一種重組阿魏酸酯酶的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種重組阿魏酸酯酶的制備方法，利用阿魏酸酯酶O42807，密碼子優(yōu)化后人工合成其基因fae、構(gòu)建pAO815-fae表達(dá)載體、構(gòu)建pPIC9K-fae表達(dá)載體以及將pPIC9K-fae表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至畢赤酵母GS115中表達(dá)，得到重組阿魏酸酯酶，SDS-PAGE分析顯示其發(fā)酵上清液為單一條帶，表觀分子量為42kDa，酶活為4.7U/mL，比酶活力為31.4U/mg，最適反應(yīng)溫度為50℃，最適pH為5.0～5.5。本發(fā)明獲得了1株高效表達(dá)的重組阿魏酸酯酶轉(zhuǎn)化子，與阿魏酸酯酶O42807相比其表達(dá)效率和表達(dá)量大大提高。
【專利說明】-種重組阿魏酸酯酶的制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種重組阿魏酸酯酶的制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 植物細(xì)胞壁中，酚酸類物質(zhì)（如阿魏酸、咖啡酸、對香豆酸等）通過酯鍵與多糖 (如阿拉伯木聚糖、果糖）的阿拉伯糖基或半乳糖基相連，或者通過醚鍵與木質(zhì)素相連，形 成致密的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。阿魏酸酯酶（EC 3. 1. 1.73, Ferul ic acid esterases, FAE)又名肉桂 酸酯酶，它能水解阿魏酸酯、低聚糖阿魏酸酯和多糖阿魏酸酯中的酯鍵，釋放出阿魏酸等功 能性物質(zhì)。阿魏酸酯酶可以輔助木聚糖酶、木質(zhì)素酶破壞這種致密的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，使細(xì)胞壁結(jié) 構(gòu)變得疏松，從而促進(jìn)木質(zhì)纖維素完全降解。在工業(yè)和農(nóng)業(yè)中阿魏酸酯酶均有重要作用。
[0003] 至今已經(jīng)從細(xì)菌和真菌中分離得到40多種阿魏酸酯酶，但目前報道的阿魏酸酯 酶的酶活及表達(dá)量都達(dá)不到工業(yè)需要。其次，阿魏酸酯酶的分離提取過程相對復(fù)雜，難以滿 足工業(yè)化生產(chǎn)。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，已經(jīng)有多個阿魏酸酯酶編碼基因被克隆，利用現(xiàn)代 生物學(xué)技術(shù)來改良微生物，使獲得高產(chǎn)阿魏酸酯酶菌株成為可能。畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)比大 腸桿菌體系有更完備的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制及對表達(dá)產(chǎn)物的加工修飾能力，并具有原核細(xì)胞 系統(tǒng)生長速度快、便于基因操作和可工業(yè)化大規(guī)模培養(yǎng)等優(yōu)點。畢赤酵母可高密度的發(fā)酵 培養(yǎng)，其菌體量可達(dá)130g/L干細(xì)胞重，其在生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白動物飼料方面發(fā)揮重要作用。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，提供了一種重組阿魏酸酯酶的制備 方法，構(gòu)建了分泌型重組質(zhì)粒pPIC9K-fae，獲得了 1株高效表達(dá)的重組阿魏酸酯酶轉(zhuǎn)化子， 與阿魏酸酯酶042807相比其表達(dá)效率和表達(dá)量大大提高。
[0005] 本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案之一是：
[0006] -種重組阿魏酸酯酶的制備方法，包括：
[0007] 1)獲得目的基因fae :根據(jù)阿魏酸酯酶的氨基酸序列，以畢赤酵母標(biāo)準(zhǔn)密碼子優(yōu) 化設(shè)計阿魏酸酯酶的基因序列，并在基因序列的兩端分別引入Hindlll和EcoR I酶切位點， 化學(xué)合成如SEQ ID NO. 1所示的基因序列，命名為fae ;
[0008] 2)構(gòu)建pA0815_fae表達(dá)載體：用Hind III和EcoR I雙酶切合成的基因序列fae， 連接到經(jīng)同樣雙酶切的PA0815上并轉(zhuǎn)化至E. coli DH5 a感受態(tài)細(xì)胞，得到重組質(zhì)粒命名 為 pA0815_fae ;
[0009] 3)構(gòu)建pPIC9K_fae表達(dá)載體：以重組質(zhì)粒pA0815_fae為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR 產(chǎn)物用SnaB I和Not I雙酶切，連接到經(jīng)同樣雙酶切的pPIC9K上并轉(zhuǎn)化至E. coli DH5 a 感受態(tài)細(xì)胞，得到重組質(zhì)粒命名為pPIC9K_fae ;
[0010] 4) fae在畢赤酵母中表達(dá)：用Bgl II線性化pPIC9K_fae，電轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115， 涂布于MD平板，篩選MD平板上生長良好的菌落點種至含G418的YH)搖瓶中，篩選抗G418 的重組子，命名為GS115/pPIC9K-fae ;根據(jù)畢赤酵母操作表達(dá)手冊進(jìn)行GS115/pPIC9K-fae 的誘導(dǎo)表達(dá)，得到重組阿魏酸酯酶。
[0011] 一實施例中：所述步驟1)中，根據(jù)阿魏酸酯酶042807成熟肽的氨基酸序列， 以畢赤酵母標(biāo)準(zhǔn)密碼子優(yōu)化設(shè)計阿魏酸酯酶的基因序列，并在基因序列的兩端分別引入 把11(1111和￡(3〇1?1酶切位點，化學(xué)合成如3￡0 10勵.1所示的基因序列，命名為€&6。
[0012] 一實施例中：所述步驟3)中PCR擴(kuò)增條件為：
[0013] 上游引物：如SEQIDN0. 3所示；
[0014] 下游引物：如SEQ ID NO. 4所示；
[0015] 反應(yīng)條件：93?95°C變性29?31s，54?56°C退火29?31s，71?73°C延伸 0.9?1. lmin，重復(fù)所述變性-退火-延伸共29?31個循環(huán)后，71?73°C延伸9. 9? 10.lmin〇
[0016] 本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案之二是：
[0017] 一種重組阿魏酸酯酶，所述重組阿魏酸酯酶的基因序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0018] 本技術(shù)方案與【背景技術(shù)】相比，它具有如下優(yōu)點：
[0019] 本發(fā)明的一種重組阿魏酸酯酶的制備方法成功構(gòu)建了分泌型重組質(zhì)粒 pPIC9K-fae，獲得了 1株高效表達(dá)的重組阿魏酸酯酶轉(zhuǎn)化子，與阿魏酸酯酶042807相比其 表達(dá)效率和表達(dá)量大大提高；得到的重組阿魏酸酯酶SDS-PAGE分析顯示其為單一條帶，表 觀分子量為42kDa，酶活為4. 7U/mL，比酶活力為31. 4U/mg，最適反應(yīng)溫度為50°C，最適pH 為 5. 0 ?5. 5。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0020] 下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
[0021] 圖1所示為表達(dá)載體pA0815_fae示意圖。
[0022] 圖2所示為表達(dá)載體pPIC9K_fae示意圖。
[0023] 圖3所示為GS115/pPIC9K_fae轉(zhuǎn)化子PCR電泳圖譜。
[0024] 泳道1 :以pPIC9K_fae質(zhì)粒為模板；泳道2 :以無菌水為對照；泳道3 :DNAMarker ; 泳道4?8 :以GS115/pPIC9K-fae轉(zhuǎn)化子為模板；泳道9 :以質(zhì)粒pPIC9K轉(zhuǎn)化菌株GS115/9K 為模板。
[0025] 圖4所示為SDS-PAGE分析產(chǎn)物的表達(dá)。
[0026] 泳道1 :GS115/pPIC9K發(fā)酵上清液；泳道2 :蛋白Marker ;泳道3?10 :重組子 GS115/pPIC9K-fae 經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng) 0、12、24、48、72、96、120、144h 的發(fā)酵上清液。
[0027] 圖5所示為GS115/pPIC9k_fae表達(dá)量的測定。
[0028] 圖6所示為溫度對重組阿魏酸酯酶活性的影響。
[0029] 圖7所示為pH對重組阿魏酸酯酶活性的影響

【具體實施方式】
[0030] 下面通過實施例具體說明本發(fā)明的內(nèi)容：
[0031] 實施例1 :重組阿魏酸酯酶的制備
[0032] 1)獲得目的基因fae :UniProt數(shù)據(jù)庫中篩選高酶活的阿魏酸酯酶042807的氨基 酸序列，該阿魏酸酯酶042807是De Vries RP等從黑曲霉（Aspergillus niger)CBS120. 49 中分離得到的，屬于胞外酶；阿魏酸酯酶042807的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示，根據(jù) 042087的成熟肽序列（如SEQ ID NO. 2所示，22?281為成熟肽序列）以畢赤酵母標(biāo)準(zhǔn)密 碼子優(yōu)化設(shè)計阿魏酸酯酶的基因序列，并在基因序列的兩端分別引入HindIII和EcoRI酶 切位點，化學(xué)合成如SEQ ID NO. 1所示的基因序列，命名為fae ;
[0033] 2)構(gòu)建pA0815_fae表達(dá)載體：用HindIII和EcoRI分別雙酶切合成的基因序列 fae和質(zhì)粒pA0815,膠回收雙酶切片段后用T4DNA連接酶連接并轉(zhuǎn)化至E. coli DH5a感受 態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化具體條件如下：取200 iiL的E. coli DH5 a感受態(tài)細(xì)胞與10 yL連接產(chǎn)物（即 上述雙酶切片段）混勻，冰浴30min ;于42°C下熱激45s，迅速冰浴靜置5min ;加入800iiL LB液體培養(yǎng)基，于37°C搖床上低速搖動lh，6000rpm離心2min，去部分上清，留下約200 ii L 上清；重懸細(xì)胞沉淀并涂布含100 U g/mL Amp的LB平板，37°C倒置培養(yǎng)14?16h，篩選出 的陽性克隆子（長出的菌落）由Sangon(生工生物工程（上海）股份有限公司）測序，測 序正確的重組質(zhì)粒命名為pA0815_fae (如圖1所示）；
[0034] 3)構(gòu)建pPIC9K_fae表達(dá)載體：以重組質(zhì)粒pA0815_fae為模板，采用上游引物5' -TACGTAGCCTCTACTCAGGGGATCAGT-3'（如SEQ ID N0. 3所示）及下游引物5'-AATATGCGGCCGC TTACCAAGTACAAGCCCCG-3'（如 SEQ ID NO. 4 所示）進(jìn)行擴(kuò)增，PCR 反應(yīng)條件：94°C變性 30s， 55°C退火30s，72°C延伸lmin，重復(fù)所述變性-退火-延伸共30個循環(huán)后，72°C延伸10min。 PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收用SnaB I和Not I雙酶切，連接到經(jīng)同樣雙酶切的pPIC9K上并轉(zhuǎn)化至 E. coli DH5 a感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化具體條件同2)，篩選出的陽性克隆子由Sangon測序，測序 正確的重組質(zhì)粒命名為pPIC9K_fae (如圖2所示）；
[0035] 4) fae在畢赤酵母中表達(dá)：用BglII線性化pPIC9K_fae，所述線性化具體條件為： 利用Bgl II將pPIC9K-fae于37°C水浴4h進(jìn)行單酶切線性化，酶切體系為：10XTango Buffer 2 ii L、pPIC9K-fae 10 ii L、無菌水7 ii L、Bgl II 1 ii L。線性化后電轉(zhuǎn)化至畢赤酵 母GS115,所述電轉(zhuǎn)化具體條件為：取80 y L畢赤酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞與線性化的DNA輕 輕混勻，轉(zhuǎn)移到冰上預(yù)冷的0. 2cm的電轉(zhuǎn)杯中；冰上放置5min，1. 5KV?1. 7KV、200 Q電擊 5ms，立即加入lmL預(yù)冷的1M的山梨醇，轉(zhuǎn)入2mL EP管中28?30°C靜置培養(yǎng)1?2h;力口 入lmL YH)液體培養(yǎng)基30°C、200rpm搖4h ;涂布于MD平板上篩選重組子，取MD平板上生 長良好的菌落用牙簽點種至含G418的YH)搖瓶中，篩選抗G418的重組子，命名為GS115/ pPIC9K_fae ;根據(jù)Invitrogen公司畢赤酵母操作表達(dá)手冊進(jìn)行GS115/pPIC9K_fae的誘導(dǎo) 表達(dá)，得到重組阿魏酸酯酶。
[0036] 實施例 2 :GS115/pPIC9K_fae 的鑒定
[0037] 提取實施例1中得到的GS115/pPIC9K_fae的基因組DNA，利用通用引物5' A0X和 3' A0X進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果如圖3所示，GS115/pPIC9K-fae構(gòu)建成功。
[0038] 實施例3 :GS115/pPIC9K_fae表達(dá)量的測定
[0039] 重組酵母GS115/pPIC9K_fae的誘導(dǎo)表達(dá)參考Invitrogen公司畢赤酵母操作表達(dá) 手冊，甲醇誘導(dǎo)每隔12h或24h，取發(fā)酵上清液進(jìn)行SDS-PAGE分析，以測定重組阿魏酸酯酶 表達(dá)量。如圖4所示，在42kDa得到一條清晰條帶，而且?guī)缀鯖]有雜條帶，初步說明fae得 到成功表達(dá)。利用Bradford法測定重組阿魏酸酯酶蛋白含量，HPLC法測定酶活，測定結(jié)果 如圖5所示,酶活為4. 7U/mL,比酶活力為31. 4U/mg,。
[0040] 實施例4 :重組阿魏酸酯酶粗酶酶學(xué)性質(zhì)的研究
[0041] 1)最適反應(yīng)溫度的測定：取250i! L實施例1中得到的重組阿魏酸酯酶酶液保溫 5min后，加入250iiL阿魏酸甲酯溶液（由pH5. 0檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液配置），在 40?70°C中反應(yīng)lOmin，測定重組阿魏酸酯酶的酶活；以所測的最高酶活為100%，計算相 對酶活并繪制相對酶活-pH值曲線；如圖6所示，50°C之前重組阿魏酸酯酶的酶活較高，相 對酶活都在80%以上；重組阿魏酸酯酶的最適作用溫度為50°C。超過50°C后重組阿魏酸 酯酶的酶活下降較快。
[0042] 2)最適反應(yīng)pH值的測定：取250 ii L實施例1中得到的重組阿魏酸酯酶酶液50°C 保溫5min后，加入250 ii L的阿魏酸甲酯溶液（0. 2mol/L的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液調(diào) 節(jié)pH在4. 0?7. 0之間），50°C下反應(yīng)lOmin，測定殘留酶活；以所測的最高酶活為100%， 計算相對酶活并繪制相對酶活-pH值曲線；如圖7所示，pH為5. 0?5. 5,重組阿魏酸酯酶 的酶活最大。
[0043] 以上所述，僅為本發(fā)明較佳實施例而已，故不能依此限定本發(fā)明實施的范圍，即依 本發(fā)明專利范圍及說明書內(nèi)容所作的等效變化與修飾，皆應(yīng)仍屬本發(fā)明涵蓋的范圍內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1. 一種重組阿魏酸酯酶的制備方法，其特征在于：包括： 1) 獲得目的基因 fae :根據(jù)阿魏酸酯酶的氨基酸序列，以畢赤酵母標(biāo)準(zhǔn)密碼子優(yōu)化設(shè) 計阿魏酸酯酶的基因序列，并在基因序列的兩端分別引入Hind III和EcoR I酶切位點，化 學(xué)合成如SEQ ID NO. 1所示的基因序列，命名為fae ; 2) 構(gòu)建pA0815_fae表達(dá)載體：用Hind III和EcoR I雙酶切合成的基因序列fae，連 接到經(jīng)同樣雙酶切的PA0815上并轉(zhuǎn)化至E. coli DH5 a感受態(tài)細(xì)胞，得到重組質(zhì)粒命名為 pA0815-fae； 3) 構(gòu)建pPIC9K-fae表達(dá)載體：以重組質(zhì)粒pA0815-fae為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn) 物用SnaB I和Not I雙酶切，連接到經(jīng)同樣雙酶切的pPIC9K上并轉(zhuǎn)化至E. coliDH5 a 感受態(tài)細(xì)胞，得到重組質(zhì)粒命名為pPIC9K_fae ; 4. fae在畢赤酵母中表達(dá)：用Bgl II線性化pPIC9K_fae，電轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115,涂布 于MD平板，篩選MD平板上生長良好的菌落點種至含G418的YTO搖瓶中，篩選抗G418的重 組子，命名為GS115/pPIC9K-fae ;根據(jù)畢赤酵母操作表達(dá)手冊進(jìn)行GS115/pPIC9K-fae的誘 導(dǎo)表達(dá)，得到重組阿魏酸酯酶。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種重組阿魏酸酯酶的制備方法，其特征在于：所述步驟1) 中，根據(jù)阿魏酸酯酶042807成熟肽的氨基酸序列，以畢赤酵母標(biāo)準(zhǔn)密碼子優(yōu)化設(shè)計阿魏酸 酯酶的基因序列，并在基因序列的兩端分別引入Hind III和EcoR I酶切位點，化學(xué)合成如 SEQ ID NO. 1所示的基因序列，命名為fae。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種重組阿魏酸酯酶的制備方法，其特征在于：所述步驟3) 中PCR擴(kuò)增條件為： 上游引物：如SEQ ID N0. 3所示； 下游引物：如SEQ ID NO. 4所示； 反應(yīng)條件：93?95°C變性29?31s，54?56°C退火29?31s，71?73°C延伸0? 9? 1. lmin，重復(fù)所述變性-退火-延伸共29?31個循環(huán)后，71?73°C延伸9. 9?10. lmin。
4. 一種重組阿魏酸酯酶，其特征在于：所述重組阿魏酸酯酶的基因序列如SEQ ID NO. 1 所示。
【文檔編號】C12N9/18GK104450644SQ201410724759
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年12月3日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月3日
【發(fā)明者】李夏蘭, 張光亞, 陳云華, 陳培欽, 葛慧華 申請人:華僑大學(xué)