一種提高間苯三酚產(chǎn)量的基因改造方法及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種提高間苯三酚產(chǎn)量的基因改造方法及應(yīng)用，屬于基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明所提供的方法是通過敲除或插入出發(fā)菌株全局調(diào)控因子arcA基因的方式獲得突變菌株，再將突變菌株轉(zhuǎn)為感受態(tài)后導(dǎo)入含有聚酮合成酶基因phlD、多重抗性激活因子marA、乙酰CoA羧化酶基因ACCase的重組質(zhì)粒，獲得重組細(xì)胞。本發(fā)明還提供了利用所得重組細(xì)胞生產(chǎn)間苯三酚的方法。本發(fā)明首次實現(xiàn)在轉(zhuǎn)錄水平通過全局性調(diào)控碳代謝的方式，發(fā)酵后間苯三酚的產(chǎn)量提高了2.06倍，具有較高的工業(yè)應(yīng)用價值。
【專利說明】一種提高間苯三酚產(chǎn)量的基因改造方法及應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種提高間苯三酚產(chǎn)量的基因改造方法及應(yīng)用，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng) 域。

【背景技術(shù)】
[0002] 間苯三酚是一種重要的精細(xì)化工產(chǎn)品，是合成黃酮、異黃酮類藥物的中間體，間苯 三酚本身可作為一種優(yōu)良的平滑肌解痙藥物，廣泛應(yīng)用于臨床。間苯三酚還能抑制過氧化 物酶活性，具有抗炎抗氧化作用，它可催化H 2O2分解為分子氧和水，是一種重要的抗氧化 酶。此外，間苯三酚還是一種性能優(yōu)越的抗養(yǎng)護劑、穩(wěn)定劑、燃料偶合劑、輪胎增粘劑等，具 有廣闊的市場需求。目前，間苯三酚的工業(yè)化生產(chǎn)方法主要為化學(xué)合成法，包括三硝基甲苯 (TNT)法、異丙基苯法、氯代苯法和苯胺法?；瘜W(xué)合成法存在多種弊端，如原料來源困難、副 產(chǎn)物較多、分離提純困難、環(huán)境污染嚴(yán)重等。以微生物發(fā)酵生產(chǎn)間苯三酚，可以克服化學(xué)法 的多種弊端，并且生物法合成間苯三酚周期短，安全環(huán)保。
[0003] 異源表達突光假單胞菌聚酮合成酶基因 phlD可以合成間苯三酚（Jihane Achkar, Mo Xian, Huimin Zhao, J. ff. Frost. Biosynthesis of phloroglucinol[J]. Journal of the American Chemical Society, 2005, 127(15):5332-5333. ；Wenjuan Zha, Sheryl B. Rubin-Pitel, Huimin Zhao. Characterization of the substrate specificity of PhlD, a type III polyketide synthase from Pseudomonas fluorescens[J]. Journal of Biological Chemistry, 2006, 281 (42) :32036-32047.)。在此基礎(chǔ)上表達多重抗性激 活因子marA，增強大腸桿菌對間苯三酚的耐受性，表達大腸桿菌自身的乙酰CoA羧化酶 基因（ACCase)，細(xì)胞內(nèi)丙二酸單酰CoA的水平為原始菌株的3. 6倍（Yujin Cao, Xinglin Jiang, Rubing Zhang, Mo Xian. Improved phloroglucinol production by metabolically engineered Escherichia coli[J]. Appl Microbiol Biotechnol,2011，91:1545 - 1552.)〇 然而，間苯三酚目前的產(chǎn)量、產(chǎn)率仍然偏低，難以滿足工業(yè)生產(chǎn)的需求。需要進一步對工程 菌株進行基因改造，以期提高間苯三酚的合成能力。
[0004] 大腸桿菌的代謝網(wǎng)絡(luò)包含數(shù)百種代謝物，這些代謝物通過大量的生化和調(diào)節(jié)反 應(yīng)相互關(guān)聯(lián)。代謝流的調(diào)控可在轉(zhuǎn)錄水平，轉(zhuǎn)錄后水平，酶活動力學(xué)等不同水平通過多 種復(fù)雜機制實現(xiàn)。轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控是大腸桿菌最重要的調(diào)節(jié)模式。全局調(diào)控因子本身 包含復(fù)雜的代謝網(wǎng)絡(luò)，發(fā)揮作用時呈現(xiàn)多效性，能夠同時調(diào)節(jié)多種功能不同的操縱子， 因此，全局調(diào)控因子對于某些特定代謝物的影響較為復(fù)雜。Arc系統(tǒng)是細(xì)胞內(nèi)重要的二 組分全局調(diào)控因子，在有氧、無氧及微氧條件下，均能調(diào)控多種操縱子的表達。Arc系統(tǒng) 包括胞質(zhì)反應(yīng)因子ArcA和膜結(jié)合敏感激酶ArcB兩種組分。ArcB能夠自磷酸化并且將 磷酸基團傳遞給ArcA，磷酸化的ArcA可結(jié)合多種基因的啟動子，調(diào)控基因表達。ArcA 能夠抑制TCA循環(huán)及乙醒酸循環(huán)相關(guān)基因的表達（S. Iuchi, E. C. C. Lin, arcA (dye)，a global regulatory gene in Escherichia coli medi-ating repression of enzyme in aerobic pathways, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1988, (85) 1888 - 1892. ；Syed Asif Nizam, Jiangfeng Zhu,PeiYeeHo, Kazuyuki Shimizu. Effects of arc A and arcB genes knockout on the metabolism in Escherichia coli under aerobic condition[J]. Biochemical Engineering Journal, 2009, 44:240 - 250.) ArcA 調(diào)控因子由基因 arcA 編 碼。研究發(fā)現(xiàn)：敲除E·coliMG1655 的arcA基因，β-半乳糖苷酶產(chǎn)量提高10%-20%， 乙酸產(chǎn)量下降50%。在此基礎(chǔ)上，過表達NADH氧化酶（Ν0Χ)，β-半乳糖苷酶的產(chǎn)量提高 120 %，未檢測到乙酸生成（G.N. Vemuri, Μ.Α. Eiteman, Ε. Altman. Increased Recombinant Protein Production in Escherichia coli Strainsffith Overexpressed Water-Forming NADH Oxidase and a Deleted ArcA Regulatory Protein[J]. Biotechnology and Bioengineering. 2006, 538-542.)。
[0005] 過表達phlD、ACCase等基因可提高間苯三酚產(chǎn)量，但目前間苯三酚的產(chǎn)量和產(chǎn)率 仍無法滿足工業(yè)生產(chǎn)的需求。arcA是大腸桿菌內(nèi)重要的全局性調(diào)控因子，該調(diào)節(jié)因子對間 苯三酚發(fā)酵生產(chǎn)的影響暫無報道，通過全局性調(diào)控碳代謝提高間苯三酚產(chǎn)量的基因改造方 法也無報道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為解決上述問題，本發(fā)明提供了一種提高間苯三酚產(chǎn)量的基因改造方法，所采取 的技術(shù)方案如下：
[0007] 本發(fā)明的一個目的在于提供一種提高間苯三酚產(chǎn)量的基因改造方法，該方法是通 過敲除或插入的方式獲得出發(fā)菌株全局調(diào)控因子arcA基因失活的突變菌株，再將突變菌 株轉(zhuǎn)為感受態(tài)后導(dǎo)入含有聚酮合成酶基因 phlD、多重抗性激活因子marA、乙酰CoA羧化酶 基因 ACCase的重組質(zhì)粒，獲得重組細(xì)胞。
[0008] 所述方法的步驟如下：
[0009] 1)通過插入失活或者敲除失活的方式使出發(fā)菌株的全局調(diào)控因子基因 arcA失 活，獲得突變菌株；
[0010] 2)制備步驟2)所得突變菌株的感受態(tài)細(xì)胞；
[0011] 3)制備含有聚酮合成酶基因 phlD、多重抗性激活因子marA、乙酰CoA羧化酶基因 ACCase的重組質(zhì)粒；
[0012] 4)將步驟3)所得的重組質(zhì)粒導(dǎo)入到步驟2)所得的感受態(tài)細(xì)胞中，獲得重組細(xì)胞。
[0013] 步驟1)所述出發(fā)菌株，是大腸桿菌，其中優(yōu)選E. coliBL21(DE3)。
[0014] 步驟3)所述聚酮合成酶基因 phlD，來源于熒光假單胞菌；所述多重抗性激活因子 marA，來源于大腸桿菌；所述乙酰CoA羧化酶基因 ACCase,來源于大腸桿菌。
[0015] 優(yōu)選地，所述聚酮合成酶基因 phlD，GeneBank ID為11830552 ;所述多重抗性激活 因子marA，GeneBank ID為6060688 ;所述乙醜CoA竣化酶基因 ACCase，其中，亞基accA的 GeneBank ID 為 6062185,亞基 accB 的 GeneBank ID 為 6058890,亞基 accC 的 GeneBank ID 為 6058863,亞基 accD 的 GeneBank ID 為 6059083。
[0016] 所述方法的具體步驟如下：
[0017] 1)以大腸桿菌BL21(DE3)為出發(fā)菌株，敲除出發(fā)菌株全局調(diào)控因子基因 arcA上 300bp的序列，獲得突變菌株；
[0018] 所述arcA基因的敲除序列如SEQ ID NO. 1所示；
[0019] 2)制備步驟2)所得突變菌株的感受態(tài)細(xì)胞；
[0020] 3)將聚酮合成酶基因 phlD和多重抗性激活因子marA連接到載體pET30a上，獲得 重組質(zhì)粒pET-phlD-marA ;乙酰CoA羧化酶基因 ACCase連接到載體pACYC上，獲得重組質(zhì) 粒 pACYC-accADBC ;
[0021] 所述聚酮合成酶基因 phlD，來源于熒光假單胞菌，Genebank ID :11830552 ;所述 多重抗性激活因子marA，來源于大腸桿菌，Genebank ID :6060688 ;所述乙酰CoA羧化酶 基因 ACCase，來源于大腸桿菌，其中，亞基accA的Genebank ID :6062185,亞基accB的 Genebank ID :6058890,亞基 accC 的 Genebank ID :6058863,亞基 accD 的 Genebank ID : 6059083 ；
[0022] 4)在將步驟3)所得的重組質(zhì)粒pET-phlD-marA和pACYC-accADBC導(dǎo)入到步驟2) 所得的感受態(tài)細(xì)胞中獲得重組細(xì)胞。
[0023] 所述方法用于獲得高產(chǎn)間苯三酚的基因工程菌和生產(chǎn)間苯三酚。
[0024] 所述應(yīng)用的步驟如下：
[0025] 1)以大腸桿菌BL21(DE3)為出發(fā)菌株，敲除出發(fā)菌株全局調(diào)控因子基因 arcA上 300bp的序列，獲得突變菌株；
[0026] 所述arcA基因的敲除序列如SEQ ID NO. 1所示；
[0027] 2)制備步驟2)所得突變菌株的感受態(tài)細(xì)胞；
[0028] 3)制備含有聚酮合成酶基因 phlD、多重抗性激活因子marA、乙酰CoA羧化酶基因 ACCase的重組質(zhì)粒；
[0029] 4)將步驟3)所得的重組質(zhì)粒導(dǎo)入到步驟2)所得的感受態(tài)細(xì)胞中，獲得重組細(xì) 胞；
[0030] 5)通過搖瓶培養(yǎng)或發(fā)酵罐培養(yǎng)步驟4)所得重組細(xì)胞生產(chǎn)間苯三酚。
[0031] 所述應(yīng)用步驟5)所述培養(yǎng)，重組細(xì)胞種子液的接種量為培養(yǎng)基體積的1% -5%， 培養(yǎng)溫度為37°C，攪拌速度為400-800rpm，pH6. 0-8. 0,溶氧18%以上的條件下培養(yǎng)至OD6tltl 為8-12,然后加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度100 μ M，利用質(zhì)量分?jǐn)?shù)50-80%的葡萄糖儲液繼續(xù) 補料發(fā)酵12_24h后結(jié)束。
[0032] 本發(fā)明取得的有益效果如下：
[0033] 1.本發(fā)明提供一種提高間苯三酚產(chǎn)量的基因改造方法及應(yīng)用，該方法首次實現(xiàn)在 轉(zhuǎn)錄水平通過全局性調(diào)控碳代謝的方式，提高間苯三酚產(chǎn)量，具有較高的工業(yè)應(yīng)用價值。
[0034] 2.本發(fā)明提供一種提高間苯三酚產(chǎn)量的工程菌株，是以大腸埃希氏桿菌 Escherichia coli BL21(DE3)為出發(fā)菌株，以自殺質(zhì)粒pRE112為媒介，通過同源重組技術(shù) 敲除一種全局調(diào)控因子arcA基因，得到工程菌株E. coliBL21 (DE3) Λ arcA。將重組質(zhì)粒 pET-phlD-mar和pACYC-accADBC導(dǎo)入該工程菌株，用于間苯三酚的發(fā)酵生產(chǎn)。
[0035] 3.本發(fā)明提供的基因改造方法，在搖瓶及發(fā)酵罐水平，在含有兩種重組質(zhì)粒 pET-phlD-mar和pACYC-accADBC的基礎(chǔ)上，敲除arcA基因，間苯三酚的產(chǎn)量比對照菌株 Escherichia coli BL21(DE3)提高約 3 倍。
[0036] 定義和縮寫
[0037] 在本文中使用下列的縮寫或簡稱：
[0038] 間苯三酌· (Phloroglucinol) ：PG
[0039] 異丙基硫代半乳糖苷：IPTG
[0040] 聚酮合成酶基因：PhlD
[0041] 多重抗性激活因子：marA
[0042] 乙酰CoA羧化酶基因 ：ACCase
[0043] 大腸埃希氏桿菌（Escherichia coli) :E. coli
[0044] "基因敲除"指通過一定途徑，將特定基因從基因組中全部或部分刪除，從而使特 定基因功能喪失。
[0045] "基因型"指某一生物個體全部基因組合的總稱，是該生物的細(xì)胞內(nèi)所包含的、特 有的那組基因。
[0046] "過量表達"或"過表達"指細(xì)胞內(nèi)特定基因受到各種信號調(diào)控后，在生物體中超過 原有水平表達，可以通過增強內(nèi)源表達或引入外源基因來實現(xiàn)。
[0047] "搭橋PCR"又叫重疊 PCR，指采用具有互補末端的引物，使PCR產(chǎn)物形成重疊鏈，從 而在隨后的擴增反應(yīng)中通過重疊鏈的延伸，將不同來源的擴增片段重疊拼接起來。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0048] 圖1為突變菌株ZG-1949構(gòu)建示意圖。

【具體實施方式】
[0049] 下面通過實例來詳細(xì)闡明本發(fā)明。但本發(fā)明并不限于以下實施例。
[0050] 下述實施例中所涉及的實驗方法若無特殊說明，均為常規(guī)技術(shù)。
[0051] 下述實施例中所使用的材料、試劑等若無特殊說明，均可從商業(yè)途徑獲得。
[0052] 所用限制性內(nèi)切酶及T4DNA連接酶均購自MBI Fermentas公司，質(zhì)粒提取及膠回 收所用試劑盒購自美國OMEGA公司，操作步驟按照產(chǎn)品說明書進行；所有培養(yǎng)基如無特別 說明均用去離子水配制。
[0053] 培養(yǎng)基配方：
[0054] 1)種子液培養(yǎng)基
[0055] LB培養(yǎng)基：酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，蛋白胨10g/L，接種時補加卡那霉素50 μ g/ mL，氯霉素 50 μ g/mL。
[0056] M9 培養(yǎng)基：NH4C1 I. 0g/L，Na2HPO4 · 12H20 15. 2g/L，ΚΗ2Ρ043· 0g/L，NaCl 0· 5g/ L，葡萄糖 20g/L，MgSO4 · 7H20 0· 4g/L，1000X 微量元素（(NH4)6Mo7O24 · 4H20 3. 7g/L ; ZnSO4 · 7H202. 9g/L ;H3B0324. 7g/L ;CuS04 · 5H20 2. 5g/L ;MnCl2 · 4H20 15. 8g/L)，接種時補加 卡那霉素50 μ g/mL，氯霉素50 μ g/mL。
[0057] 2)發(fā)酵培養(yǎng)基
[0058] K2HPO4 · 3H20 9. 8g/L，Citric acid · H2O 2. lg/L，檸檬酸鐵銨 0· 3g/L， (NH4) 2S043. 0g/L，葡萄糖 20g/L，MgSO4 · 7H20 0· 4g/L，1000 X 微量元素（(NH4)6Mo7O24 · 4H20 3. 7g/L ;ZnS04 · 7H20 2. 9g/L ;H3B0324. 7g/L ;CuS04 · 5H20 2. 5g/L ;MnCl2 · 4H20 15. 8g/L)， 卡那霉素50 μ g/mL，氯霉素50 μ g/mL。
[0059] 其中：Κ2ΗΡ04 · 3Η20 9· 8g/L，Citric acid · H2O 2· lg/L，檸檬酸鐵銨 0· 3g/L， (NH4)2S043.0g/L混合后調(diào)至pH 7.0，121°C，20min高壓蒸氣滅菌。葡萄糖儲液為500g/ 1^，1151：，201^11單獨滅菌，]\%504.7!120儲液為20(^/1，1211：，201^11單獨滅菌，1000\微 量元素采用0. 22 μ m濾菌膜過濾除菌，轉(zhuǎn)接種子液時分別補加上述單獨除菌的葡萄糖、 MgSO4 · 7H20、1000 X微量元素儲液及抗生素。
[0060] 實施例1菌株的構(gòu)建
[0061] 以大腸埃希氏桿菌E. coliBL21(DE3)為出發(fā)菌株，敲除基因組中的arcA基因，構(gòu) 建工程菌株ZG1949 (構(gòu)建流程如圖1所示），將生產(chǎn)間苯三酚的相關(guān)質(zhì)粒pET-phlD-mar和 pACYC-accADBC導(dǎo)入ZG1949和對照菌株E. coliBL21 (DE3)中進行搖瓶及發(fā)酵罐水平的間苯 三酚發(fā)酵檢測。
[0062] 本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解，上述大腸埃希氏桿菌E. coliBL21(DE3)的基因敲除實 驗，各個步驟均按照標(biāo)準(zhǔn)的分子克隆技術(shù)進行。
[0063] 1. 1同源臂的構(gòu)建
[0064] 以大腸埃希氏桿菌E. coliBL21 (DE3)野生菌株arcA基因的上游及下游（含arcA 基因部分序列）約600bp堿基片段為模板設(shè)計引物，PCR擴增arcA基因的上游和下游同源 臂片段，利用膠回收試劑盒回收目的基因片段。
[0065] 擴增引物序列為：
[0066] arcA-Up-5'：
[0067] 5'-CGGGGTACCGCTGGCGCTTTCTGAAC-3'
[0068] arcA-Up-3'：
[0069] 5'-GTGAACTGCGCGAGCAGGCTGAAAACCCAGGCAAA-3，
[0070] arcA-Down-5'：
[0071] 5,-GCCTGCTCGCGCAGTTCACG-3'
[0072] arcA-Down-3'：
[0073] 5'-CGAGCTCCGTTTATTAGTTGTATGATGC-3'
[0074] 以回收后的上下游同源臂片段為模板進行搭橋PCR，利用膠回收試劑盒回收同 源臂片段AarcA,限制性內(nèi)切酶KpnI、SacI分別雙酶切同源臂片段AarcA及自殺質(zhì)粒 PRE112,片段與載體按摩爾比2:1的比例在連接酶的作用下16°C過夜酶連，酶連產(chǎn)物42°C 熱激轉(zhuǎn)化E. coIiCCl 18感受態(tài)，PCR篩選獲得陽性克隆，得到重組質(zhì)粒pRE 112-Λ arcA。
[0075] I. 2同源重組
[0076] 將重組質(zhì)粒pRE112-Λ arcA轉(zhuǎn)化至E. coli X 7213，并作為供體菌與 E. coliBL21 (DE3)野生菌株進行兩次同源重組，arcA基因敲除部分約300bp，通過PCR驗證 陽性克隆分子量小于野生菌，得到敲除arcA基因的工程菌株E. coliBL21 (DE3) Λ arcA。
[0077] 驗證引物序列：
[0078] arcA-Up-5'：
[0079] 5'-CGGGGTACCGCTGGCGCTTTCTGAAC-3'
[0080] ID-arcA-3'
[0081] 5'-GCTACATATCCTTCTGTTTAC-3'
[0082] I. 3表達載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞
[0083] 按照TAKARA感受態(tài)制備試劑盒的操作步驟制備野生型對照菌株E. coli BL21 (DE3)及工程菌株ZG1949的感受態(tài)細(xì)胞，將兩種重組質(zhì)粒pET-phlD-mar和 pACYC-accADBC通過熱激法轉(zhuǎn)化至上述制備的感受態(tài)細(xì)胞。
[0084] 實施例2.工程菌株的發(fā)酵實驗
[0085] 2. 1搖瓶發(fā)酵實驗
[0086] 1) 一級種子液的培養(yǎng)，將含有pET-phlD-marA和pACYC-accADBC重組質(zhì)粒的野生 對照菌株E. coliBL21 (DE3)及ZG1949分別接種至3mL LB液體培養(yǎng)基中，并加入50 μ g/mL 卡那霉素和50μ g/mL氯霉素，37°C生長8-12h。
[0087] 2)將一級種子液按1%接種量轉(zhuǎn)接至250mL發(fā)酵搖瓶中，含50mL發(fā)酵培養(yǎng)基，轉(zhuǎn) 接種子液時補加200g/L MgS04. 7H20 100 μ L，500g/L葡萄糖2mL，1000 X微量元素50 μ L， 50 μ g/mL卡那霉素，50 μ g/mL氯霉素雙抗性，每種菌株設(shè)定3個平行對照，37°C、180rpm培 養(yǎng)。
[0088] 3)細(xì)胞0D600達到0· 6-1. 0間即可加入100 μ M/L IPTG誘導(dǎo)。
[0089] 4) IPTG誘導(dǎo)后，37°C、180rpm繼續(xù)培養(yǎng)24h后收集菌液，離心取上清，測定間苯三 酚含量。
[0090] 2. 2分批補料發(fā)酵實驗
[0091] 1) 一級種子液的培養(yǎng)，依據(jù)上述2. 1接種方法
[0092] 2)二級種子液的培養(yǎng)，將一級種子液按1%接種量轉(zhuǎn)接至250mL三角瓶中，含50mL M9培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)接種子液時補加200g/L MgS04. 7H20 100 μ L，500g/L葡萄糖2mL，1000 X微量 元素50 μ L，50 μ g/mL卡那霉素，50 μ g/mL氯霉素雙抗性，37°C、180rpm培養(yǎng)8-12h。
[0093] 3)將二級種子液按1%接種量轉(zhuǎn)接至5L發(fā)酵罐中，含2-3L發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā) 酵，培養(yǎng)溫度37°C、攪拌速度400-800rpm、pH 6. 0-8. 0和溶氧18%以上的條件下培養(yǎng)至 0D600約為8,加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度100uM/L，50% -80%葡萄糖儲液繼續(xù)補料發(fā)酵24 小時，離心取上清，測定間苯三酚含量。
[0094] 2. 3間苯三酚的含量檢測
[0095] 間苯三酚（PG)濃度測定：肉桂醛顯色法
[0096] 米用反 Weisner 檢測法（Wenjuan Zha, Sheryl B. Rubin-Pitel, Huimin Zhao. Exploiting genetic diversity by directed evolution:molecular breeding of type III polyketide synthases improves productivity[J]. Molecular BioSystems，2008, 4(3) :246-248.)測定發(fā)酵液中間苯三酚的含量，其原理是根據(jù)間苯三酚 與肉桂醛的顯色反應(yīng)，具體步驟如下：
[0097] 1)配制10mg/L的肉桂醛顯色液（肉桂醛直接溶解于體積比1:3的濃鹽酸/乙醇 溶液中）。
[0098] 2)向I. 5mL離心管中加入ImL肉桂醛顯色液，再加入5 μ L發(fā)酵液上清，顛倒混勻， 室溫放置15min。
[0099] 3)用IOmm光徑比色杯讀取0D446值，0D446值在2h內(nèi)穩(wěn)定；
[0100] 4)繪制間苯三酚標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算間苯三酚含量。
[0101] 根據(jù)本實施例操作步驟，在含有兩種重組質(zhì)粒pET-phlD-mar和pACYC-accADBC的 基礎(chǔ)上，搖瓶水平，野生對照菌株的PG產(chǎn)量為0. 30g/L，突變菌株ZG1949的產(chǎn)量為0. 93g/ L ;在分批補料發(fā)酵罐水平，野生對照菌株的PG產(chǎn)量為3. 8g/L，突變菌株ZG1949的產(chǎn)量 為11. 2g/L。相同發(fā)酵條件下，在含有兩種重組質(zhì)粒pET-phlD-mar和pACYC-accADBC的 基礎(chǔ)上，搖瓶及發(fā)酵罐水平，本發(fā)明提供的突變菌株ZG1949,間苯三酚的產(chǎn)量比對照菌株 Escherichia coli BL21(DE3)提高了 L 95 倍。
[0102] 實施例3.工程菌株的發(fā)酵實驗
[0103] 3.1搖瓶發(fā)酵實驗
[0104] 1) 一級種子液的培養(yǎng)，依據(jù)實施例2. 1接種方法。
[0105] 2)將一級種子液按3%接種量轉(zhuǎn)接至250mL發(fā)酵搖瓶中，含50mL發(fā)酵培養(yǎng)基，轉(zhuǎn) 接種子液時補加200g/L MgSO4. 7H20 100 μ L，500g/L葡萄糖2mL，1000 X微量元素50 μ L， 50 μ g/mL卡那霉素，50 μ g/mL氯霉素雙抗性，每種菌株設(shè)定3個平行對照，37°C、180rpm培 養(yǎng)。
[0106] 3)細(xì)胞0D600達到0· 6-1. 0間即可加入100 μ M/L IPTG誘導(dǎo)。
[0107] 4) IPTG誘導(dǎo)后，37°C、180rpm繼續(xù)培養(yǎng)24h后收集菌液，離心取上清，測定間苯三 酚含量。
[0108] 3. 2間苯三酚的分批補料發(fā)酵生產(chǎn)
[0109] 1) 一級種子液的培養(yǎng)，依據(jù)實施例2. 1接種方法
[0110] 2)二級種子液的培養(yǎng)，將一級種子液按3 %接種量轉(zhuǎn)接至250mL三角瓶中，含50mL M9培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)接種子液時補加200g/L MgSO4. 7H20 100 μ L，500g/L葡萄糖2mL，1000 X微量 元素50 μ L，50 μ g/mL卡那霉素，50 μ g/mL氯霉素雙抗性，37°C、180rpm培養(yǎng)8-12h。
[0111] 3)將二級種子液按3%接種量轉(zhuǎn)接至5L發(fā)酵罐中，含2-3L發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā) 酵，培養(yǎng)溫度37°C、攪拌速度400-800rpm、pH 6. 0-8. 0和溶氧18%以上的條件下培養(yǎng)至 0D600約為10,加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度lOOuM/L，50 % -80 %葡萄糖儲液繼續(xù)補料發(fā)酵16 小時，離心取上清，測定間苯三酚含量。
[0112] 3. 3間苯三酚的含量檢測
[0113] 間苯三酚的含量測定同實施例2. 3
[0114] 根據(jù)本實施例操作步驟，在含有兩種重組質(zhì)粒pET-phlD-mar和pACYC-accADBC 的基礎(chǔ)上，搖瓶水平，野生對照菌株的PG產(chǎn)量為0. 33g/L，突變菌株ZG1949的PG產(chǎn)量為 0. 84g/L ;在分批補料發(fā)酵罐水平，野生對照菌株的PG產(chǎn)量為3. 5g/L，突變菌株ZG1949的 PG產(chǎn)量為10. lg/L。相同發(fā)酵條件下，在含有兩種重組質(zhì)粒pET-phlD-mar和pACYC-accADBC 的基礎(chǔ)上，搖瓶及發(fā)酵罐水平，本發(fā)明提供的工程菌株ZG1949,間苯三酚的產(chǎn)量比對照菌株 Escherichia coli BL21(DE3)提高了 L 89 倍。
[0115] 實施例4.工程菌株的發(fā)酵實驗
[0116] 4.1搖瓶發(fā)酵實驗
[0117] 1) 一級種子液的培養(yǎng)，依據(jù)上述實施例2. 1接種方法。
[0118] 2)將一級種子液按5%接種量轉(zhuǎn)接至250mL發(fā)酵搖瓶中，含50mL發(fā)酵培養(yǎng)基，轉(zhuǎn) 接種子液時補加200g/L MgSO4. 7H20 100 μ L，500g/L葡萄糖2mL，1000 X微量元素50 μ L， 50 μ g/mL卡那霉素，50 μ g/mL氯霉素雙抗性，每種菌株設(shè)定3個平行對照，37°C、180rpm培 養(yǎng)。
[0119] 3)細(xì)胞00600達到0.6-1.0間即可加入10(^]?/11?丁6誘導(dǎo)。
[0120] 4) IPTG誘導(dǎo)后，37°C、180rpm繼續(xù)培養(yǎng)24h后收集菌液，離心取上清，測定間苯三 酚含量。
[0121] 4. 2間苯三酚的分批補料發(fā)酵生產(chǎn)
[0122] 1) -級種子液的培養(yǎng)，依據(jù)上述實施例2. 1接種方法。
[0123] 2)二級種子液的培養(yǎng)，將一級種子液按5 %接種量轉(zhuǎn)接至250mL三角瓶中，含50mL M9培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)接種子液時補加200g/L MgSO4. 7H20 100 μ L，500g/L葡萄糖2mL，1000 X微量 元素50 μ L，50 μ g/mL卡那霉素，50 μ g/mL氯霉素雙抗性，37°C、180rpm培養(yǎng)8-12h。
[0124] 3)將二級種子液按5%接種量轉(zhuǎn)接至5L發(fā)酵罐中，含2-3L發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā) 酵，培養(yǎng)溫度37°C、攪拌速度400-800rpm、pH 6. 0-8. 0和溶氧18%以上的條件下培養(yǎng)至 0D600約為12,加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度100uM/L，50% -80%葡萄糖儲液繼續(xù)補料發(fā)酵12 小時，離心取上清，測定間苯三酚含量。
[0125] 4. 3間苯三酚的含量檢測
[0126] 間苯三酚的含量測定依據(jù)實施例2. 3
[0127] 根據(jù)本實施例操作步驟，在含有兩種重組質(zhì)粒pET-phlD-mar和pACYC-accADBC 的基礎(chǔ)上，搖瓶水平，野生對照菌株的PG產(chǎn)量為0. 30g/L，突變菌株ZG1949的PG產(chǎn)量為 0. 87g/L ;在分批補料發(fā)酵罐水平，野生對照菌株的PG產(chǎn)量為3. 2g/L，突變菌株ZG1949的 PG產(chǎn)量為9. 8g/L。相同發(fā)酵條件下，在含有兩種重組質(zhì)粒pET-phlD-mar和pACYC-accADBC 的基礎(chǔ)上，搖瓶及發(fā)酵罐水平，本發(fā)明提供的工程菌株ZG1949,間苯三酚的產(chǎn)量比對照菌株 Escherichia coli BL21(DE3)提高了 2. 06 倍。
[0128] 本實施例所列數(shù)據(jù)為多次重復(fù)試驗的平均數(shù)值。
[0129] 雖然本發(fā)明已經(jīng)公開了示例性示范方案，但是本領(lǐng)域人員應(yīng)該理解，在不背離由 后附的權(quán)利要求所定義的本發(fā)明的精神和范圍的條件下，可以進行各種形式和細(xì)節(jié)的變 化，可以進行各種實施方案的任意組合。
【權(quán)利要求】
1. 一種提高間苯三酚產(chǎn)量的基因改造方法，其特征在于，是通過敲除或插入的方式獲 得出發(fā)菌株全局調(diào)控因子arcA基因失活的突變菌株，再將突變菌株轉(zhuǎn)為感受態(tài)后導(dǎo)入含 有聚酮合成酶基因phlD、多重抗性激活因子marA、乙酰CoA羧化酶基因ACCase的重組質(zhì) 粒，獲得重組細(xì)胞。
2. 權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，步驟如下： 1) 通過插入失活或者敲除失活的方式使出發(fā)菌株的全局調(diào)控因子基因arcA失活，獲 得突變菌株； 2) 制備步驟2)所得突變菌株的感受態(tài)細(xì)胞； 3) 制備含有聚酮合成酶基因phlD、多重抗性激活因子marA、乙酰CoA羧化酶基因 ACCase的重組質(zhì)粒； 4) 將步驟3)所得的重組質(zhì)粒導(dǎo)入到步驟2)所得的感受態(tài)細(xì)胞中，獲得重組細(xì)胞。
3. 權(quán)利要求2所述方法，其特征在于，步驟1)所述出發(fā)菌株，是大腸桿菌。
4. 權(quán)利要求3所述方法，其特征在于，所述大腸桿菌，是大腸桿菌E. coliBL21 (DE3)。
5. 權(quán)利要求2所述方法，其特征在于，步驟3)所述聚酮合成酶基因phlD，來源于熒 光假單胞菌；所述多重抗性激活因子marA，來源于大腸桿菌；所述乙酰CoA羧化酶基因 ACCase,來源于大腸桿菌。
6. 權(quán)利要求5所述方法，其特征在于，所述聚酮合成酶基因phlD，GeneBank ID為 11830552 ;所述多重抗性激活因子marA，GeneBank ID為6060688 ;所述乙酰CoA羧化酶 基因 ACCase，其中，亞基 accA 的 GeneBank ID 為 6062185,亞基 accB 的 GeneBank ID 為 6058890,亞基 accC 的 GeneBank ID 為 6058863,亞基 accD 的 GeneBank ID 為 6059083。
7. 權(quán)利要求2所述方法，其特征在于，具體步驟如下： 1) 以大腸桿菌BL21(DE3)為出發(fā)菌株，敲除出發(fā)菌株全局調(diào)控因子基因arcA上300bp 的序列，獲得突變菌株； 所述arcA基因的敲除序列如SEQ ID NO. 1所示； 2) 制備步驟2)所得突變菌株的感受態(tài)細(xì)胞； 3) 將聚酮合成酶基因phlD和多重抗性激活因子marA連接到載體pET30a上，獲得重 組質(zhì)粒pET-phlD-marA ;乙酰CoA羧化酶基因ACCase連接到載體pACYC上，獲得重組質(zhì)粒 pACYC-accADBC ； 所述聚酮合成酶基因phlD，來源于熒光假單胞菌，Genebank ID :11830552 ;所述多重 抗性激活因子marA，來源于大腸桿菌，Genebank ID :6060688 ;所述乙酰CoA羧化酶基因 ACCase，來源于大腸桿菌，其中，亞基accA的Genebank ID :6062185,亞基accB的Genebank ID :6058890,亞基 accC 的 Genebank ID :6058863,亞基 accD 的 Genebank ID :6059083 ; 4) 在將步驟3)所得的重組質(zhì)粒pET-phlD-marA和pACYC-accADBC導(dǎo)入到步驟2)所得 的感受態(tài)細(xì)胞中獲得重組細(xì)胞。
8. 權(quán)利要求1-7所述方法，其特征在于，用于獲得高產(chǎn)間苯三酚的基因工程菌和生產(chǎn) 間苯三酚。
9. 權(quán)利要求8所述方法，其特征在于，步驟如下： 1)以大腸桿菌BL21(DE3)為出發(fā)菌株，敲除出發(fā)菌株全局調(diào)控因子基因arcA上300bp 的序列，獲得突變菌株； 所述arcA基因的敲除序列如SEQ ID NO. 1所示； 2) 制備步驟2)所得突變菌株的感受態(tài)細(xì)胞； 3) 制備含有聚酮合成酶基因phlD、多重抗性激活因子marA、乙酰CoA羧化酶基因 ACCase的重組質(zhì)粒； 4) 將步驟3)所得的重組質(zhì)粒導(dǎo)入到步驟2)所得的感受態(tài)細(xì)胞中，獲得重組細(xì)胞； 5) 通過搖瓶培養(yǎng)或發(fā)酵罐培養(yǎng)步驟4)所得重組細(xì)胞生產(chǎn)間苯三酚。
10.權(quán)利要求9所述方法，其特征在于，步驟5)所述培養(yǎng)，重組細(xì)胞種子液的接種量為 培養(yǎng)基體積的1% -5%，培養(yǎng)溫度為37°C，攪拌速度為400-800rpm，pH6. 0-8. 0,溶氧18% 以上的條件下培養(yǎng)至〇D_為8-12,然后加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度100 y M，利用質(zhì)量分?jǐn)?shù) 50-80%的葡萄糖儲液繼續(xù)補料發(fā)酵12-24h后結(jié)束。
【文檔編號】C12P7/22GK104388457SQ201410722779
【公開日】2015年3月4日 申請日期:2014年12月2日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月2日
【發(fā)明者】咸漠, 趙廣, 劉敏, 張汝兵 申請人:中國科學(xué)院青島生物能源與過程研究所