具有高產(chǎn)紫杉醇特性的紅豆杉細(xì)胞株及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種具有高產(chǎn)紫杉醇特性的紅豆杉細(xì)胞株（ Taxus wallichiana var.mairei ） ，命名為：南方紅豆杉植物細(xì)胞系NO51-3，由中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏號CGMCCNo.10002。本發(fā)明更進(jìn)一步公開了紫杉醇（Paclitaxel，CASNO:33069-62-4，常用商品名Taxol作通用名）高產(chǎn)細(xì)胞系的篩選和建立，本發(fā)明從紅豆杉外植體中誘導(dǎo)篩選出一株高產(chǎn)紫杉醇的細(xì)胞系，實驗結(jié)果證明：該細(xì)胞系高產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物紫杉醇等紫杉烷類化合物，可作為原料藥用于治療卵巢癌和乳腺癌等。
CGMCC No10002
20141119
【專利說明】具有高產(chǎn)紫杉醇特性的紅豆杉細(xì)胞株及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于植物細(xì)胞培養(yǎng)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種具有高產(chǎn)紫杉醇特性的紅豆杉 細(xì)Far. 用。

【背景技術(shù)】
[0002] 紫杉醇是從紅豆杉屬植物中分離得到的一種抗癌藥物，已被證明對治療卵巢癌、 乳腺癌及肺癌等有效。目前紫杉醇的提取都是以紅豆杉屬植物的樹皮為原料，不僅破壞環(huán) 境，危及紅豆杉資源，且因紅豆杉屬植物生長緩慢，紫杉醇含量較低，所以藥源奇缺，價格昂 貴。另外，全化學(xué)合成雖然已經(jīng)成功，但是因為成本價格較高無法實現(xiàn)實際工業(yè)生產(chǎn)。因 此，必須尋找可替代化學(xué)合成的途徑，利用紅豆杉植物組織、細(xì)胞培養(yǎng)法生產(chǎn)紫杉醇是解決 途徑之一。
[0003] 進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)，目前提取物紫杉醇的含量低是制約因素，必須進(jìn)行高產(chǎn)細(xì)胞株 的篩選和培養(yǎng)，才能解決。因此要從愈傷組織篩選開始，選出高產(chǎn)細(xì)胞株，進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，培 養(yǎng)成高產(chǎn)優(yōu)良性狀的能連續(xù)繼代的細(xì)胞系。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種高產(chǎn)紫杉醇的紅豆杉細(xì)胞株。為了解決此問題，本發(fā)明 所采用的技術(shù)方案是 ： 一種具有高產(chǎn)紫杉醇特性的紅豆杉細(xì)胞株ra_r. ffiairei)，命名 為：南方紅豆杉植物細(xì)胞系N051-3,由中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保 藏，保藏號 CGMCC No. 10002。
[0005] 本發(fā)明進(jìn)一步公開了具有高產(chǎn)紫杉醇特性的紅豆杉細(xì)胞株 rar. ffiairei)，保藏號CGMCC No. 10002的用途，主要用于制備抗癌藥制劑的原料。實驗結(jié) 果顯示：獲得紫杉醇產(chǎn)量最低達(dá)50 mg/L，最高可以達(dá)323mg/L。
[0006] 本發(fā)明更進(jìn)一步公開了具有高產(chǎn)紫杉醇特性的紅豆杉細(xì)胞株（ rar. 保藏號CGMCC No. 10002的篩選方法，其特征在于按如下的步 驟進(jìn)行： (1)外植體誘導(dǎo)獲得愈傷組織。
[0007] (2)愈傷組織穩(wěn)定繼代生長 (3)固體愈傷細(xì)胞小細(xì)胞團(tuán)法選種。
[0008] 本發(fā)明還公開了采用紫杉醇特性的紅豆杉細(xì)胞株，生產(chǎn)紫杉醇的方法，其特征在 于： (1)固體愈傷細(xì)胞自然生產(chǎn)。
[0009] (2)液體懸浮培養(yǎng)自然生產(chǎn)。
[0010] (3)液體懸浮培養(yǎng)用組合調(diào)控的方法獲得高產(chǎn)。
[0011] 具體是將懸浮細(xì)胞接種按照稱重法接種鮮細(xì)胞至TA調(diào)控培養(yǎng)基，培養(yǎng)基用100mL 三角瓶裝量20mL，接種量為鮮重6g/瓶，暗培養(yǎng)，100轉(zhuǎn)/分，采用25°C培養(yǎng)；分兩步法培養(yǎng)， 總生產(chǎn)周期28天。在細(xì)胞培養(yǎng)的第4天添加甲基茉莉酸100 y M，第28天收獲細(xì)胞和培養(yǎng) 液。結(jié)果：紫杉醇產(chǎn)量達(dá)50-323 mg/L。
[0012] 本發(fā)明還公開了具有高產(chǎn)紫杉醇特性的紅豆杉細(xì)胞株rar. ffiairei)通過特異性擴(kuò)增18S rDNA的部分ITS片段與南方紅豆杉序列進(jìn)行比對，序列一致， 其特征在于從基因角度證明該紫杉醇高產(chǎn)細(xì)胞系屬于南方紅豆杉。
[0013] 本發(fā)明更加詳細(xì)的技術(shù)內(nèi)容如下： (1)本發(fā)明提供的具有高產(chǎn)紫杉醇特性的紅豆杉細(xì)胞株（raros rar. aairei入命名為：南方紅豆杉植物細(xì)胞系N051-3,所述的細(xì)胞系是由北京市朝陽區(qū)北辰 西路1號院3號，中國普通微生物菌種保藏管理中心保藏，命名南方紅豆杉植物細(xì)胞系 N051-3,保藏日期2014年11月19日，保藏號CGMCC No. 10002,分類學(xué)名稱，曾用名7^狀 mairei, Taxus chinensis var. mairei Cheng et L. K，最氣分類學(xué)筆 Taxus wallichiana var. mairei 〇
[0014] (2)紫杉醇特性的紅豆杉細(xì)胞株（Tkras rar. 的培養(yǎng)特征 及生理生化指標(biāo)： 1)本細(xì)胞株搖瓶液體細(xì)胞系生長穩(wěn)定，生長量1. 8-3倍/14天，適應(yīng)生長溫度25°C，暗 培養(yǎng)，生長最適起始pH值5. 8,蔗糖濃度20g/L。
[0015] 2)本細(xì)胞株固體細(xì)胞偏干，淺棕色，培養(yǎng)基底部分泌紅色物質(zhì)，培養(yǎng)周期21天； 3)本細(xì)胞株懸浮細(xì)胞，細(xì)胞淺棕，顆粒飽滿，大小均勻，像小米粒，上清培養(yǎng)液淺棕色， 含白色混濁物的膠體溶液。
[0016] (3)紫杉醇特性的紅豆杉細(xì)胞株（Taxus wallichiana var. mairei)的 18S rDNA ITS基因序列為SEQ ID NO. 1:

【權(quán)利要求】
1. 一種具有高產(chǎn)紫杉醇特性的紅豆杉細(xì)胞株（Tkras rar. 命 名為：南方紅豆杉植物細(xì)胞系N051-3,由中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心 保藏，保藏號CGMCC No. 10002。
2. 權(quán)利要求1所述具有高產(chǎn)紫杉醇特性的紅豆杉細(xì)胞株（Tkras rar. aairei入保藏號CGMCC No. 10002在制備抗癌藥紫杉醇原料藥方面的應(yīng)用。
3. 權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其中所述的抗癌藥紫杉醇原料藥指的是制劑原料方面的應(yīng) 用。
4. 權(quán)利要求1所述具有高產(chǎn)紫杉醇特性的紅豆杉細(xì)胞株rar. 入保藏號CGMCC No. 10002的篩選方法，其特征在于按如下的步驟進(jìn)行： (1) 外植體誘導(dǎo)愈傷細(xì)胞； (2) 愈傷組織穩(wěn)定繼代生長； (3) 固體愈傷細(xì)胞小細(xì)胞團(tuán)法選種。
5. -種采用具有高產(chǎn)紫杉醇特性的紅豆杉細(xì)胞株生產(chǎn)紫杉醇的方法，其特征在于： (1) 固體愈傷細(xì)胞自然生產(chǎn)； (2) 液體懸浮培養(yǎng)自然生產(chǎn)； (3) 液體懸浮培養(yǎng)組合調(diào)控的方法獲得高產(chǎn)。
6. 權(quán)利要求1所述具有高產(chǎn)紫杉醇特性的紅豆杉細(xì)胞株rar. ?airei)18S rDNA的部分ITS片段，此18S的部分ITS片段與南方紅豆杉序列進(jìn)行比對，序 列一致，其特征在于從基因角度證明該紫杉醇高產(chǎn)細(xì)胞系屬于南方紅豆杉。
【文檔編號】C12P17/02GK104450601SQ201410726199
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年12月4日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月4日
【發(fā)明者】張衛(wèi), 王麗, 丁靖志, 孫波, 呂建明 申請人:天津艾賽博生物技術(shù)有限公司