獲取無菌微囊藻純種的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種獲取無菌微囊藻的方法。在微囊藻的純化過程中，依次采用超聲波打散藻與細(xì)菌細(xì)胞之間的粘附、利用流式細(xì)胞儀分選技術(shù)分選微囊藻、通過分部收集或者劃線純化的方法獲得無菌的微囊藻。
【專利說明】獲取無菌微囊藻純種的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及微生物的分離純化過程，特別是涉及原核微囊藻培養(yǎng)中去除污染細(xì)菌的方法，有效解決了難以獲得微囊藻無菌培養(yǎng)液的現(xiàn)狀，為微囊藻的分子生物學(xué)、生理學(xué)等特性研宄提供了材料。

【背景技術(shù)】
[0002]微囊藻是形成藍(lán)藻水華的優(yōu)勢藻種，其形成的水華具有發(fā)生廣泛，面積大，產(chǎn)生毒素的特點(diǎn)。水華微囊藻嚴(yán)重影響水體水質(zhì)，引起了越來越多科學(xué)家的關(guān)注。
[0003]微囊藻的胞外產(chǎn)物富含多糖、蛋白質(zhì)等有機(jī)物質(zhì)，因而是細(xì)菌聚集的熱點(diǎn)生態(tài)位。無論是在野外還是在室內(nèi)培養(yǎng)過程中，微囊藻都不可避免的帶有大量污染的細(xì)菌，為微囊藻的生理、分子生物學(xué)等研宄帶來了阻礙。因而去除微囊藻培養(yǎng)中的細(xì)菌室研宄深入微囊藻生物學(xué)特性的重要步驟。
[0004]目前去除微囊藻中細(xì)菌的方法有紫外照射、使用抗生素等方法。然而，微囊藻和細(xì)菌同屬于原核生物，這些方法的使用容易引起微囊藻細(xì)胞的損傷，甚至發(fā)生變異，而且殘留的細(xì)菌可能產(chǎn)生抗性，為后續(xù)微囊藻的研宄產(chǎn)生了較大的影響。在分離培養(yǎng)無菌微囊藻的過程中，也有直接采用劃線方法進(jìn)行，但是由于微囊藻細(xì)胞的膠鞘中含有多糖類物質(zhì)，容易粘附細(xì)菌，需要經(jīng)過很多次的劃線才能挑選出無菌微囊藻，這種方法非常緩慢，而且工作量很大，也不能高效快速的得到無菌的微囊藻。
[0005]因此，需要更加安全有效的方法去除微藻中的細(xì)菌。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明公開了一種去除微囊藻培養(yǎng)中附著細(xì)菌或者污染細(xì)菌的方法。該方法根據(jù)藻與細(xì)菌所具有不同的細(xì)胞特性，通過流式細(xì)胞儀分選技術(shù)，可以快速有效的減少并去除微囊藻培養(yǎng)中的細(xì)菌，獲得無菌微囊藻，從而用于微囊藻分子、生理等特點(diǎn)的研宄。
[0007]本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下:
微囊藻培養(yǎng)液中細(xì)菌去除的方法，其特征在于首先打散微囊藻與細(xì)菌之間的粘附，其次通過流式細(xì)胞儀分選技術(shù)，以及分部收集，可以獲得微囊藻的無菌培養(yǎng)。
[0008]本發(fā)明所述的方法，其特征在于，采用如下步驟進(jìn)行微囊藻的純化:
(1)調(diào)節(jié)微囊藻培養(yǎng)液濃度
(2)超聲處理培養(yǎng)液
(3)采用流式細(xì)胞儀對微囊藻進(jìn)行多次分選，初步獲得微囊藻的純培養(yǎng)。
[0009](4)進(jìn)一步采用分部收集或者劃線法純化，從而獲得無菌微囊藻。
[0010]本發(fā)明所述的方法，，其特征在于，步驟(I)所述細(xì)胞濃度為14-1O5個/ml。
[0011]本發(fā)明所述的方法，，其特征在于，步驟(2)所述的超聲處理?xiàng)l件為:超聲波頻率20-45 kHz,功率為30W，工作3s-5s，共三次
本發(fā)明所述的方法，，其特征在于，步驟(3)在流式細(xì)胞儀中進(jìn)行。
[0012]本發(fā)明所述的方法，其特征在于，具體包括以下步驟:
①低功率超聲波打散:破壞微囊藻與污染細(xì)菌之間的粘附，采用低功率30 W的超聲波方法，達(dá)到不破壞藻細(xì)胞，但是將聚集的細(xì)胞分散開。工作3 S，間歇3s，打散，鏡檢。
[0013]②流式細(xì)胞儀的滅菌處理:首先用70%乙醇沖洗除去流式細(xì)胞儀管道中的細(xì)菌，然后采用PBS沖洗半小時，并作為分選鞘液。其次，開紫外照射工作臺，已達(dá)到無菌工作狀
--τ O
[0014]③流式分選:通過側(cè)向散射光(SSC，依據(jù)BD公司2.49um的nile小球，圈定約3um的區(qū)域)，并通過熒光3通道(FL3，激發(fā)波長為488nm，功率為80mW，微囊藻自帶的葉綠素a紅色熒光信號)，將待處理的微囊藻培養(yǎng)液以低速率200-300個細(xì)胞/秒進(jìn)樣。根據(jù)所圈定的范圍，收集微囊藻細(xì)胞，采用無菌BGll培養(yǎng)基進(jìn)行收集，作為初次分選微囊藻。
[0015]④將第一次分選液作為待分選的培養(yǎng)液，按照同樣的設(shè)置進(jìn)行，收集為二次分選液，以此類推，一般獲得三次分選培養(yǎng)液，可將絕大部分細(xì)菌去除。
[0016]⑤將第三次分選液通過分部收集或者在BGll固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，可以獲得無菌微囊藻。其中分部收集可立即獲得微量的無菌微囊藻；劃線培養(yǎng)一般需要一個月的時間能獲得微囊藻無菌藻落，然后再轉(zhuǎn)接無菌BGll液體培養(yǎng)基培養(yǎng)。
[0017]本發(fā)明所帶來的有益效果為:
可以高效快速的得到無菌微囊藻，并且不會對藻細(xì)胞造成不可恢復(fù)的傷害。對于需要微量的無菌微囊藻進(jìn)行分子生物學(xué)的研宄，使用本發(fā)明，只需要一天就能獲得。
[0018]【專利附圖】

【附圖說明】:
圖1微囊藻培養(yǎng)中的顯微鏡檢照片；
圖2經(jīng)過流式細(xì)胞儀初次分選后的微囊藻的顯微圖片；
圖3經(jīng)過流式細(xì)胞儀三次分選后的微囊藻的顯微圖片；
圖4流式細(xì)胞儀分選門的設(shè)定。

【具體實(shí)施方式】
[0019]下面結(jié)合具體實(shí)例對本發(fā)明所述工藝以及材料進(jìn)行詳細(xì)說明。
[0020]具體操作步驟如下:
①首先經(jīng)過低功率超聲波打散的方法，將粘附于微囊藻細(xì)胞的細(xì)菌與微囊藻細(xì)胞分離開。所選用的超聲波頻率20-45 kHz,功率為為30 W，工作3s_5s，共三次。通過DAPI染色，顯微鏡鏡檢檢測，以不破壞藻細(xì)胞，但是使粘附的細(xì)胞分散開為目標(biāo)。
[0021]②其次，稀釋微囊藻培養(yǎng)液，濃度約為104-105cells/ml。
[0022]③預(yù)先采用75%的乙醇沖洗流式細(xì)胞儀的管道，然后采用PBS沖洗半小時，并作為分選鞘液。打開紫外照射流式細(xì)胞儀的工作臺，達(dá)到無菌狀態(tài)。并準(zhǔn)備好接收所分選微囊藻的無菌BGll培養(yǎng)基。
[0023]④設(shè)置分選條件:根據(jù)微囊藻具有葉綠素a自發(fā)熒光而細(xì)菌沒有，選擇熒光3通道(FL3，激發(fā)波長為488nm，功率為80mW)葉綠素a熒光；根據(jù)微囊藻細(xì)胞大小一般在
2.5um以上，而細(xì)菌大小一般小于lum，設(shè)定側(cè)向散射光(SSC，依據(jù)BD公司2.49um的nile小球，圈定約3um的區(qū)域，將待處理的微囊藻培養(yǎng)液以低速率200-300個細(xì)胞/秒進(jìn)樣。根據(jù)所圈定的范圍(圖4，Pl )，收集微囊藻細(xì)胞，作為初次分選微囊藻。
[0024]⑤將初次分選微囊藻再進(jìn)樣到流式細(xì)胞儀，采用相同的條件進(jìn)行分選，收集微囊藻細(xì)胞，作為二次分選微囊藻，以此類推。在此過程中，微囊藻中的細(xì)菌會大幅減少，一般經(jīng)過第三次分選可以獲得無菌微囊藻。此外，在本步驟中，可以將第三次分選微囊藻收集在不同的試管中，即分部收集，或者采用一次劃線培養(yǎng)的方法，即可以獲得無菌的微囊藻藻落。
[0025]由圖可知，通過三次分選，原本含有細(xì)菌的微囊藻不斷純化，最終獲得了無菌微囊藻純種。
【權(quán)利要求】
1.獲取無菌微囊藻純種的方法，其特征在于，首先打散微囊藻與細(xì)菌之間的粘附，其次通過流式細(xì)胞儀分選技術(shù)，以及分部收集，可以獲得微囊藻的無菌培養(yǎng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，采用如下步驟進(jìn)行藍(lán)藻的純化: (1)調(diào)節(jié)微囊藻培養(yǎng)液濃度 (2)超聲處理培養(yǎng)液 (3)采用流式細(xì)胞儀對微囊藻進(jìn)行2次以上分選，初步獲得微囊藻的純培養(yǎng) (4)進(jìn)一步采用分部收集或者劃線法純化，從而獲得無菌微囊藻。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，步驟(I)所述細(xì)胞濃度為104-105個/ml。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，步驟(2)所述的超聲處理?xiàng)l件為:超聲波頻率20-45 kHz，功率為30 W，工作3s_5s，共三次。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，步驟(3)在流式細(xì)胞儀中進(jìn)行。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，具體包括以下步驟: ①低功率超聲波打散:破壞微囊藻與污染細(xì)菌之間的粘附，采用低功率30W的超聲波方法，達(dá)到不破壞藻細(xì)胞，但是將聚集的細(xì)胞分散開； 工作3 S，間歇3s，打散，鏡檢； ②流式細(xì)胞儀的滅菌處理:首先用70%乙醇沖洗除去流式細(xì)胞儀管道中的細(xì)菌，然后采用PBS沖洗半小時，并作為分選鞘液； 其次，開紫外照射工作臺，以達(dá)到無菌工作狀態(tài)； ③流式分選:通過側(cè)向散射光(SSC，依據(jù)BD公司2.49um的nile小球，圈定約3um的區(qū)域)，并通過熒光3通道(FL3，激發(fā)波長為488nm，葉綠素a熒光)，將待處理的微囊藻培養(yǎng)液以低速率200-300個細(xì)胞/秒進(jìn)樣； 根據(jù)所圈定的范圍，收集微囊藻細(xì)胞，采用無菌BGll培養(yǎng)基進(jìn)行收集，作為初次分選微囊藻； ④將第一次分選液作為待分選的培養(yǎng)液，按照同樣的設(shè)置進(jìn)行，收集為二次分選液，以此類推，一般獲得三次分選培養(yǎng)液，可將絕大部分細(xì)菌去除； ⑤將第三次分選液通過分部收集或者在BGll固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，可以獲得無菌微囊藻； 其中分部收集可立即獲得微量的無菌微囊藻；劃線培養(yǎng)一般需要一個月的時間能獲得微囊藻無菌藻落，然后再轉(zhuǎn)接無菌BGll液體培養(yǎng)基培養(yǎng)。
【文檔編號】C12R1/01GK104498397SQ201410730999
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2014年12月5日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月5日
【發(fā)明者】施麗梅, 黃亞新, 孔繁翔, 龔伊, 盧亞萍 申請人:中國科學(xué)院南京地理與湖泊研究所