利用紅松頭霉菌生產(chǎn)紅景天苷和酪醇的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種利用紅松頭霉菌生產(chǎn)紅景天苷和酪醇的方法，所述的紅松頭霉菌是保藏編號(hào)為CGMCC No.9347的菌株。所述生產(chǎn)紅景天苷和酪醇的方法，是將這種真菌發(fā)酵培養(yǎng)，對(duì)發(fā)酵液或菌絲進(jìn)行提取，獲得含有紅景天苷和酪醇的粗提物。紅景天苷最高含量可達(dá)0.621mg/g，酪醇最高含量可達(dá)0.463mg/g。該方法具有高效、綠色、簡(jiǎn)便、能夠連續(xù)生產(chǎn)、成本低廉等諸多優(yōu)點(diǎn)，為生產(chǎn)紅景天苷和酪醇提供了一種新途徑。CGMCC No 934720140710
【專利說明】利用紅松頭霉菌生產(chǎn)紅景天苷和酪醇的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及發(fā)酵工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體屬于一種利用紅松頭霉菌生產(chǎn)紅景天苷和酪 醇的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 紅景天苷（Salidroside)和酪醇（p-tyrosol)是紅景天（Rhodiola sp.)植物的 主要活性成分，具有抗氧化、抗衰老、抗輻射、抗疲勞等多方面的生物活性，被廣泛應(yīng)用于食 品、化妝品、藥品等多個(gè)領(lǐng)域，受到深海、高山作業(yè)者，航天員等多行業(yè)人員的青睞，市場(chǎng)需 求逐年上升，供求關(guān)系十分突出。
[0003] 植物是獲取紅景天苷和酪醇的主要來源，這導(dǎo)致野生紅景天，尤其是青藏高原的 大花紅景天（R. crenulata)和東北的庫(kù)葉紅景天（R. sachalinensis)等主要品種，資源儲(chǔ) 藏量急劇減少，物種面臨被滅絕的危險(xiǎn)。人們將野生資源引種馴化進(jìn)行人工栽培，取得了 一定進(jìn)步，但面臨著生長(zhǎng)周期過長(zhǎng)（3年以上）、有效成分偏低、容易發(fā)生變種、種植地域受 限（海拔高）、大量占用耕地等諸多問題。近年來，隨著組培技術(shù)和細(xì)胞懸浮培養(yǎng)技術(shù)的進(jìn) 步，人們嘗試用工業(yè)化生產(chǎn)方法實(shí)現(xiàn)紅景天苷和酪醇的快速獲取，但面臨著生物量積累成 本高、有效成分含量低等問題，截止目前，尚無工業(yè)化生產(chǎn)的報(bào)道。
[0004] 也有報(bào)道人們以酪醇和葡萄糖及其類似物為底物，采用重金屬鹽為催化劑合成紅 景天苷，但原料成本高、催化效率低、重金屬污染、提取工藝復(fù)雜等成為嚴(yán)重制約因素。人們 也嘗試用微生物或酶法催化合成紅景天苷，但效果都不理想。
[0005] 本發(fā)明則是從多年生紅景天根部數(shù)百株共生真菌菌株中篩選獲得1株真菌，通過 常規(guī)發(fā)酵培養(yǎng)，即可獲得紅景天苷和酪醇，具有高效、綠色、簡(jiǎn)便、能夠連續(xù)生產(chǎn)、成本低廉 等諸多優(yōu)點(diǎn)，是生產(chǎn)紅景天苷和酪醇的新途徑，在緩解紅景天苷和酪醇的緊張供求關(guān)系、保 護(hù)野生植物等方面具有重要價(jià)值。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種能夠通過發(fā)酵培養(yǎng)產(chǎn)生紅景天苷和酪醇的真菌。
[0007] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種利用這種真菌發(fā)酵培養(yǎng)獲得含有紅景天苷和酪 醇粗提物的方法。且該方法具有綠色、高效、簡(jiǎn)便、能夠連續(xù)生產(chǎn)、成本低廉等諸多優(yōu)點(diǎn)。
[0008] 本發(fā)明提供的一種能夠通過發(fā)酵培養(yǎng)產(chǎn)生紅景天苷和酪醇的真菌，命名為 ZPRa-R-Ι，鑒定為Phialoc印hala fortinii (紅松頭霉菌），這株真菌于2014年7月10日 保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)CGMCC No. 9347,保藏單 位地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所。
[0009] 這株真菌的培養(yǎng)特性：在25°C條件下，用查氏培養(yǎng)基培養(yǎng)，生長(zhǎng)IOd的菌落直徑為 3.90cm。菌落呈灰黑色，中央隆起，深色毛狀邊緣。菌絲為短絮狀，發(fā)達(dá)。菌落周圍培養(yǎng)基 透明，無明顯分泌物，菌落背面為黑色。顯微觀察表明，該菌絲暗色、有隔、具分支；老菌絲顏 色深、粗；新菌絲顏色淺、細(xì)；粗、細(xì)菌絲相連，介于〇. 8 μ m?4. 5 μ m之間。不產(chǎn)分生孢子。
[0010] 本發(fā)明提供的一種通過真菌發(fā)酵培養(yǎng)生產(chǎn)紅景天苷和酪醇的方法，具體包括如下 步驟：
[0011] (1)真菌培養(yǎng)及培養(yǎng)物制備
[0012] 將保藏編號(hào)CGMCC No. 9347的真菌接種于查氏培養(yǎng)基平板活化，在25-30°C條件 下恒溫培養(yǎng)，當(dāng)菌落生長(zhǎng)至直徑為3-9cm左右時(shí)，作為真菌培養(yǎng)物的接種菌種；
[0013] 配制查氏液體培養(yǎng)基，在500mL三角瓶中裝液100-300mL，放5-10粒直徑為 3_5mm的玻璃珠，121°C滅菌20min，冷卻，無菌接入5-6片直徑為5mm的上述菌種菌片，在 22-30°C，轉(zhuǎn)速為150-250r/min，暗條件下?lián)u床培養(yǎng)5-10d，停止發(fā)酵，備用；
[0014] (2)紅景天苷和酪醇粗品的制備
[0015] 收集上述發(fā)酵培養(yǎng)物，紗布過濾，獲得菌絲和發(fā)酵液，分別按下列步驟提取紅景天 苷和酪醇：
[0016] A、發(fā)酵液中紅景天苷和酪醇的提取
[0017] 取真菌發(fā)酵液，按照體積比發(fā)酵液：甲醇=1 : 5-10,加入甲醇，靜置lOmin，用分 液漏斗收集下層清液，去掉漂浮絮狀物；在5000r/m條件下，將清液離心lOmin，收集上清 液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，揮干，得含有紅景天苷和酪醇粗提物。
[0018] B、菌絲中紅景天苷和酪醇的提取
[0019] 將菌絲放濾紙上，40°C烘干，研細(xì)，過三號(hào)篩，置于錐形瓶中，稱重，按Ig : 5-10mL 的比例加入甲醇,密封,浸泡30min，超聲30min，收集濾液；濾渣按上述方法再重復(fù)提取2 次；合并三次提取的濾液，在5000r/m條件下離心IOmin,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，得含有紅景天苷和酪醇 粗提物。
[0020] 采用1H-NMR和HPLC方法分別鑒定紅景天苷和酪醇，結(jié)果見圖1和圖2。按2010 年《藥典》P144頁記載的HPLC方法測(cè)定紅景天苷和酪醇的含量。
[0021] 實(shí)驗(yàn)證明，保藏編號(hào)為CGMCC No. 9347的紅松頭霉菌可在發(fā)酵生產(chǎn)紅景天苷和酪 醇中應(yīng)用。
[0022] 與現(xiàn)有技術(shù)相比本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和效果：
[0023] 本發(fā)明通過對(duì)保藏編號(hào)為CGMCC No. 9347的紅松頭霉菌發(fā)酵培養(yǎng)，直接提取便可 獲得含有紅景天苷和酪醇的粗品，兩者的最高含量為〇. 621mg/g和0. 463mg/g。該方法具有 環(huán)保、廉價(jià)、操作簡(jiǎn)單、能連續(xù)生產(chǎn)等諸多優(yōu)點(diǎn)，是獲取天然紅景天苷和酪醇的良好方法。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0024] 圖1本發(fā)明粗提物中紅景天苷和酪醇HPLC鑒定圖，圖中：a、b圖分別為發(fā)酵液和 菌體提取物中紅景天苷和酪醇的鑒定結(jié)果。
[0025] 圖2本發(fā)明粗提物中紅景天苷和酪醇1H-NMR鑒定圖，圖中：a、b圖分別為發(fā)酵液和 菌體提取物中紅景天苷和酪醇的鑒定結(jié)果，畫圈部分為紅景天苷和酪醇的NMR光譜特征。

【具體實(shí)施方式】
[0026] 實(shí)施例1
[0027] (1)真菌培養(yǎng)及發(fā)酵物制備
[0028] 將保藏編號(hào)CGMCC No. 9347的真菌接種于查氏培養(yǎng)基活化，在25°C條件下恒溫培 養(yǎng)，當(dāng)菌落生長(zhǎng)至直徑為3cm左右時(shí)，作為真菌培養(yǎng)物的接種菌種。
[0029] 配制查氏液體培養(yǎng)基，在500mL三角瓶中裝液IOOmL,放5粒直徑為3mm的玻璃珠， 121°C滅菌20min，冷卻，無菌接入6片直徑為5mm的上述菌種菌片，在25°C，轉(zhuǎn)速為150r/ min,暗條件下，搖床培養(yǎng)IOd,停止發(fā)酵，備用。
[0030] (2)紅景天苷和酪醇粗品的制備
[0031] 收集上述發(fā)酵培養(yǎng)物，紗布過濾，獲得發(fā)酵液，按照I(V) :5(V)=發(fā)酵液：甲醇的 比例，加入甲醇，靜置lOmin，用分液漏斗收集下層清液，去掉漂浮絮狀物。在5000r/m條件 下，將清液離心l〇min，收集上清液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，揮干，得含有紅景天苷和酪醇粗提物。
[0032] (3)對(duì)照：不添加真菌培養(yǎng)物，將同批次的查氏培養(yǎng)基進(jìn)行同樣的處理。
[0033] 采用1H-NMR和HPLC方法分別鑒定紅景天苷和酪醇，按2010年《藥典》P144頁記 載的HPLC方法測(cè)定紅景天苷和酪醇的含量。具體結(jié)果見表1。
[0034] 實(shí)施例2
[0035] (1)真菌培養(yǎng)及發(fā)酵
[0036] 將保藏編號(hào)CGMCC No. 9347的真菌接種于查氏培養(yǎng)基活化，在30°C條件下恒溫培 養(yǎng)，當(dāng)菌落生長(zhǎng)至直徑為9cm左右時(shí)，作為真菌培養(yǎng)物的接種菌種。
[0037] 配制查氏液體培養(yǎng)基，在500mL三角瓶中裝液300mL，放10粒直徑為5mm的玻 璃珠，121°C滅菌20min，冷卻，無菌接入5片直徑為5mm的上述菌種菌片，在30°C，轉(zhuǎn)速為 250r/min，暗條件下，搖床培養(yǎng)5d,停止發(fā)酵，備用。
[0038] (2)紅景天苷和酪醇粗品的制備
[0039] 收集上述發(fā)酵培養(yǎng)物，紗布過濾，獲取菌絲，將菌絲放濾紙上，40°C烘干，研細(xì)， 過三號(hào)篩，置于錐形瓶中，稱重，按1(g) :10(mL)的比例加入甲醇，密封，浸泡30min，超聲 30min，收集濾液。濾渣按上述方法再重復(fù)提取2次。合并三次提取的濾液，在5000r/m條 件下離心l〇min，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，得含有紅景天苷和酪醇粗提物。
[0040] 采用1H-NMR和HPLC方法分別鑒定紅景天苷和酪醇，按2010年《藥典》P144頁記 載的HPLC方法測(cè)定紅景天苷和酪醇的含量。具體結(jié)果見表1。
[0041] 實(shí)施例3
[0042] 將保藏編號(hào)CGMCC No. 9347的真菌接種于查氏培養(yǎng)基，在25°C條件下恒溫培養(yǎng)， 當(dāng)菌落生長(zhǎng)至直徑為3-9cm左右時(shí)，將邊緣部分活力旺盛菌絲重新接種于新的查氏培養(yǎng) 基，當(dāng)菌落長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿時(shí)，用無菌接種鏟將菌絲刮到濾紙上，放40°C烘干，研細(xì)，過三號(hào)篩， 置于錐形瓶中，稱重，按1(g) :5(mL)的比例加入甲醇，密封，浸泡30min，超聲30min，收集濾 液。濾渣按上述方法再重復(fù)提取2次。合并三次提取的濾液，在5000r/m條件下離心IOmin, 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，得含有紅景天苷和酪醇粗提物。
[0043] 按2010年《藥典》P144頁記載的HPLC方法測(cè)定紅景天苷和酪醇的含量。具體結(jié) 果見表1。
[0044] 表1.真菌促進(jìn)大花紅景天提高紅景天苷和酪醇含量
[0045]

【權(quán)利要求】
1. 保藏編號(hào)為CGMCC No. 9347的紅松頭霉菌在發(fā)酵生產(chǎn)紅景天苷和酪醇中的應(yīng)用。
2. -種通過真菌發(fā)酵生產(chǎn)紅景天苷和酪醇的方法，其特征在于，包括如下步驟： (1) 將保藏編號(hào)CGMCC No. 9347的真菌接種于查氏平板培養(yǎng)基活化，在25-30°C條件下 恒溫培養(yǎng)，當(dāng)菌落生長(zhǎng)至直徑為3-9cm左右時(shí)，作為真菌培養(yǎng)物的接種菌種； 配制查氏液體培養(yǎng)基，在500mL三角瓶中裝液100-300mL，放5-10粒直徑為3-5mm的玻 璃珠，121°C滅菌20min，冷卻，無菌接入5-6片直徑為5mm的上述菌種菌片，在22-30°C，轉(zhuǎn) 速為150-250r/min，暗條件下?lián)u床培養(yǎng)5-10d，停止發(fā)酵，備用； (2) 收集上述發(fā)酵培養(yǎng)物，紗布過濾，取發(fā)酵液，按照體積比發(fā)酵液：甲醇=1 : 5-10， 加入甲醇，靜置l〇min，用分液漏斗收集下層清液，去掉漂浮絮狀物；在5000r/m條件下，將 清液離心l〇min，收集上清液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，揮干，得含有紅景天苷和酪醇粗提物。
3. 如權(quán)利要求2所述的一種通過真菌發(fā)酵培養(yǎng)生產(chǎn)紅景天苷和酪醇的方法，其特征在 于，將步驟（2)中經(jīng)紗布過濾得到的菌絲放濾紙上，40°C烘干，研細(xì)，過三號(hào)篩，置于錐形瓶 中，稱重，按lg : 5-10mL的比例加入甲醇，密封，浸泡30min，超聲30min，收集濾液；濾漁按 上述方法再重復(fù)提取2次；合并三次提取的濾液，在5000r/m條件下離心lOmin，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)， 得含有紅景天苷和酪醇粗提物。
【文檔編號(hào)】C12P7/22GK104388497SQ201410720396
【公開日】2015年3月4日 申請(qǐng)日期:2014年12月1日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月1日
【發(fā)明者】崔晉龍, 王夢(mèng)亮 申請(qǐng)人:山西大學(xué)