一種仔豬腹瀉病毒變異株部分s基因及其原核表達(dá)載體的構(gòu)建方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域,具體涉及一種仔豬腹瀉病毒變異株部分S基因及其原核表達(dá)載體的構(gòu)建方法,該構(gòu)建方法由以下步驟組成:(a)以F1與R1為引物,F(xiàn)1:5’-GAATTCGATGTCACCAGGTGCT-3’;R1:5’-GTCGACTTAATTAAATGATGG-3’;利用PCR反應(yīng)擴(kuò)增得到如SEQ ID NO.1所示的編碼仔豬腹瀉病毒變異株部分S基因的基因序列;(b)將上述編碼的仔豬腹瀉變異株部分S基因序列連接至pET32a載體上,得重組表達(dá)載體pET32a-bs1;(c)將重組表達(dá)載體pET32a-bs1質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21菌株,250rpm震蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期OD600=0.6~0.7,加入1mmol/L IPTG,37℃誘導(dǎo)6h表達(dá)目的蛋白即仔豬腹瀉病毒變異株部分S基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建,完成。
【專利說明】—種仔豬腹瀉病毒變異株部分S基因及其原核表達(dá)載體的構(gòu)建方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域,具體涉及一種仔豬腹瀉病毒變異株部分S基因及其原核表達(dá)載體的構(gòu)建方法。
【背景技術(shù)】
[0002]豬流行性腹瀉是由病毒引起的以腹瀉、嘔吐、脫水和哺乳仔豬高致死率為主要特征的一種急性、高度接觸性腸道傳染病。豬流行性腹灣病毒(porcine epidemic diarrheavirus,PEDV),只有一個(gè)血清型,屬于冠狀病毒科冠狀病毒屬,能感染各種年齡的豬都發(fā)病。
[0003]PEDV臨床表現(xiàn)為水樣腹瀉,并伴有嘔吐;所有日齡豬均可發(fā)生,其中出生10日齡以內(nèi)哺乳仔豬,常常在維持腹瀉2-4天后,脫水大量死亡(50% -100% )。一些地方的養(yǎng)豬場(chǎng)幾乎整窩發(fā)病,呈水樣腹瀉,發(fā)病率高,病死率高,不死的仔豬成為弱仔和僵豬。日齡較大的哺乳仔豬的發(fā)病率和病死率相對(duì)較低一些。PEDV以感染乳豬、造成嚴(yán)重?fù)p失為特征;自2000年左右韓國(guó)大流行以來,周邊地區(qū)均有暴發(fā),我國(guó)一直處于地方性流行狀態(tài);PEDV在局部地區(qū)首先暴發(fā)后,未能及時(shí)有效控制,逐漸蔓延后,出現(xiàn)大流行。
[0004]自PEDV發(fā)現(xiàn)以來,各國(guó)學(xué)者使用多種方法嘗試使病毒適應(yīng)細(xì)胞,進(jìn)行體外培養(yǎng)擴(kuò)增。1988年瑞典Hoffman等首次在Vero傳代細(xì)胞的培養(yǎng)液中加入胰酶,通過細(xì)胞上連續(xù)盲傳成功獲得病毒的細(xì)胞培養(yǎng)。隨后日本和韓國(guó)也相繼有培養(yǎng)成功的報(bào)道。但不同來源的Vero細(xì)胞、不同毒株和培養(yǎng)條件都是影響病毒分離的重要因素。PEDV的體外細(xì)胞培養(yǎng)適應(yīng)難度大,繁殖條件復(fù)雜,病毒在細(xì)胞中繁殖滴度低,細(xì)胞病變不明顯,一直是PEDV體外增殖過程的一個(gè)重要技術(shù)瓶頸。要分離到一株該病毒需要時(shí)間較長(zhǎng),工作量大,相關(guān)疫苗的發(fā)展也受到影響與限制。
[0005]目前,雖然商品化PEDV疫苗已普遍使用,有多個(gè)廠家的滅活苗和弱毒苗供選擇,但免疫效果一直不理想,該病在我國(guó)仍有流行,并引起嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。通過對(duì)病毒的分析,豬流行性腹瀉病毒的結(jié)構(gòu)蛋白與其他冠狀病毒相似,糖基化纖突(spike)蛋白為主要結(jié)構(gòu)蛋白。2010PED野毒在纖突蛋白基因區(qū)域出現(xiàn)插入性突變,該區(qū)域?yàn)椴《镜目乖瓫Q定區(qū)域。經(jīng)典毒株CV777制備的疫苗以及變異前毒株(與經(jīng)典毒株處于同一進(jìn)化分支的)制備的疫苗,在病毒S蛋白發(fā)生變異后,疫苗治療效果大打折扣,治療效果不明顯。為了對(duì)已變異的仔豬腹瀉病毒PEDV進(jìn)行有效的治療,研制一種新的有效的PEDV疫苗十分必要。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0006]本發(fā)明的目的:(I)提供一種仔豬腹瀉病毒變異株部分S基因;(2)提供一種仔豬腹瀉病毒變異株部分S基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建方法;(3) —種仔豬腹瀉病毒變異株部分S基因在大腸桿菌中的表達(dá)方法。
[0007]本發(fā)明的技術(shù)方案:(1) 一種仔豬腹瀉病毒變異株部分S基因,所述S基因由序列表中SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列組成。(2) —種仔豬腹瀉病毒變異株部分S基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建方法,其特征在于:該構(gòu)建方法由以下步驟組成:
(a)以Fl 與 Rl 為引物,F(xiàn)l:5’ -GAATTCGATGTCACCAGGTGCT-3 ’ ;R1:5’ -GTCGACTTAATTAAATGATGG-3’ ;利用PCR反應(yīng)擴(kuò)增得到如SEQ ID N0.1所示的編碼仔豬腹瀉病毒變異株部分S基因的基因序列;所述PCR反應(yīng)體系為:2XEx Taq PCR premix10 μ l,cDNA 2 μ 1,引物混合物I μ 1,雙蒸水7 μ I ;反應(yīng)參數(shù)分為3步,第I步為95°C 5min,第 2 步為 95°C 30s, 57°C 30s, 72°C 2min,35 個(gè)循環(huán),第 3 步為 72°C延伸 1min ;
(b)將上述編碼的仔豬腹瀉變異株部分S基因序列連接至pET32a載體上,得重組表達(dá)載體 pET32a-bsl ;
(c)將重組表達(dá)載體pET32a-bsl質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21菌株,250rpm震蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期OD6tltl = 0.6?0.7,加入lmmol/L IPTG,37°C誘導(dǎo)6h表達(dá)目的蛋白即仔豬腹瀉病毒變異株部分S基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建,完成。
[0008](3) 一種仔豬腹灣病毒變異株部分S基因在大腸桿菌中的表達(dá)方法,該表達(dá)方法有如下步驟組成:(I)挑取權(quán)利要求2中所述的大腸桿菌BL21菌落,接入含有抗生素的LB培養(yǎng)基,培養(yǎng)過夜;(2)取過夜培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接入含有抗生素的新鮮LB培養(yǎng)液中,250rpm震蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期OD6tltl = 0.6?0.7 ; (3)在培養(yǎng)物中加入濃度為lmmol/L的IPTG,37°C,誘導(dǎo)表達(dá)6h后,8000rpm,20min離心處理收集含有重組仔豬腹瀉病毒變異株部分S基因的大腸桿菌菌體沉淀。
[0009]所述的質(zhì)粒載體是含有SEQ ID N0.1基因,通過插入pET32a載體構(gòu)建成的。所述的重組工程菌是由上述質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化原核宿主細(xì)胞株得到的。該重組工程菌的原核宿主細(xì)胞株是大腸桿菌。所述的大腸桿菌為大腸桿菌BL21(DE3)。在合適的條件下于培養(yǎng)基中培育上述大腸桿菌。
[0010]本發(fā)明構(gòu)建了仔豬腹瀉病毒變異株部分S基因原核表達(dá)載體。通過應(yīng)用PCR技術(shù)合成了仔豬腹瀉變異株部分S基因序列,將該基因序列克隆至pET32a中,得到重組表達(dá)載體pET32a-bsl,再通過CaCl2轉(zhuǎn)化大腸桿菌,根據(jù)生長(zhǎng)情況快速篩選出表達(dá)量較高的陽(yáng)性克隆轉(zhuǎn)化子bsI,該表達(dá)蛋白目前可以通過大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn),具有良好的應(yīng)用前景。
[0011]有益效果:S蛋白是在PEDV的重要結(jié)構(gòu)蛋白,可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體,是研究PEDV基因工程疫苗的主要目的基因。本發(fā)明成功構(gòu)建了一株重組原核表達(dá)蛋白,能夠穩(wěn)定表達(dá)PEDV部分S基因蛋白。通過western-blotting試驗(yàn)證明重組蛋白具有反應(yīng)原性;仔豬免疫試驗(yàn)證實(shí),免疫激發(fā)了機(jī)體產(chǎn)生了針對(duì)仔豬流行性腹瀉病毒變異株部分S蛋白的特異性的抗體,抗體中和效價(jià)達(dá)到>1:32,所構(gòu)建重組蛋白具有免疫原性。本發(fā)明所構(gòu)建部分S基因包含纖突蛋白基因區(qū)域出現(xiàn)的插入性突變部分,為PEDV新型變異株基因工程疫苗的研究奠定了重要基礎(chǔ)。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0012]下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。
[0013]圖1為本發(fā)明的構(gòu)建流程圖;
圖2重組蛋白在E.coli BL21中的表達(dá)產(chǎn)物電泳圖。其中,條帶1:pET_32a空載體誘導(dǎo);條帶2:重組表達(dá)載體pET-32a_bsl未誘導(dǎo);條帶3:重組表達(dá)載體pET_32a bsl誘導(dǎo)4h ;條帶4:重組表達(dá)載體pET-32a bsl誘導(dǎo)5h ;條帶5:重組表達(dá)載體pET_32a bsl誘導(dǎo)6h ;條帶6:重組表達(dá)載體pET_32a bsl誘導(dǎo)7h ;M:標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker
【具體實(shí)施方式】
[0014]實(shí)施例1.仔豬腹瀉病毒變異株部分S基因序列的獲得,根據(jù)仔豬腹瀉病毒變異株的基因序列,設(shè)計(jì)以下引物:F1:5’ -GAATTCGATGTCACCAGGTGCT-3’ ;R1:5, -GTCGACTTAATTAAATGATGG-3,;
利用PCR反應(yīng)擴(kuò)增編碼腹瀉病毒變異株部分S基因序列,PCR反應(yīng)體系為(20 μ I):2XEx Taq PCR premix 10μ l,cDNA 2 μ 1,引物混合物I μ 1,雙蒸水7 μ I。反應(yīng)參數(shù)分為3步,第 I 步為 950C 5min,第 2 步為 95V 30s, 57°C 30s, 72°C 2min, 35 個(gè)循環(huán),第 3 步為 72°C延伸lOmin。瓊脂糖凝膠電泳回收PCR產(chǎn)物,回收產(chǎn)物連接pMD19_T克隆載體,篩選陽(yáng)性質(zhì)粒送上海生工生物工程有限公司測(cè)序,所得序列例如SEQ ID N0.1所示。
[0015]實(shí)施例2.重組大腸桿菌表達(dá)載體的構(gòu)建
用EcoR I和Sal I分別雙酶切PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和pET32a質(zhì)粒DNA,瓊脂糖凝膠電泳回收目的條帶,用T4DNA連接酶連接回收的目的條帶,得到原核表達(dá)載體pET32a-bsl,用CaCl2法熱激90秒將其轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL 21(DE3)。利用Amp抗性篩選單菌落。所選轉(zhuǎn)化克隆經(jīng)PCR,酶切鑒定證明克隆正確后送北京博邁德生物工程有限公司測(cè)序。具體構(gòu)建流程見圖1.實(shí)施例3.重組大腸桿菌表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化和篩選
將鑒定正確的重組表達(dá)載體pET32a-bsl質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21菌株,加入lmmol/L的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)6h,加入磷酸緩沖液重懸細(xì)胞。
[0016]實(shí)施例4.變異株部分S基因在大腸桿菌中的表達(dá)
在1ml含100 μ g/ml Amp的LB液體培養(yǎng)基中,按1:1000接種BL21_pET32a_bsl菌液,370C,250rpm震蕩培養(yǎng)過夜;次日按1:50接種培養(yǎng)過夜的菌液至含100 μ g/ml的新LB液體培養(yǎng)基中,37°C,250rpm震蕩培養(yǎng)至OD6tltl = 0.6?0.7 ;每管分別加入IPTG至終濃度為lmmol/L,37°C誘導(dǎo)表達(dá);分別在誘導(dǎo)4h,5h,6h,7h后收集菌液,4°C,8000rpm離心收集菌體;加入1ml 0.0lM的磷酸鹽緩沖液(簡(jiǎn)稱PBS,pH 7.4)重懸菌體。4°C,8000rpm離心20min,棄上清。重復(fù)洗滌菌體一次。加入5ml上述緩沖液重懸菌體。SDS-PAGE電泳檢測(cè),如圖2所示。在69kDa位置附近出現(xiàn)一條高表達(dá)量的特異性條帶,分子量大小約69kDa,與理論值相符。
[0017]本發(fā)明的重組載體pET32a_bsl可以表達(dá)獲得重組蛋白,小量制備蛋白免疫仔豬,免后2周檢測(cè)抗體,可產(chǎn)生特異性抗體。本發(fā)明的成果將為PEDV基因工程疫苗的研究奠定基礎(chǔ)。
【權(quán)利要求】
1.一種仔豬腹瀉病毒變異株部分S基因,其特征在于:所述S基因由序列表中SEQ IDN0.1所示的核苷酸序列組成。
2.—種仔豬腹灣病毒變異株部分S基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建方法,其特征在于:該構(gòu)建方法由以下步驟組成: (a)以Fl 與 Rl 為引物,F(xiàn)l:5’ -GAATTCGATGTCACCAGGTGCT-3 ’ ;R1:5’ -GTCGACTTAATTAAATGATGG-3’ ;利用PCR反應(yīng)擴(kuò)增得到如SEQ ID N0.1所示的編碼仔豬腹瀉病毒變異株部分S基因的基因序列;所述PCR反應(yīng)體系為:2XEx Taq PCR premix10 μ l,cDNA 2 μ 1,引物混合物I μ 1,雙蒸水7 μ I ;反應(yīng)參數(shù)分為3步,第I步為95°C 5min,第 2 步為 95°C 30s, 57°C 30s, 72°C 2min,35 個(gè)循環(huán),第 3 步為 72°C延伸 1min ; (b)將上述編碼的仔豬腹瀉變異株部分S基因序列連接至pET32a載體上,得重組表達(dá)載體 pET32a-bsl ; (c)將重組表達(dá)載體pET32a-bsl質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21菌株,250rpm震蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期OD6tltl = 0.6?0.7,加入lmmol/L IPTG,37°C誘導(dǎo)6h表達(dá)目的蛋白即仔豬腹瀉病毒變異株部分S基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建,完成。
3.一種仔豬腹瀉病毒變異株部分S基因在大腸桿菌中的表達(dá)方法,其特征在于:該表達(dá)方法有如下步驟組成:(I)挑取權(quán)利要求2中所述的大腸桿菌BL21菌落,接入含有抗生素的LB培養(yǎng)基,培養(yǎng)過夜;(2)取過夜培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接入含有抗生素的新鮮LB培養(yǎng)液中,250rpm震蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期OD6tltl = 0.6?0.7 ; (3)在培養(yǎng)物中加入濃度為lmmol/L的IPTG,370C,誘導(dǎo)表達(dá)6h后,SOOOrpm, 20min離心處理收集含有重組仔豬腹瀉病毒變異株部分S基因的大腸桿菌菌體沉淀。
【文檔編號(hào)】C12N15/70GK104357461SQ201410710763
【公開日】2015年2月18日 申請(qǐng)日期:2014年11月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月27日
【發(fā)明者】程蘭玲 申請(qǐng)人:新疆天康畜牧生物技術(shù)股份有限公司