAGCTTTGGATTCATTATTAGCAC B1C CAAGTTGAAATTCGCCTGG B2 ACCAACTACTCTTGGTAGTCGTG ； 4) 配制RT-LAMP恒溫反應(yīng)體系的步驟：按照權(quán)利要求2配制RT-LAMP恒溫反應(yīng)體系； 5. RT-LAMP反應(yīng)：以步驟3)提取的RNA為模板，加入到在上述RT-LAMP恒溫反應(yīng)體系 中進(jìn)行反應(yīng)；其中RNA模板量為2 ii L，并用去離子水補(bǔ)足至25 ii L ; 6) 可視化觀察RT-LAMP反應(yīng)記過，并對其結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的豬流行性腹瀉病毒S基因非診斷性RT-LAMP檢測方法，其特 征在于：步驟1)中接Vero細(xì)胞后于37°C 5% C02培養(yǎng)箱中吸附lh后，棄病毒液，加入DMEM 維持液，重新置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至出現(xiàn)明顯病變后刮取細(xì)胞收獲病毒液。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的豬流行性腹瀉病毒S基因非診斷性RT-LAMP檢測方法，其特 征在于，所述步驟2)病毒RNA的提取步驟如下： a) 用移液器將20 ii L蛋白酶K加入一個(gè)干凈的1. 5mL離心管中； b) 向離心管中加入200 ii L平衡至室溫的血漿/血清/淋巴液； c) 加入200 yL Carrier RNA工作液，蓋上管蓋，渦旋振蕩15秒混勻，為了保證裂解充 分，樣品和Carrier RNA工作液需要徹底混勻； d) 在56°C孵育15分鐘，簡短離心以收集附著在管壁及管蓋的液體； e) 加入250 y L無水乙醇，此時(shí)可能會出現(xiàn)絮狀沉淀，蓋上管蓋并渦旋振蕩15秒，徹底 混勻，在室溫放置5分鐘； f) 簡短離心以收集附著在管壁及管蓋的液體； g) 仔細(xì)將離心管中的溶液和絮狀沉淀全部轉(zhuǎn)移至RNase-free吸附柱CR2,蓋上管蓋， 6000?8000rpm離心1分鐘，棄廢液，將吸附柱放回收集管中； h) 打開吸附柱蓋子，加入500 ii L溶液RW，蓋上管蓋，靜置2分鐘，8000rpm離心1分鐘， 棄廢液，將吸附柱放回收集管； i) 重復(fù)步驟h) -次； j) 小心打開吸附柱蓋子，加入500ii L無水乙醇，蓋上管蓋,8000rpm離心1分鐘，棄廢 液； k) 將吸附柱放回收集管中，12000rpm離心3分鐘，使吸附膜完全變干，棄廢液； l) 將吸附柱放回2ml收集管中，打開吸附柱蓋子，室溫放置3分鐘，使吸附膜完全變 干； m) 將吸附柱放入一個(gè)RNase-free離心管中，打開吸附柱的蓋子，向膜中央加入 20-150ul RNase-free ddH20,蓋上蓋子，室溫放置5分鐘12000rpm離心1分鐘。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的豬流行性腹瀉病毒S基因非診斷性RT-LAMP檢測方法，其特 征在于，步驟c)中Carrier RNA工作液按照以下公式配制： n X 0? 22mL = y mL ymL X 28 u L/mL = z u L n=同時(shí)提取的樣品個(gè)數(shù) y =需要加入緩沖液GB的體積 z =需要加入 Carrier RNA。
7. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的豬流行性腹瀉病毒S基因非診斷性RT-LAMP檢測方法，其特 征在于，步驟5)RT-LAMP反應(yīng)條件為63°C lh，80°C lOmin。
【文檔編號】C12R1/93GK104388592SQ201410709726
【公開日】2015年3月4日 申請日期:2014年11月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月27日
【發(fā)明者】劉好朋, 賀東生, 陳瑞愛, 胡京京, 李冰, 張顯浩 申請人:廣東大華農(nóng)動物保健品股份有限公司, 肇慶大華農(nóng)生物藥品有限公司