分型診斷四種感染人瘧原蟲的探針、試劑盒及其使用方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于診斷四種感染人瘧原蟲的探針、試劑盒及其使用方法。其中，惡性瘧原蟲、間日瘧原蟲、卵形瘧原蟲、三日瘧原蟲分別采用對(duì)應(yīng)的種特異性探針，探針5’端均加有10個(gè)T尾，紫外交聯(lián)固定于尼龍雜交膜。所述試劑盒由PCR和反向斑點(diǎn)雜交反應(yīng)試劑及材料構(gòu)成，可在室溫下進(jìn)行惡性瘧原蟲、問(wèn)日瘧原蟲、卵形瘧原蟲、三日瘧原蟲或者其中的兩種或者三種或者四種瘧原蟲的分型診斷，提供了一種簡(jiǎn)便、快速的瘧原蟲分型診斷技術(shù)。
【專利說(shuō)明】分型診斷四種感染人瘧原蟲的探針、試劑盒及其使用方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種用于瘧原蟲分型診斷的探針、試劑盒及其使用方法，尤其涉及一 種用于診斷惡性瘧原蟲、間日瘧原蟲、卵形瘧原蟲、三日瘧原蟲的探針及其試劑盒和使用方 法，屬于瘧原蟲檢測(cè)領(lǐng)域。

【背景技術(shù)】
[0002] 瘧原蟲是原生動(dòng)物門、孢子蟲綱（Sporozoa)，球蟲目（Cocciidea)，血孢子蟲亞目 (Haemosporidiidea)，原蟲科（Plasmadiidea)中的一個(gè)屬，即痕原蟲屬（plasmodiam)的總 稱。寄生于人體者包括惡性皰原蟲（Plasmodium falciparum)、間日皰原蟲（Plasmodium vivax)、卵形痕原蟲（Plasmodium ovals)、三日痕原蟲（Plasmodium malariae)四種。我 國(guó)以間日瘧分布最廣，除青藏高原外，遍及全國(guó)。惡性瘧次之，分布于秦嶺一淮河以南，以云 貴、兩廣與海南為最。三日瘧在長(zhǎng)江南北各省均有散在病例。卵形瘧只在云南和廣東有少 數(shù)病例報(bào)告。
[0003] 瘧疾是對(duì)人類健康危害最嚴(yán)重的傳染病之一，我國(guó)自2000年以來(lái)瘧疾疫情出現(xiàn) 回升，其中云南、海南兩省較為嚴(yán)重，許多省受到輸入性惡性瘧的威脅，尤其是境外輸入性 惡性瘧的威脅。隨著經(jīng)濟(jì)全球化和國(guó)際交往的增多，近年來(lái)勞務(wù)輸出人數(shù)逐年增加，輸入性 瘧疾病例逐年增多，呈逐年上升趨勢(shì)。輸入性病例大多源于非洲、緬甸等惡性瘧高發(fā)區(qū)勞務(wù) 輸出的歸國(guó)人員，2008年我國(guó)瘧疾死亡病例全部為境外勞務(wù)回國(guó)人員，2009年有21個(gè)省 (市、區(qū)）有輸入性惡性瘧病例報(bào)告，且瘧疾死亡也全部為輸入病例。2010年報(bào)告輸入性惡 性瘧1161例，占惡性瘧報(bào)告病例數(shù)的92. 3%，較2009年（897例）上升29. 4%。2012年全 國(guó)31個(gè)?。ㄊ小^(qū)）有報(bào)告瘧疾病例，與2011年相比，本地感染瘧疾病例明顯下降，輸入性 瘧疾病例比例明顯上升，尤其是境外輸入性瘧疾病例比例從2011年的66. 4 % (2974/4479) 上升到2012年的91.0% (2474/2718)，其中以惡性瘧為主。因此，關(guān)注瘧疾疫情，特別是境 外輸入性惡性瘧疫情十分重要。
[0004] 目前，瘧疾診斷方法主要分3類：一是以傳統(tǒng)的鏡檢法為基礎(chǔ)的病原學(xué)診斷，通過(guò) 增加血樣中的原蟲數(shù)目、改進(jìn)染色方法或兩者結(jié)合來(lái)提高檢測(cè)效率，如熒光染色技術(shù)等；二 是上世紀(jì)70年代發(fā)展起來(lái)的免疫學(xué)診斷方法，如間接熒光抗體法、酶聯(lián)免疫吸附法等，其 中免疫層析技術(shù)因其快速、簡(jiǎn)便等特點(diǎn)已成為瘧疾診斷的研宄熱點(diǎn)；三是上世紀(jì)80年代興 起的分子生物學(xué)診斷方法，通過(guò)檢測(cè)瘧原蟲種、株特異性的基因片段來(lái)確定瘧原蟲感染，如 基因探針和PCR技術(shù)等。PCR技術(shù)因其高度的敏感性、特異性以及對(duì)蟲種、蟲株的鑒別力 在瘧疾診斷中發(fā)揮越來(lái)越重要的作用，套式PCR等方法可進(jìn)一步提高診斷的敏感性和準(zhǔn)確 性。但PCR方法仍費(fèi)力耗時(shí)，需要多次試驗(yàn)確定混合感染。如何在一次反應(yīng)中檢測(cè)多個(gè)蟲 種、蟲株、甚至基因型成為近年來(lái)研宄的熱點(diǎn)。
[0005] 反向斑點(diǎn)雜交（reverse dot blot，RDB)是1989年由Saiki等提出的一種斑點(diǎn) 雜交技術(shù)，并將其應(yīng)用于血液病和Beta地中海貧血的檢測(cè)，該方法操作簡(jiǎn)便，在膜上添加 針對(duì)不同亞型或突變的探針，可以在一張膜上同時(shí)檢測(cè)多個(gè)樣品，有利于降低成本，節(jié)省時(shí) 間。RDB只需要相對(duì)較短的寡核苷酸探針就能提供明顯的雜交信號(hào)，通過(guò)調(diào)整雜交條件可以 鑒別出模板中一個(gè)堿基的差異。該技術(shù)較正向斑點(diǎn)雜交和凝膠電泳轉(zhuǎn)印雜交具有快速、簡(jiǎn) 便、敏感性高、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)，尤其是在基因分型、基因突變檢測(cè)、病原體的檢測(cè)等方面有 其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的主要目的是提供一套用于分型診斷瘧原蟲的探針，可用于惡性瘧原蟲、 間曰瘧原蟲、卵形瘧原蟲、三日瘧原蟲或者其中的兩種或者三種或者四種瘧原蟲的聚合酶 鏈反應(yīng)-反向斑點(diǎn)雜交分型診斷。
[0007] 所述探針針對(duì)各瘧原蟲的種特異性片段設(shè)計(jì)，探針5'端均加有10個(gè)T尾，其核苷 酸序列為：
[0008]

【權(quán)利要求】
1. 一套用于分型診斷四種感染人瘧原蟲的探針，其特征在于，所述探針系針對(duì)惡性瘧 原蟲、間日瘧原蟲、卵形瘧原蟲和三日瘧原蟲的種特異性片段設(shè)計(jì)，探針5'端均加有10個(gè) T尾，其核苷酸序列為：
所述探針可用于惡性瘧原蟲、間日瘧原蟲、卵形瘧原蟲、三日瘧原蟲或者其中的兩種或 者三種或者四種瘧原蟲的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-反向斑點(diǎn)雜交分型診斷。
2. -種用于分型診斷四種感染人瘧原蟲的試劑盒，其特征在于，包括聚合酶鏈?zhǔn)椒?應(yīng)通用引物溶液（PM)和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)預(yù)混合液（RM)，固定有各型瘧原蟲探針的尼龍雜 交膜（chip)，室溫雜交液（Hyb)，洗液I(Wl)，洗液II(W2)，鏈霉親和素標(biāo)記的堿性磷酸酶 (AP)，堿性磷酸酶緩沖液（Bufferl)，顯色緩沖液（Buffer2)，顯色底物（NBT/BCIP)，其特征 在于，所述試劑盒可以在室溫條件下進(jìn)行惡性瘧原蟲、三日瘧原蟲、卵形瘧原蟲、間日瘧原 蟲或者其中的兩種或者三種或者四種瘧原蟲的分型診斷； 所述的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)通用引物溶液（PM)，其特征在于，引物5'端均以 生物素標(biāo)記，上游引物（5' -3' ：GAGGGCAAGTCTGGTGCCAG)與下游引物（5' -3' ： CATCTGAATACGAATGTCCCCAAGC)按照I: 1的比例配制而成的，引物濃度為10mol/L;所述 的固定有各蟲種瘧原蟲探針的尼龍雜交膜（chip)，其特征在于，固定有如權(quán)利要求1所述 的四種分型診斷感染人瘧原蟲探針（SEQNo. 1、SEQNo. 2、SEQNo. 3、SEQNo. 4)中至少一 種探針，各型皰原蟲探針的點(diǎn)樣濃度為25-100μmol/L，優(yōu)選濃度為50μmol/L，點(diǎn)樣量為 0. 3~0, 5uL0
3. -種如權(quán)利要求2所述的用于分型診斷四種感染人瘧原蟲的試劑盒的使用方法，其 特征在于，包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增和室溫反向斑點(diǎn)雜交兩個(gè)主要步驟，反向斑點(diǎn)雜交可 在室溫下完成； 所述的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增，其特征在于，其50μL的反應(yīng)體系包括：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 預(yù)混合液（RM) 25μL，DEPC水22μL，引物混合液（PM) 2μL，DNA模板1μL，陰性對(duì)照中以 DEPC水代替DNA模板；擴(kuò)增程序?yàn)椋?4°C，3min;94°C，30s，53°C，30s，72°C，30s，共30個(gè)循 環(huán)；最后在72°C下5min延伸； 所述的室溫反向斑點(diǎn)雜交方法，其特征在于，使用如權(quán)利要求2所述的室溫雜交液 (Hyb)進(jìn)行雜交，具體步驟為： (1) 將固定有分型診斷四種感染人瘧原蟲探針的尼龍雜交膜置于雜交袋或雜交管內(nèi)， 加入300μL雜交液； (2) 帶有生物素標(biāo)記的擴(kuò)增產(chǎn)物于95°C變性5min，迅速冰浴2min; (3) 向雜交液中加入30μL變性擴(kuò)增產(chǎn)物，室溫雜交3hr; (4) 棄去雜交液，用洗液I、洗液II各洗滌2次，每次5min; (5) 棄去洗液，加入1000倍稀釋的堿性磷酸酶標(biāo)記的鏈霉親和素，于室溫反應(yīng)30min; (6) 棄去酶液，用底物緩沖液洗滌2次，每次5min; (7) 棄去底物緩沖液，加入新配制的底物，避光反應(yīng)5-15min; (8) 將底物棄去，用去離子水終止反應(yīng)，待膜干燥后判定結(jié)果，出現(xiàn)明顯藍(lán)紫色斑點(diǎn)的 判定為陽(yáng)性結(jié)果，無(wú)斑點(diǎn)的判定為陰性結(jié)果。
4.如權(quán)利要求1所述的探針、如權(quán)利要求2所述的試劑盒和如權(quán)利要求3所述的用于 瘧原蟲診斷的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-反向斑點(diǎn)雜交分型診斷方法包括但不限定于采用微全分 析技術(shù)；其特征在于，待測(cè)試樣浸提液的細(xì)胞裂解、核酸提取純化、核酸擴(kuò)增和檢測(cè)均集成 在微全分析系統(tǒng)上自動(dòng)完成，該微全分析系統(tǒng)由微膜片泵（閥）驅(qū)動(dòng)，通過(guò)程序控制微膜片 泵（閥）的開啟與閉合實(shí)現(xiàn)微流體樣品的驅(qū)動(dòng)控制。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104450903SQ201410717439
【公開日】2015年3月25日 申請(qǐng)日期:2014年12月1日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月1日
【發(fā)明者】鄒明強(qiáng), 薛強(qiáng), 殷宏, 王飛, 劉翌, 馬吉湘 申請(qǐng)人:中檢國(guó)研(北京)科技有限公司