水稻黃綠葉突變基因ygl6及其編碼的蛋白和應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了水稻黃綠葉突變基因YGL6及其編碼的蛋白和應用，水稻黃葉突變基因YGL6的核苷酸序列如SEQ ID No.14所示，氨基酸序列如SEQ ID No.15所示，與野生型相比水稻黃綠葉突變基因YGL6在第4個外顯子上第11堿基由T轉換為A，并導致第4位的編碼氨基酸由亮氨酸變異為TAG終止子，該基因突變后的水稻YGL6突變體在苗期葉片呈現(xiàn)黃綠色，分蘗后期至成熟期轉變?yōu)榈G色，通過雜交發(fā)現(xiàn)該性狀為隱性性狀，因此能夠利用此性狀選育新品種和種子純度鑒定，對水稻的遺傳育種具有重要意義。
【專利說明】水稻黃綠葉突變基因 YGL6及其編碼的蛋白和應用

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于遺傳學領域，具體涉及水稻黃綠葉突變基因 YGL6,還涉及該基因編碼 的蛋白和應用。

【背景技術】
[0002] 水稻（Orvza sativa L.)是世界上最重要的糧食作物。尤其雜交水稻的種植，顯 著提高了水稻的產量，從以前的每畝200-300斤，到現(xiàn)在的每畝800斤，與第二次綠色革命 一起差不多解決了全球的糧食危機，為保障國家乃至世界糧食安全做出了巨大貢獻。然而 種子純度是制約雜交稻發(fā)揮更大作用的重要制約因子。近年來因雜交水稻種子不純而給農 民造成的損失越來越嚴重。這一問題已引起政府、專家的高度重視。兩系法雜交水稻的種 子生產，近幾年均出現(xiàn)過重大損失。1999年湖南曾因遭遇低溫造成2萬畝制種大部分失敗， 損失超過千萬元。2002年長江流域8月份的低溫，又嚴重損害了兩系雜交稻種子生產。但 是鑒定雜種種子純度一直沒有理想的技術方法已成為我國種子產業(yè)發(fā)展的制約因素。利用 苗期標記性狀進行作物雜種一代新品種選育和種子純度鑒定，能在苗期通過觀察標記性狀 的存在或消失與否來識別真假雜種，從而達到能及早識別剔除雜種或非雜種株、實現(xiàn)親本 和雜交種種子純度雙重排雜、加強種子質量監(jiān)督、大大降低種子鑒定費用、保證田間品種純 度、增產節(jié)支等目的。該項技術直觀準確，簡便快速，具有一般的異地種植鑒定和DNA分子 標記鑒定技術無法比擬的優(yōu)越性。近年來在作物育種及種子純度鑒定上的研究應用也越來 越受到重視。前人已做了大量的工作，也取得了可喜的成績，成功選育了一些帶標記的不育 系，如紫葉標記不育系紫S、白化轉綠型葉色標記不育系玉兔S和NHR111SA。但由于多數苗 期標記性狀單系本身性狀不優(yōu)良、常導致其它重要農藝性狀顯著降低，利用時都需要進行 一個雜交轉育過程以克服不良性狀的遺傳累贅，實現(xiàn)優(yōu)異性狀的聚合，這個過程往往非常 困難，都要通過大量長期的轉育才能實現(xiàn)。因而，發(fā)現(xiàn)一些穩(wěn)定遺傳、葉色變異對其它性狀 尤其產量、品質性狀沒有顯著影響的葉色突變非常重要。


【發(fā)明內容】

[0003] 有鑒于此，本發(fā)明的目的之一在于提供水稻黃綠葉突變基因 YGL6,該基因為苗期 標記性狀，并且對其他主要農藝性狀無顯著影響，為水稻轉基因研究提供有力的工具，促進 雜交稻育種研究；本發(fā)明的目的之二在于提供水稻黃綠葉突變基因 YGL6編碼的蛋白質；本 發(fā)明的目的之三在于提供水稻黃綠葉突變基因 YGL6的應用。
[0004] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明利用甲基磺酸乙酯（EMS)誘變自育優(yōu)良恢復系縉恢10號 獲得一個遺傳穩(wěn)定的水稻"斑馬葉"突變體，在遺傳分析和基因定位的基礎上，先通過基因 預測、同源搜索及基因序列差異比較，初步確定了水稻黃綠葉突變性狀為YGL6隱性基因控 制，YGL6為3-β類固醇脫氫酶/異構酶（L0C_0sl2g23180)。隨后，本發(fā)明以水稻黃綠葉突 變體y g16為材料，克隆了水稻黃綠葉突變基因 YGL6,具有如SEQ ID No. 14所示的核苷酸序 列，開放閱讀框為330bp，編碼109個氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID No. 15所示。與野生 型縉恢10號相比，突變基因 YGL6在第4個外顯子上第11堿基有T-A的轉換，并導致第4 位的編碼氨基酸序列發(fā)生亮氨酸（Leucine)到TAG終止子的轉變，使突變蛋白僅有109個 氨基酸，并且L0C_0sl2g23180蛋白與41-kDa的葉綠體莖環(huán)結合蛋白相近。
[0005] 然后，然后構建RNAi載體并轉化中花11，經鑒定轉基因陽性植株葉片變?yōu)辄S綠。 進一步確定水稻黃綠葉性狀由YGL6基因突變引起，因此水稻黃綠葉突變基因 YGL6能夠用 于在水稻黃綠葉性狀的分子育種。
[0006] 本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明提供了水稻黃綠葉突變基因 YGL6,該基因為苗期 標記性狀，對其他主要農藝性狀無顯著影響，為水稻遺傳育種研究提供了有力的工具，為選 育純種不育系奠定基礎。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0007] 為了使本發(fā)明的目的、技術方案和有益效果更加清楚，本發(fā)明提供如下附圖：
[0008] 圖1為水稻黃綠葉突變體ygl6和野生型縉恢10號形態(tài)學觀察結果（A :野生型縉 恢10號形態(tài)；B :水稻黃綠葉突變體ygl6形態(tài)；C :苗期野生型縉恢10號與水稻黃綠葉突變 體ygl6形態(tài)；D :分蘗后期野生型縉恢10號與水稻黃綠葉突變體ygl6形態(tài)）。
[0009] 圖2為水稻黃綠葉突變基因 YGL6基因的遺傳和物理圖譜（A為YGL6的初定位 區(qū)間在第12染色體長臂SSR標記RM1337和RM1261間；B為將YGL6基因精細定位在標記 Ind23與Ind37間143kb的范圍內；C為所在區(qū)域BAC克隆；D為突變體yfl6的候選基因 0sl2g23180的結構及突變位置）。
[0010] 圖3為水稻黃綠葉突變基因 YGL6在野生型縉恢10號和突變體ygl6中的表達（WT 為縉恢10號）。
[0011] 圖4為YGL6突變體RNAi表型分析及定量real-time PCR分析和色素分析，其中 A為中花11 (ZHll)和YGL6的3株RNAi轉基因陽性植株表型；B為YGL6在中花11和3株 RNAi轉基因陽性植株中的real-time PCR定量PCR分析；C為3株RNAi轉基因陽性植株和 野生型的色素分析，Chla為葉綠素 a, Chlb為葉綠素 b，Car為胡蘿卜素。

【具體實施方式】
[0012] 下面將結合附圖，對本發(fā)明的優(yōu)選實施例進行詳細的描述。實施例中未注明具體 條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如分子克隆實驗指南（第三版，J.薩姆布魯克等 著）中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0013] 本發(fā)明實施例中使用的材料：野生型水稻材料縉恢10號（WT)和水稻黃綠葉突 變體ygl6,均由本實驗室培育；M-MLV逆轉錄酶、高保真DNA聚合酶PFU、Taq DNA聚合 酶、T4DNA連接酶、限制性內切酶、pMD19-T載體、Trizol試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、質 粒提取試劑盒、λ-Hind III DNA Marker 及 DL5000DNA Marker 購自 TaKaRa 公司；DNA Marker III購自天根生化科技（北京）有限公司；氨節(jié)青霉素（Ampicillin，Amp)和卡拉 霉素（Kanamycin，Kan)為Sigma公司產品；引物合成和DNA測序由上海英俊生物技術有 限公司完成；其它化學試劑購自北京鼎國生物技術有限責任公司；大腸桿菌DH5 α、農桿菌 LBA4404由本實驗室保存。
[0014] 實施例1、水稻黃綠葉突變體ygl6的獲得和形態(tài)學觀察
[0015] 利用甲基磺酸乙酯（EMS)誘變自育優(yōu)良恢復縉恢10號獲得一個遺傳穩(wěn)定的水稻 黃綠葉突變體，命名為ygl6。水稻黃綠葉突變體ygl6,在苗期葉片呈現(xiàn)黃綠色，分蘗后期至 成熟期轉變?yōu)榈G色（圖1)。該性狀經過多代觀察，表現(xiàn)穩(wěn)定遺傳，并且其他主要農藝性狀 如穗長和每穗粒數沒有顯著差異，株高、有效穗、千粒重顯著減少。
[0016] 實施例2、突變ygl6基因遺傳分析與定位
[0017] 以ygl6突變體為父本，秈稻品種西農IA(XinonglA)為母本雜交獲得Fl代植株葉 片全部表現(xiàn)為正常綠色，然后通過自交獲得8149株F 2代群體中，依據黃綠葉性狀分離出了 突變葉片和正常葉片兩種表型，分離出1997株突變單株，其余為正常株，可以看出正常株 與突變株符合3 :1的分離比例，表明該突變性狀由一對隱性單基因控制。
[0018] 初步定位：選取均勻分布于水稻12條染色體上的480對SSR引物，在親本ygl6和 西農IA間檢測多態(tài)性，其中有98對SSR引物顯示多態(tài)性。用這98對引物在正常和突變基 因池中進行基因連鎖分析，篩選與基因 Zebra-15連鎖的SSR標記，發(fā)現(xiàn)YGL6與第12染色 體短臂上標記RM1337和RM1261連鎖。用連鎖標記RM1337和RM1261，同時設計了 1個具有 親本多態(tài)性的In/Del標記Ind24分析156株隱性突變單株。結果顯示，基因 YGL6與標記 RM1337和Ind24之間，遺傳均為0. 32cM(圖2中A)。
[0019] 精細定位：根據已公布的秈稻品種93-11序列，在標記RM1337和Ind24間進一步 篩選和開發(fā)了 40對In/Del引物，其中Indl3, Ind23, Ind37和Ind39在兩親本間表現(xiàn)出 多態(tài)性（表1)。用這4對引物分析所有1997株突變單株，結果表明：標記Indl3, Ind23， Ind37和Ind39與基因 YGL6之間的交換株分別為2、1、1和3個（圖2中B)。最終YGL6被 定位在標記Ind23和Ind37之間，物理距離為143kb的范圍內，此區(qū)間包括兩個BAC克隆： OSJNBaOOMB2O 和 OSJNBaOO37L2O (圖 2 中 C)。
[0020] 表1、5對具有多態(tài)性的SSR標記序列
[0021]

【權利要求】
1. 水稻黃綠葉突變基因YGL6,其特征在于：核苷酸序列如SEQ ID No. 14所示。
2. 權利要求1所述水稻黃綠葉突變基因YGL6編碼的蛋白質，其特征在于：氨基酸序列 如 SEQ ID No. 15 所示。
3. 權利要求2所述水稻黃綠葉突變基因YGL6在水稻黃綠葉性狀的分子育種中的應用。
4. 根據權利要求3所述的應用，其特征在于：所述水稻品種為縉恢10號。
【文檔編號】C12N9/04GK104404061SQ201410728239
【公開日】2015年3月11日 申請日期:2014年12月3日 優(yōu)先權日:2014年12月3日
【發(fā)明者】施軍瓊, 趙芳明, 何光華, 桑賢春, 凌英華, 王楠, 楊正林 申請人:西南大學