一種hbv dna數(shù)字pcr定量檢測(cè)試劑盒及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于病毒體外檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體為一種HBVDNA數(shù)字PCR定量檢測(cè)試劑盒及其應(yīng)用。本發(fā)明提供檢測(cè)試劑盒，包括PCR反應(yīng)引物：SEQIDNO.1、SEQIDNO.3與探針SEQIDNo.2；SEQIDNo.4、SEQIDNo.6與探SEQIDNo.5；SEQIDNo.7、SEQIDNo.9與探針SEQIDNo.8；作為內(nèi)參反應(yīng)引物：SEQIDNo.10、SEQIDNo.12與探針SEQIDNo.11，以及競(jìng)爭(zhēng)性探針：SEQIDNo.13～SEQIDNo.16。使用時(shí)提取人血漿樣本DNA，采用復(fù)合熒光多重PCR技術(shù)在數(shù)字PCR芯片微孔中對(duì)靶DNA進(jìn)行擴(kuò)增；顯示藍(lán)色熒光的微孔數(shù)即為總反應(yīng)體系中HBVDNA定量結(jié)果。本發(fā)明用于HBV定量檢測(cè)，快速、簡(jiǎn)便、靈敏度高、特異性強(qiáng)，適于大規(guī)模推廣應(yīng)用。
【專利說(shuō)明】-種HBV DNA數(shù)字PCR定量檢測(cè)試劑盒及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于病毒體外檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種JffiV DNA數(shù)字PCR定量檢測(cè)試 劑盒及其應(yīng)用。 技術(shù)背景
[0002] 慢性乙型肝炎（Chronic Hepatitis B, CHB)是由于乙型肝炎病毒（Hepatitis B Virus, HBV)在人肝細(xì)胞中慢性感染所致的一種肝臟炎癥疾病，其持續(xù)進(jìn)展可導(dǎo)致肝硬化、 肝功能衰竭及肝癌。據(jù)估計(jì)，全世界目前有HBV攜帶者約3. 5億人，每年約有100萬(wàn)人死于 HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化或肝癌。2012年，由中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病分會(huì)和中國(guó)醫(yī)學(xué)會(huì)感 染病學(xué)分會(huì)聯(lián)合制訂的《慢性乙型肝炎防治指南》指出，目前我國(guó)現(xiàn)有的慢性HBV感染者約 9300萬(wàn)，其中CHB患者超過(guò)2000萬(wàn)。
[0003] 對(duì)于CHB，無(wú)論是中國(guó)版的還是歐洲肝病協(xié)會(huì)制訂的《慢性乙型肝炎防治指南》均 指出，抗病毒治療是最重要的治療措施。在CHB的抗病毒治療中，核苷(酸）類似物(包括拉 米夫定、阿德福韋酯、替比夫定、恩替卡韋、替諾夫韋酯等）以其口服方便、抗病毒療效確切 成為CHB患者中應(yīng)用最為廣泛的一類藥物，其中恩替卡韋及替諾福韋酯為國(guó)內(nèi)外指南推薦 的一線用藥。
[0004] 無(wú)論是采用核苷(酸）類似物還是干擾素等進(jìn)行抗HBV治療，其抗病毒療效監(jiān)測(cè)均 需要對(duì)CHB患者外周血中的病毒載量進(jìn)行檢測(cè)，即HBV DNA定量檢測(cè)。在國(guó)內(nèi)外相關(guān)的治療 指南中均指出，無(wú)論是采用何種抗HBV治療方案，均需要采用HBV DNA定量檢測(cè)的方法對(duì)抗 HBV療效進(jìn)行評(píng)估，理想狀態(tài)下，需將CHB患者外周血中的HBV DNA控制在現(xiàn)有檢測(cè)手段檢 測(cè)不到的水平。當(dāng)前，國(guó)內(nèi)外進(jìn)行HBV DNA定量檢測(cè)采用的方法均為實(shí)時(shí)熒光PCR方法。國(guó) 際公認(rèn)的HBV DNA定量檢測(cè)方法是羅氏公司生產(chǎn)的、在國(guó)際上具有參比價(jià)值的Roche COBAS TaqMan HBV Test檢測(cè)試劑盒。依據(jù)這一定量方法，美國(guó)肝病協(xié)會(huì)指出，在抗HBV治療中， HBV DNA定量水平應(yīng)盡可能小于或等于10 IU/ml，歐洲肝病研究協(xié)會(huì)則指出，將HBV DNA定 量水平控制在10-15 IU/ml可有效防止疾病復(fù)發(fā)。在我國(guó)CFDA于2013年5月發(fā)布的《乙 型肝炎病毒脫氧核糖核酸定量檢測(cè)試劑注冊(cè)技術(shù)審查指導(dǎo)原則》中則建議HBV DNA定量檢 測(cè)試劑的最低檢出限應(yīng)小于或等于30 IU/ml。
[0005] 然而，我國(guó)CFDA早期批準(zhǔn)的HBV DNA定量檢測(cè)試劑，其靈敏度均在500 IU/ml以 上，難以達(dá)到慢性乙型肝炎臨床診療和我國(guó)法規(guī)的最新要求。2009年有學(xué)者以Roche試劑 盒為參照，對(duì)我國(guó)已批準(zhǔn)上市的幾種HBV DNA定量檢測(cè)試劑進(jìn)行了評(píng)估，結(jié)果表明，5種試 劑盒在IXlO4 -IX IO8 IU/ml范圍內(nèi)，各種試劑盒的符合率較高。2013年中國(guó)食品藥品 檢定研究院的學(xué)者以Roche HBV DNA定量檢測(cè)試劑為參照，對(duì)一檢測(cè)靈敏度為500 IU/ml 的國(guó)產(chǎn)HBV DNA定量檢測(cè)試劑的質(zhì)量進(jìn)行了評(píng)估，在193份HBsAg陽(yáng)性的樣本中，Roche試 劑盒檢出HBV DNA的樣本占到了 95%，而國(guó)產(chǎn)試劑則僅為70% ;而在122份HBsAg陰性的樣 本中，Roche試劑檢出約31%的樣本HBV DNA呈陽(yáng)性，其中包括6份"兩對(duì)半"結(jié)果均呈陰性 的樣本，而國(guó)產(chǎn)試劑在這122份樣本中未檢出1例呈HBV DNA呈陽(yáng)性。這樣的結(jié)果顯示國(guó) 產(chǎn)試劑盒質(zhì)量有待進(jìn)一步提高，最為重要的是要提高國(guó)產(chǎn)試劑盒對(duì)HBV DNA的檢測(cè)靈敏度。
[0006] 研究表明，HBV雖然是一種DNA病毒，但由于HBV DNA聚合酶本身無(wú)3'到5'端校 正功能，HBV DNA在復(fù)制過(guò)程中的自發(fā)突變率較高。依據(jù)HBV DNA序列的相似性，HBV至少 可分為A、B、C、E、F、G、H等7種基因型。中國(guó)慢性乙型肝炎患者中，則以C型和B型為主。 在傳統(tǒng)的HBV DNA實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)試劑中，雖然在進(jìn)行引物設(shè)計(jì)時(shí)，會(huì)考慮到不同基因型 HBV間的保守性，但考慮到HBV自身高自發(fā)突變率，一套引物與探針對(duì)不同的基因型的覆蓋 率是有限的，除檢測(cè)試劑自身的靈敏度外，這可能也是國(guó)產(chǎn)HBV DNA實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)試劑 漏檢率高的重要原因之一。要提高對(duì)不同基因型HBV的覆蓋，一個(gè)可行的方案是通過(guò)多重 PCR進(jìn)行檢測(cè)，即在HBV DNA多個(gè)保守區(qū)域同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)。由此而帶來(lái)的另一個(gè)問(wèn)題是，熒 光信號(hào)強(qiáng)度與HBV DNA的量間的關(guān)系將不可避免地出現(xiàn)異化。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的就是針對(duì)上述對(duì)HBV DNA檢測(cè)靈敏度的更高需求(包括現(xiàn)實(shí)需求和 法規(guī)要求)，提供一種檢測(cè)快速、簡(jiǎn)便，特異性強(qiáng)、靈敏度高的HBV DNA數(shù)字PCR定量檢測(cè)試 劑盒及其應(yīng)用。
[0008] 根據(jù)HBV DNA數(shù)字PCR定量檢測(cè)要求，本發(fā)明首先設(shè)計(jì)HBV DNA特異性引物、檢測(cè) 探針和競(jìng)爭(zhēng)性探針，具體如下：

【權(quán)利要求】
1. 一種HBV DNA數(shù)字PCR定量檢測(cè)試劑盒，其特征在于，其特征在于包括：第一引物容 器、第二引物容器、第三引物容器、第四引物容器；這些容器中具有探針組合物中對(duì)應(yīng)的引 物對(duì)和探針： 第一引物容器內(nèi)具有第一 PCR引物對(duì)SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 3所示的核苷酸序 列，以及相應(yīng)的檢測(cè)探針SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列； 第二引物容器內(nèi)具有第二PCR引物對(duì)SEQ ID No. 4和SEQ ID No. 6所示的核苷酸序 列，以及相應(yīng)的檢測(cè)探針SEQ ID No. 5所示的核苷酸序列； 第三引物容器內(nèi)具有第三PCR引物對(duì)SEQ ID No. 7)和SEQ ID No. 9所示的核苷酸 序列，以及相應(yīng)的檢測(cè)探針SEQ ID No. 8所示的核苷酸序列； 第四引物容器內(nèi)具有第四PCR引物對(duì)SEQ ID No. 10和SEQ ID No. 12所示的核苷酸 序列，以及相應(yīng)的檢測(cè)探針SEQ ID No. 11所示的核苷酸序列； 其中，SEQ ID No. 2、SEQ ID No. 5、SEQ ID No. 8 熒光素標(biāo)記為 FAM，SEQ ID No. 11 突光素標(biāo)記為VIC。
2. 如權(quán)利要求1所述試劑盒在HBV DNA數(shù)字PCR定量檢測(cè)中的應(yīng)用，其特征在于具體 步驟為： (1) 提取人血漿樣本中的DNA，包括HBV DNA與游離的人基因組DNA ; (2) 采用試劑盒中的引物與探針，通過(guò)復(fù)合熒光多重PCR引物在數(shù)字PCR檢測(cè)芯片微孔 中對(duì)靶DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增； (3) 檢測(cè)芯片微孔熒光情況：在檢出綠色熒光微孔的情況下，計(jì)數(shù)藍(lán)色熒光微孔數(shù)即為 總反應(yīng)體系中HBV DNA定量結(jié)果。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于當(dāng)藍(lán)色熒光檢測(cè)微孔數(shù)大于10000時(shí)，將上 樣模板稀釋1〇〇倍后重新進(jìn)行檢測(cè)。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為： 2X PCR反應(yīng)緩沖液，包括了 Taq酶、dNTP、鎂離子 7. 25微升 10X HBV DNA檢測(cè)用引物、探針組合 1. 45微升 去離子水 0. 80微升 模板DNA 5. 00微升 總反應(yīng)體積 14. 50微升 PCR反應(yīng)條件為： 96度變性10分鐘，然后60度2分鐘、98度變性30秒，共39個(gè)循環(huán)，之后60度保溫2 分鐘，反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行FAM和VIC熒光信號(hào)檢測(cè)。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述多重PCR反應(yīng)體系中，各引物探針的優(yōu) 選反應(yīng)濃度依次為： SEQ ID No. 1 300nmol/L SEQ ID No. 2 lOOnmol/L SEQ ID No. 3 300nmol/L SEQ ID No. 4 300nmol/L SEQ ID No. 5 lOOnmol/L SEQ ID No. 6 300nmol/L SEQ ID No. 7 300nmol/L SEQ ID No. 8 lOOnmol/L SEQ ID No. 9 300nmol/L SEQ ID No. 10 350nmol/L SEQ ID No. 11 lOOnmol/L SEQ ID No. 12 350nmol/L SEQ ID No. 13 80nmol/L SEQ ID No. 14 80nmol/L SEQ ID No. 15 80nmol/L SEQ ID No. 16 80nmol/L 。
【文檔編號(hào)】C12Q1/70GK104450963SQ201410733794
【公開(kāi)日】2015年3月25日 申請(qǐng)日期:2014年12月8日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月8日
【發(fā)明者】趙書(shū)民, 趙翊均, 周巍 申請(qǐng)人:上海五色石醫(yī)學(xué)研究有限公司