一種與牡蠣抗病毒特性相關(guān)的snp標(biāo)記及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于分子生物學(xué)與遺傳育種領(lǐng)域，具體是涉及一種與牡蠣抗病毒特性狀相關(guān)的SNP標(biāo)記及其應(yīng)用。SNP標(biāo)記位于長牡蠣TLR免疫通路中TLR2-1(CGI_10005421)單外顯子基因上。本發(fā)明的意義在于可以在苗種繁育時(shí)對親貝進(jìn)行基因型鑒定，通過篩選基因型為A/A或者A/C的親貝，提高后代群體的抗病毒特性。
【專利說明】一種與牡蠣抗病毒特性相關(guān)的SNP標(biāo)記及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)與遺傳育種領(lǐng)域，具體是涉及一種與牡蠣抗病毒特性狀相 關(guān)的SNP標(biāo)記及其應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 長牡蠣，隸屬于軟體動(dòng)物門，瓣鰓綱/雙殼綱。長牡蠣原產(chǎn)于太平洋沿岸的中國、 日本和朝鮮，后被引種到歐美大陸。由于長牡蠣生長速度快，肉味鮮美和環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)等特 點(diǎn)，具有很高的食用和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，逐漸成為我國甚至世界重要養(yǎng)殖的貝類品種。
[0003] 目前為止，全世界范圍內(nèi)多種雙殼貝類中已經(jīng)檢測到OsHV-1，并且OsHV-1已被證 明與幼蟲的大規(guī)模死亡有關(guān)，在繁育季節(jié)幼蟲的大規(guī)模死亡也為養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì) 損失。
[0004] PRR概念由Charles Janeway在1989年第一次提出，最近十幾年關(guān)于細(xì)胞識別微 生物病原的機(jī)制的知識呈爆炸式增長?，F(xiàn)在已經(jīng)很清楚知道幾類模式識別受體家族PRRs 存在于細(xì)胞微環(huán)境里，可以識別并病毒侵染。TLR家族是目前研究較多而且最清楚的PRR家 族之一。皰疹病毒顆?？杀籘LR2識別，TLR2可能識別皰疹病毒的糖蛋白，然后誘導(dǎo)促炎癥 細(xì)胞因子的表達(dá)。
[0005] SNP是單核苷酸多態(tài)性，作為最新一代的分子標(biāo)記，SNP在海洋水產(chǎn)遺傳、育種等 領(lǐng)域已經(jīng)逐漸顯示出巨大的應(yīng)用潛力。在牡蠣基因組中平均每20-30bp就會(huì)有一個(gè)SNP存 在。SNP分析技術(shù)按研究對象的性質(zhì)主要分為兩大類：一是對未知的SNP進(jìn)行分析，即確定 某段序列中有無SNP的存在，或者是確定某一未知SNP與某種性狀是否存在關(guān)聯(lián)；二是對已 知的SNP進(jìn)行分析，即對不同群體或者個(gè)體中進(jìn)行已知SNP位點(diǎn)基因型的分析，逐一確定每 一個(gè)個(gè)體針對某一個(gè)SNP的基因型，進(jìn)而開展后續(xù)基因定位或者關(guān)聯(lián)分析等研究工作。發(fā) 明內(nèi)容
[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種與牡蠣抗病毒特性性狀相關(guān)的SNP標(biāo)記及其應(yīng)用。
[0007] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：
[0008] -種與長牡販抗病毒特性相關(guān)的SNP標(biāo)記，SNP標(biāo)記位于長牡販TLR免疫通路中 TLR2-1(CGI_10005421)單外顯子基因上。
[0009] 所述SNP標(biāo)記位于TLR2-1基因蛋白質(zhì)分子的亮氨酸富集C端識別結(jié)構(gòu)域 (Leucine rich repeat C-termina 1 domain)上。
[0010] 所述SNP標(biāo)記位于SEQ ID NO. 1所示5'端第858個(gè)堿基處（SEQ ID NO. 1所示堿 基序列所編碼的氨基酸序列的第286個(gè)氨基酸處）的堿基為A或C。
[0011] 所述SNP在基因組DNA中的基因型為A/A、A/C或C/C。
[0012] 一種權(quán)利要求1所述的與長牡蠣抗病毒特性相關(guān)的SNP標(biāo)記的應(yīng)用，所述SNP標(biāo) 記在鑒定苗種繁育前親貝的抗病毒基因型中的應(yīng)用。
[0013] 與長牡蠣抗病毒特性性狀相關(guān)的SNP標(biāo)記的鑒定方法，包括步驟如下：
[0014] 1)使用OsHV-1 (牡蠣皰疹一型病毒）人工感染野生長牡蠣群體，篩選最先死亡的 100個(gè)個(gè)體（TM組）和最后死亡的100個(gè)個(gè)體（TF組）。
[0015] 2)提取步驟1)中兩組長牡蠣個(gè)體基因組DNA。
[0016] 3)取上述步驟2)中TM組的所得100個(gè)個(gè)體DNA，將各個(gè)體的DNA等量混合作為 TM混池；取TF組的所得100個(gè)個(gè)體DNA，將各個(gè)體的DNA等量混合作為TF混池。
[0017] 4)將步驟3)所得兩個(gè)基因混池利用二代測序技術(shù)進(jìn)行全基因組重測序。
[0018] 5)步驟4)所述的重測序結(jié)束后，將兩個(gè)混池測序所得序列與牡蠣基因組做比對， 進(jìn)行全基因組SNP位點(diǎn)的篩查；
[0019] 6)選取牡蠣免疫相關(guān)關(guān)鍵通路基因作為候選基因，設(shè)計(jì)引物，SNP位點(diǎn)的特異性 引物序列為（濃度10uM) :
[0020] 正向引物序列 F: 5 ' -GAATATTATCTAITCACTACATACCTGACATG-3，；
[0021] 反向引物序列 R: 5 ' -GGATCAATATGTACTAGITTGITGAAGG-3，
[0022] 利用PCR體外擴(kuò)增技術(shù)對候選基因目的片段進(jìn)行體外擴(kuò)增。PCR反應(yīng)程序：
[0023]

【權(quán)利要求】
1. 一種與長牡蠣抗病毒特性相關(guān)的SNP標(biāo)記，其特征在于：SNP標(biāo)記位于長牡蠣TLR免 疫通路中TLR2-1(CGI_10005421)單外顯子基因上。
2. 按權(quán)利要求1所述的與長牡蠣抗病毒特性相關(guān)的SNP標(biāo)記，其特征在于：所述SNP 標(biāo)記位于TLR2-1基因蛋白質(zhì)分子的亮氨酸富集C端識別結(jié)構(gòu)域（Leucine rich repeat C-terminal domain)上。
3. 按權(quán)利要求1或2所述的與長牡蠣抗病毒特性相關(guān)的SNP標(biāo)記，其特征在于：所述 SNP標(biāo)記位于SEQ ID NO. 1所示5'端第858個(gè)堿基處（SEQ ID NO. 1所示堿基序列所編碼 的氨基酸序列的第286個(gè)氨基酸處），堿基類型為A或C。
4. 按權(quán)利要求3所述的與長牡蠣抗病毒特性相關(guān)的SNP標(biāo)記，其特征在于：所述SNP在 基因組DNA中的基因型為A/A、A/C或C/C。
5. -種權(quán)利要求1所述的與長牡蠣抗病毒特性相關(guān)的SNP標(biāo)記的應(yīng)用，其特征在于： 所述SNP標(biāo)記在鑒定苗種繁育前親貝的抗病毒基因型中的應(yīng)用。
6. -種用于檢測與長牡蠣抗病毒特性相關(guān)的SNP標(biāo)記的特異性引物，其特征在于：特 異性引物為： 正向引物序列 F: 5 ' -GAATATTATCTAITCACTACATACCTGACATG-3 ' ； 反向引物序列 R: 5 ' -GGATCAATATGTACTAGITTGITGAAGG-3 '。
7. -種用于檢測與長牡蠣抗病毒特性相關(guān)的SNP標(biāo)記的試劑盒，其特征在于：試劑盒 含有 正向引物序列 F: 5 ' -GAATATTATCTAITCACTACATACCTGACATG-3 ' ； 反向引物序列 R: 5 ' -GGATCAATATGTACTAGITTGITGAAGG-3 '。
【文檔編號】C12Q1/68GK104450697SQ201410723155
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年12月2日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月2日
【發(fā)明者】管旭東, 張琳琳, 李莉, 張國范 申請人:中國科學(xué)院海洋研究所