酶法生產(chǎn)乳果低聚糖的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種酶法生產(chǎn)乳果低聚糖，包括以下步驟：將氯酚節(jié)桿菌 SK33.001 接入種子培養(yǎng)基中，于30℃下培養(yǎng) 12h ；種子液接種量為1%，發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵 0.8-2h 生產(chǎn)果聚糖蔗糖酶 ；向質量濃度分別為27%的蔗糖、乳糖溶液中添加果聚糖蔗糖酶及50mg/L Zn2+催化轉化得到含有低聚乳果糖的酶反應液；脫色；濃縮，即得低聚乳果糖糖漿。本發(fā)明用于生產(chǎn)乳果低聚糖操作簡單、作用條件溫和、易掌握，產(chǎn)物純度高，生產(chǎn)周期短，大大提高了酶法生產(chǎn)乳果低聚糖的產(chǎn)量，是發(fā)酵工藝中的重大的創(chuàng)新，值得推廣。
【專利說明】酶法生產(chǎn)乳果低聚糖
[0001](一)

【技術領域】
本發(fā)明涉及乳果糖，具體涉及酶法生產(chǎn)乳果低聚糖。
[0002](二)

【背景技術】
乳果低聚糖是功能性低聚糖中的一種，低甜度，低熱量，難以被人體消化，具有促進雙歧桿菌增殖，抑制致病菌產(chǎn)生、抗齲齒、調整腸道功能、降血脂、降膽固醇、促進礦物質吸收等生理功能。隨著人們生活水平的提高，功能保健食品對人們健康所起的作用越來越受到重視，功能性低聚糖因具有獨特的生理功能而成為重要的功能性食品基料，已引起全世界廣泛的關注。我國自1996年開始低聚糖的生成，2000年總產(chǎn)量越3萬噸，他們替代了或部分替代蔗糖而廣泛應用于乳制品、飲料、糖果等各類食品中。
[0003]酶法合成是工業(yè)化生產(chǎn)低聚乳果糖的主要途徑。酶法合成主要有兩種方法:一是利用半乳糖苷轉移酶將乳糖分解產(chǎn)生的β_半乳糖基轉移至蔗糖中葡萄糖的C4羥基上，如β-半乳糖苷酶；二是利用果糖基轉移酶將蔗糖分解產(chǎn)生的果糖基轉移至乳糖還原性末端的Cl輕基上,適合的酶類有果聚糖鹿糖酶(Ievansucrase )和β -呋喃果糖苷酶(β-fructofuransidase)。酶法合成低聚乳果糖的產(chǎn)率低、反應時間長一直是制約酶法合成低聚乳果糖發(fā)展的中藥難題。
[0004]2014年10月01，公布的一株產(chǎn)果聚糖蔗糖酶的菌株和用該酶生產(chǎn)低
聚乳果糖的方法中，公開了一種氯酹節(jié)桿菌(Arthrobacter chlorophenolicus)SK33.001，已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO:M 2013387。
[0005]用所述的微生物氯酚節(jié)桿菌SK33.001發(fā)酵生產(chǎn)果聚糖蔗糖酶的方法，步驟為:
(1)種子培養(yǎng)
種子培養(yǎng)基:牛肉膏I?10g/L，蛋白胨I?5g/L，NaCl I?5g/L，ρΗ7.0，去離子水配制；
種子培養(yǎng)條件:將氯酚節(jié)桿菌SK33.001接入種子培養(yǎng)基中，于25?30°C、160?240rpm的振蕩條件下培養(yǎng)12?24h ；
(2)發(fā)酵培養(yǎng)
發(fā)酵培養(yǎng)基:蔗糖5?50g/L，乳糖5~50g/L，控制蔗糖:乳糖質量比1: 1，酵母膏I?20g/L,蛋白胨I?10g/L,磷酸氫二鉀I?5g/L,硫酸鎂0.1?lg/L, pH 6.5?
7.5,去離子水配制；
發(fā)酵條件:種子液接種量為0.01%-1%，在25?30°C、攪拌速度為200?500rpm、空氣流量為5?30m3/(L*h)的條件下在發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵12?84h生產(chǎn)果聚糖蔗糖酶；
(3)發(fā)酵后處理通過離心法除去發(fā)酵液中的菌體，得到果聚糖蔗糖酶粗酶液，將果聚糖蔗糖酶粗酶液進一步超濾濃縮，用3倍濃縮液體積的工業(yè)酒精沉淀蛋白質，離心和冷凍干燥得到果聚糖蔗糖酶粗酶粉。其能夠將蔗糖、乳糖轉化為低聚乳果糖，且低聚乳果糖轉化率高達35%以上，但是其轉化率仍需要提高。
[0006](三)


【發(fā)明內(nèi)容】

本發(fā)明為了彌補現(xiàn)有技術的不足，提供了一種酶法生產(chǎn)乳果低聚糖，操作方便，過程易于控制，反應時間短，產(chǎn)物純度高，有利于工業(yè)化生產(chǎn)。
[0007]本發(fā)明是通過如下技術方案實現(xiàn)的:
一種酶法生產(chǎn)乳果低聚糖，其特殊之處在于:包括以下步驟:
(1)種子培養(yǎng)
種子培養(yǎng)基:牛肉膏7g/L，蛋白胨4g/L，NaCl 5g/L，pH7.0，去離子水配制；
種子培養(yǎng)條件:將氯酚節(jié)桿菌SK33.001接入種子培養(yǎng)基中，于30°C、160?240rpm,的振蕩條件下培養(yǎng)12h ；
(2)發(fā)酵培養(yǎng)
發(fā)酵培養(yǎng)基:蔗糖27g/L，乳糖27g/L，控制蔗糖:乳糖質量比1: 1，酵母膏15-17g/L，蛋白胨 2-4g/L，磷酸氫二鉀 5g/L，硫酸鎂 0.5-lg/L，氯化鈣 0.lg/L，Zn2+80mg/L , FeCl30.4g/L ,pH 6.5?7.5,去離子水配制；
發(fā)酵條件:種子液接種量為1%，在30°C、攪拌速度為450-500rpm、空氣流量為20m3/(L.h)的條件下在發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵0.8-2h生產(chǎn)果聚糖蔗糖酶；
(3)發(fā)酵后處理
通過離心法除去發(fā)酵液中的菌體，得到果聚糖蔗糖酶粗酶液；將果聚糖蔗糖酶粗酶液進一步超濾濃縮，用4倍濃縮液體積的工業(yè)酒精沉淀蛋白質，離心和冷凍干燥得到果聚糖蔗糖酶粗酶粉；
(4)果聚糖蔗糖酶轉化生產(chǎn)低聚乳果糖的酶反應液
向質量濃度分別為27%的蔗糖、乳糖溶液中添加果聚糖蔗糖酶及，50mg/L Zn2+催化轉化，轉化反應條件為:底物總糖質量濃度范圍為54%，酶對底物的用量為200U/g，pH 4.5?8.0，轉化反應溫度為50°C，轉化反應時間0.4-0.6h，得到含有低聚乳果糖的酶反應液；
(5)脫色
在低聚乳果糖的酶反應液中加入重量比12%，孔徑小于30nm的活性炭，在90°C下充分攪拌，震蕩吸附10-20min，然后離心、過濾得到脫色、澄清的脫色液；
(6)濃縮
將脫色液真空蒸發(fā)濃縮至固形物含量為96%，即得低聚乳果糖糖漿。
[0008]本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明用于生產(chǎn)乳果低聚糖操作簡單、作用條件溫和、易掌握，產(chǎn)物純度高，生產(chǎn)周期短，大大提高了酶法生產(chǎn)乳果低聚糖的產(chǎn)量，是發(fā)酵工藝中的重大的創(chuàng)新，值得推廣。
[0009](四)【具體實施方式】實施例1
(1)種子培養(yǎng)
種子培養(yǎng)基:牛肉膏7g/L，蛋白胨4g/L，NaCl 5g/L，pH7.0，去離子水配制；
種子培養(yǎng)條件:將氯酚節(jié)桿菌SK33.001接入種子培養(yǎng)基中，于30°C、160?240rpm,的振蕩條件下培養(yǎng)12h ；
(2)發(fā)酵培養(yǎng)
發(fā)酵培養(yǎng)基:蔗糖27g/L，乳糖27g/L，控制蔗糖:乳糖質量比1: 1，酵母膏15g/L，蛋白胨 2g/L，磷酸氫二鉀 5g/L，硫酸鎂0.5g/L，氯化鈣 0.lg/L，Zn2+80mg/L ,FeCl3 0.4g/L，pH 6.5?7.5,去離子水配制；
發(fā)酵條件:種子液接種量為1%，在30°C、攪拌速度為450-500rpm、空氣流量為20m3/(L.h)的條件下在發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵Ih生產(chǎn)果聚糖蔗糖酶；
(3)發(fā)酵后處理
通過離心法除去發(fā)酵液中的菌體，得到果聚糖蔗糖酶粗酶液；將果聚糖蔗糖酶粗酶液進一步超濾濃縮，用4倍濃縮液體積的工業(yè)酒精沉淀蛋白質，離心和冷凍干燥得到果聚糖蔗糖酶粗酶粉；
(4)果聚糖蔗糖酶轉化生產(chǎn)低聚乳果糖的酶反應液
向質量濃度分別為27%的蔗糖、乳糖溶液中添加果聚糖蔗糖酶及，50mg/L Zn2+催化轉化，轉化反應條件為:底物總糖質量濃度范圍為54%，酶對底物的用量為200U/g，pH 4.5?8.0，轉化反應溫度為50°C，轉化反應時間0.4-0.6h，得到含有低聚乳果糖的酶反應液；
(5)脫色
在低聚乳果糖的酶反應液中加入重量比12%，孔徑小于30nm的活性炭，在90°C下充分攪拌，震蕩吸附10-20min，然后離心、過濾得到脫色、澄清的脫色液；
(6)濃縮
將脫色液真空蒸發(fā)濃縮至固形物含量為96%，即得低聚乳果糖糖漿。
[0010]實施例2
(1)種子培養(yǎng)
種子培養(yǎng)基:牛肉膏7g/L，蛋白胨4g/L，NaCl 5g/L，pH7.0，去離子水配制；
種子培養(yǎng)條件:將氯酚節(jié)桿菌SK33.001接入種子培養(yǎng)基中，于30°C、160?240rpm,的振蕩條件下培養(yǎng)12h ；
(2)發(fā)酵培養(yǎng)
發(fā)酵培養(yǎng)基:蔗糖27g/L，乳糖27g/L，控制蔗糖:乳糖質量比1: 1，酵母膏17g/L，蛋白胨 4g/L，磷酸氫二鉀 5g/L，硫酸鎂 0.5-lg/L，氯化鈣 0.lg/L，Zn2+80mg/L ,FeCl3 0.4g/L,pH 6.5?7.5,去離子水配制；
發(fā)酵條件:種子液接種量為1%，在30°C、攪拌速度為450-500rpm、空氣流量為20m3/(L-h)的條件下在發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵2h生產(chǎn)果聚糖蔗糖酶；
(3)發(fā)酵后處理
通過離心法除去發(fā)酵液中的菌體，得到果聚糖蔗糖酶粗酶液；將果聚糖蔗糖酶粗酶液進一步超濾濃縮，用4倍濃縮液體積的工業(yè)酒精沉淀蛋白質，離心和冷凍干燥得到果聚糖蔗糖酶粗酶粉；
(4)果聚糖蔗糖酶轉化生產(chǎn)低聚乳果糖的酶反應液
向質量濃度分別為27%的蔗糖、乳糖溶液中添加果聚糖蔗糖酶及，50mg/L Zn2+催化轉化，轉化反應條件為:底物總糖質量濃度范圍為54%，酶對底物的用量為200U/g，pH 4.5?8.0，轉化反應溫度為50°C，轉化反應時間0.4-0.6h，得到含有低聚乳果糖的酶反應液；
(5)脫色
在低聚乳果糖的酶反應液中加入重量比12%，孔徑小于30nm的活性炭，在90°C下充分攪拌，震蕩吸附10-20min，然后離心、過濾得到脫色、澄清的脫色液； (6)濃縮
將脫色液真空蒸發(fā)濃縮至固形物含量為96%，即得低聚乳果糖糖漿。
[0011]實施例3
(1)種子培養(yǎng)
種子培養(yǎng)基:牛肉膏7g/L，蛋白胨4g/L，NaCl 5g/L，pH7.0，去離子水配制；
種子培養(yǎng)條件:將氯酚節(jié)桿菌SK33.001接入種子培養(yǎng)基中，于30°C、160?240rpm,的振蕩條件下培養(yǎng)12h ；
(2)發(fā)酵培養(yǎng)
發(fā)酵培養(yǎng)基:蔗糖27g/L，乳糖27g/L，控制蔗糖:乳糖質量比1: 1，酵母膏16g/L，蛋白胨 3g/L，磷酸氫二鉀 5g/L，硫酸鎂 0.5-lg/L，氯化鈣 0.lg/L, Zn2+80mg/L ,FeCl3 0.4g/L,pH 6.5?7.5,去離子水配制；
發(fā)酵條件:種子液接種量為1%，在30°C、攪拌速度為450-500rpm、空氣流量為20m3/(L.h)的條件下在發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵0.Sh生產(chǎn)果聚糖蔗糖酶；
(3)發(fā)酵后處理
通過離心法除去發(fā)酵液中的菌體，得到果聚糖蔗糖酶粗酶液；將果聚糖蔗糖酶粗酶液進一步超濾濃縮，用4倍濃縮液體積的工業(yè)酒精沉淀蛋白質，離心和冷凍干燥得到果聚糖蔗糖酶粗酶粉；
(4)果聚糖蔗糖酶轉化生產(chǎn)低聚乳果糖的酶反應液
向質量濃度分別為27%的蔗糖、乳糖溶液中添加果聚糖蔗糖酶及，50mg/L Zn2+催化轉化，轉化反應條件為:底物總糖質量濃度范圍為54%，酶對底物的用量為200U/g，pH 4.5?
8.0，轉化反應溫度為50°C，轉化反應時間0.6h，得到含有低聚乳果糖的酶反應液；
(5)脫色
在低聚乳果糖的酶反應液中加入重量比12%，孔徑小于30nm的活性炭，在90°C下充分攪拌，震蕩吸附10-20min，然后離心、過濾得到脫色、澄清的脫色液；
(6)濃縮
將脫色液真空蒸發(fā)濃縮至固形物含量為96%，即得低聚乳果糖糖漿。
【權利要求】
1.一種酶法生產(chǎn)乳果低聚糖，其特征在于:包括以下步驟: (1)種子培養(yǎng) 種子培養(yǎng)基:牛肉膏7g/L，蛋白胨4g/L，NaCl 5g/L，pH7.0，去離子水配制； 種子培養(yǎng)條件:將氯酚節(jié)桿菌SK33.001接入種子培養(yǎng)基中，于30°C、160?240rpm,的振蕩條件下培養(yǎng)12h ； (2)發(fā)酵培養(yǎng) 發(fā)酵培養(yǎng)基:蔗糖27g/L，乳糖27g/L，控制蔗糖:乳糖質量比1: 1，酵母膏15-17g/L，蛋白胨 2-4g/L，磷酸氫二鉀 5g/L，硫酸鎂 0.5-lg/L，氯化鈣 0.lg/L，Zn2+80mg/L , FeCl30.4g/L ,pH 6.5?7.5,去離子水配制； 發(fā)酵條件:種子液接種量為1%，在30°C、攪拌速度為450-500rpm、空氣流量為20m3/(L.h)的條件下在發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵0.8-2h生產(chǎn)果聚糖蔗糖酶； (3)發(fā)酵后處理 通過離心法除去發(fā)酵液中的菌體，得到果聚糖蔗糖酶粗酶液；將果聚糖蔗糖酶粗酶液進一步超濾濃縮，用4倍濃縮液體積的工業(yè)酒精沉淀蛋白質，離心和冷凍干燥得到果聚糖蔗糖酶粗酶粉； (4)果聚糖蔗糖酶轉化生產(chǎn)低聚乳果糖的酶反應液 向質量濃度分別為27%的蔗糖、乳糖溶液中添加果聚糖蔗糖酶及，50mg/L Zn2+催化轉化，轉化反應條件為:底物總糖質量濃度范圍為54%，酶對底物的用量為200U/g，pH 4.5?8.0，轉化反應溫度為50°C，轉化反應時間0.4-0.6h，得到含有低聚乳果糖的酶反應液； (5)脫色 在低聚乳果糖的酶反應液中加入重量比12%，孔徑小于30nm的活性炭，在90°C下充分攪拌，震蕩吸附10-20min，然后離心、過濾得到脫色、澄清的脫色液； (6)濃縮 將脫色液真空蒸發(fā)濃縮至固形物含量為96%，即得低聚乳果糖糖漿。
【文檔編號】C12R1/06GK104480164SQ201410726466
【公開日】2015年4月1日 申請日期:2014年12月4日 優(yōu)先權日:2014年12月4日
【發(fā)明者】竇寶德, 竇光朋, 張繼紅 申請人:山東百龍創(chuàng)園生物科技有限公司