氫離子轉(zhuǎn)運(yùn)無(wú)機(jī)焦磷酸酶基因表達(dá)差異在番茄耐鹽性上的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種氫離子轉(zhuǎn)運(yùn)無(wú)機(jī)焦磷酸酶基因表達(dá)差異在番茄耐鹽性上的應(yīng)用，它是以5-6葉番茄苗為材料，取番茄植株第一片成熟葉。離體葉片用蒸餾水沖洗3次，去離子水沖洗1次，葉片用剪刀剪成長(zhǎng)方形，然后用去離子水沖洗3次，吸水紙吸干水分。選擇化學(xué)純的5%NaCl，處理時(shí)間為6min。本發(fā)明提取鹽脅迫后2min的離體葉片RNA，通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR，耐鹽性強(qiáng)的番茄基因型H+-PPase基因表達(dá)量增強(qiáng)，耐鹽性弱的表達(dá)量變化很小。通過(guò)H+-PPase基因表達(dá)差異，比較番茄耐鹽大小。本方法在基因水平上揭示番茄耐鹽潛力，對(duì)于培育抗逆性提高的番茄及其他植物新品種具有重要的理論和實(shí)際意義。
【專利說(shuō)明】氫離子轉(zhuǎn)運(yùn)無(wú)機(jī)焦磷酸酶基因表達(dá)差異在番茄耐鹽性上的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及氫離子轉(zhuǎn)運(yùn)無(wú)機(jī)焦磷酸酶(H+-PPase)基
因表達(dá)差異在番茄耐鹽性上的應(yīng)用。更具體地說(shuō)是一種利用H+-PPase基因表達(dá)差異檢測(cè)番茄耐鹽性的檢測(cè)方法。

【背景技術(shù)】
[0002]隨著人類社會(huì)的發(fā)展，人們對(duì)土地不斷開發(fā)利用，致使土壤次生鹽潰化程度日益加重。作為主要的蔬菜作物之一，番茄的耐鹽性研究引起人們高度重視，相關(guān)研究已逐漸展開和深化。但因涉及到的參數(shù)和指標(biāo)包括形態(tài)、生物量和生理生化等多個(gè)方面，加上鑒定時(shí)期也各不相同，故目前尚未形成統(tǒng)一的方法和標(biāo)準(zhǔn)用于番茄耐鹽性鑒定。番茄耐鹽性鑒定方面的研究主要兩種，一種是形態(tài)鑒定，地上部鮮重、根鮮重、地上部干重、根干重、壯苗指數(shù)、根/冠比作為幼苗期耐鹽鑒定指標(biāo)；其次是生理生化指標(biāo)，主要有脯氨酸、可溶性糖、丙二醛、相對(duì)葉綠素含量(SPAD)、SOD活性、POD活性等。番茄耐鹽性的遺傳規(guī)律還不是很清楚，控制耐鹽基因的遺傳定位也有待于深入研究，特別是還沒(méi)有找到能對(duì)番茄耐鹽性進(jìn)行可靠、高效的鑒定方法。半定量RT-PCR技術(shù)是研究植物的基因表達(dá)水平變化的一項(xiàng)重要技術(shù)，根據(jù)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的量可以確定目標(biāo)基因的表達(dá)水平。RT-PCR為反轉(zhuǎn)錄RCR(reversetranscript1n PCR)和實(shí)時(shí)PCR (real time PCR)共同的縮寫。反轉(zhuǎn)錄PCR是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的一種廣泛應(yīng)用的變形。在RT-PCR中，一條RNA鏈被逆轉(zhuǎn)錄成為互補(bǔ)DNA，再以此為模板通過(guò)PCR進(jìn)行DNA擴(kuò)增。RT-PCR的指數(shù)擴(kuò)增是一種很靈敏的技術(shù)，可以檢測(cè)很低拷貝數(shù)的RNA。
[0003]H+-PPase是定位于植物液泡膜上的一種H+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，它水解ppi為pi的同時(shí)能將H+從細(xì)胞質(zhì)跨過(guò)液泡膜泵入植物液泡中，從而起到酸化液泡、維持跨液泡膜H+梯度的作用。近幾年，此酶在植物抵御鹽脅迫和調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)方面的功能中逐步被認(rèn)識(shí)，并廣泛應(yīng)用。
[0004]本研究以番茄為材料，通過(guò)Real-time PCR技術(shù)對(duì)番茄鹽脅迫時(shí)H+-PPase基因的表達(dá)差異性分析，鑒定番茄耐鹽性。其目在于針對(duì)目前還沒(méi)有找到能對(duì)番茄耐鹽性進(jìn)行可靠、高效的鑒定方法，從基因水平上區(qū)分耐鹽性不同的番茄基因型，為培育抗逆性提高的番茄及其他植物新品種提供行之有效的檢測(cè)方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明目的是利用鹽脅迫時(shí)離體葉片中H+-PPase (氫離子轉(zhuǎn)運(yùn)無(wú)機(jī)焦磷酸酶)基因的表達(dá)差異來(lái)檢測(cè)番茄的耐鹽性。
[0006]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明通過(guò)以下方法予以實(shí)現(xiàn):
一種用于番茄耐鹽性測(cè)定的特異性引物，它具有SEQ ID NO: 1-2所示的核苷酸序列: it-PPase Forwoard: aatgaagagtgttggaagtgct get Reverse: cac gcacggtggt cttctcttca。
[0007]本發(fā)明進(jìn)一步公開了采用特異性引物進(jìn)行番茄耐鹽性測(cè)定的方法，其特征在于按如下的步驟進(jìn)行:
(1)以5-6葉番茄苗為材料，取番茄植株第一片成熟葉，離體葉片用蒸餾水沖洗3次，去離子水沖洗I次，葉片用剪刀剪成I X 2cm大小的長(zhǎng)方形，然后用去離子水沖洗3次，吸水紙吸干水分；
(2)選擇化學(xué)純的NaCl，5-8%(w/w)，處理時(shí)間為2_6min，提取葉片總RNA ;優(yōu)選NaCl，5% (w/w),處理時(shí)間為2min。
[0008](3)將得到的cDNA溶液用于下一步PCR擴(kuò)增；
(4) Real-time PCR
引物設(shè)計(jì):
Irt-PPase Forwoard: aatgaagagtgttggaagtgct get
Reverse: cac gcacggtggt cttctcttca
Real-time PCR 反應(yīng)體系:
模板:3ul 引物(0.4ηΜ):2ul All-1n-one:10ul MOX:0.4ul 水:2.6ul
其中所述的取番茄植株第一片成熟葉指的是從上往下數(shù)的第一片成熟葉。
[0009]本發(fā)明更進(jìn)一步公開了番茄耐鹽性的測(cè)定方法在不同基因型番茄苗耐鹽性方面的應(yīng)用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:植物在受到各種逆境危害時(shí)，膜的功能首先受到影響，通過(guò)膜上H+-PPase基因表達(dá)能快速準(zhǔn)確地比較不同基因型的耐鹽性。采用本發(fā)明的方法可以解決鑒定番茄耐鹽性受環(huán)境和植株大小等多方面影響的問(wèn)題?？梢杂行У貕嚎s田間試驗(yàn)的規(guī)模，節(jié)約時(shí)間和人力，大幅度提聞優(yōu)良耐鹽基因型的篩選效率，加速耐鹽植物育種的步伐。
[0010]耐鹽能力不同的番茄基因型，鹽脅迫下離體葉片中H+-PPase基因表達(dá)有很大的差異，耐鹽性強(qiáng)的番茄基因型H+-PPase基因表達(dá)量增強(qiáng)，耐鹽性弱的表達(dá)量變化很小。通過(guò)H+-PPase基因表達(dá)差異，比較番茄耐鹽大小。
[0011]本發(fā)明更加詳細(xì)的制備方法描述如下:
以5-6葉番茄苗為材料，取番茄植株第一片成熟葉(從上往下數(shù))。離體葉片用蒸餾水沖洗3次，去離子水沖洗I次，葉片用剪刀剪成I X 2cm大小的長(zhǎng)方形，然后用去離子水沖洗3次，吸水紙吸干水分。選擇化學(xué)純的NaCl，溶液濃度一般以5%為宜。處理時(shí)間為6min。葉片脅迫時(shí)間過(guò)長(zhǎng)RNA降解嚴(yán)重，提取困難。本發(fā)明是通過(guò)RT-PCR技術(shù)比較鹽脅迫下離體葉片中H+-PPase基因在不同基因型中的表達(dá)差異。耐鹽性強(qiáng)的番茄基因型H+-PPase基因表達(dá)量增強(qiáng)，耐鹽性弱的表達(dá)量變化很小。通過(guò)H+-PPase基因表達(dá)差異，比較番茄耐鹽大小。
[0012]本發(fā)明公開的番茄葉片耐鹽性的檢測(cè)方法與現(xiàn)有技術(shù)相比所具有的積極效果在于:
Cl)發(fā)明提取鹽脅迫時(shí)番茄葉片的RNA，通過(guò)RT-PCR技術(shù)，可以檢測(cè)很低拷貝數(shù)的RNA，非常靈敏。
[0013](2)杜絕了通過(guò)番茄形態(tài)、生物量和生理生化等受環(huán)境和植株大小等多方面的影響。可以有效地壓縮田間試驗(yàn)的規(guī)模，節(jié)約時(shí)間和人力，大幅度提高優(yōu)良耐鹽基因型的篩選效率，加速耐鹽植物育種的步伐。
[0014](3)利用本方法檢測(cè)番茄耐鹽性，只需要提供一片成熟葉即可，不需要整個(gè)植株，大大減少了工作量，方便快捷。
[0015]【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】:
圖1鹽脅迫下H+-PPase基因表達(dá)差異；其中1-4為L(zhǎng)A2711，l:0min，2:2 min, 3:4min, 4:6min。5-8 為 JF544, 5:Omin, 6:2 min, 7:4 min, 8:6min。
[0016]M:marker 自上而下為:100bp、250bp、500bp、750bp、1000bp、2000bp。
[0017]

【具體實(shí)施方式】
下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。所用到的耐鹽番茄LA2711和不耐鹽的天津地方品種津粉544番茄苗均由市售。
[0018]實(shí)施例1
1、耐鹽番茄LA2711和不耐鹽的天津地方品種津粉544 5_6葉番茄苗為材料，取番茄植株第一片成熟葉(從上往下數(shù))。離體葉片用蒸餾水沖洗3次，去離子水沖洗I次，葉片用剪刀剪成lX2cm大小的長(zhǎng)方形，然后用去離子水沖洗3次，吸水紙吸干水分。離體葉片在5% (w/w)氯化鈉溶液中經(jīng)過(guò)0，2，4，6min脅迫后，提取葉片總RNA，進(jìn)行I %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。
[0019]2、利用北京全式金生物技術(shù)有限公司的Transcript First-Strand cDNASynthesis SuperMix進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,得到的cDNA溶液用于下一步PCR擴(kuò)增。
[0020]3、Real-time PCR 引物設(shè)計(jì):
Irt-PPase Forwoard: aatgaagagtgttggaagtgct get
Reverse: cac gcacggtggt cttctcttca
Real-time PCR 反應(yīng)體系:
模板:3ul 引物(0.4ηΜ):2ul All-1n-one:10ul MOX:0.4ul 水:2.6ul。
[0021 ] 反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行I %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖1所示。以耐鹽番茄LA2711和不耐鹽的天津地方品種津粉544的離體葉片為材料，在5%氯化鈉溶液中脅迫不同時(shí)間，H+-PPase基因在LA2711對(duì)照葉片中沒(méi)有表達(dá)，鹽脅迫2min后表達(dá)急劇增強(qiáng)，4min后降低；而在JF544的葉片中H+-PPase基因表達(dá)不明顯。因此離體葉片在5%氯化鈉溶液中脅迫2min，H+-PPase基因表達(dá)差異可以區(qū)分不同基因型番茄耐鹽性。
[0022]實(shí)施例2
采用特異性引物進(jìn)行番茄耐鹽性測(cè)定的方法，其特征在于按如下的步驟進(jìn)行:
(I)以5-6葉番茄苗為材料，取番茄植株第一片成熟葉，指的是從上往下數(shù)的第一片成熟葉。離體葉片用蒸餾水沖洗3次，去離子水沖洗I次，葉片用剪刀剪成I X 2cm大小的長(zhǎng)方形，然后用去離子水沖洗3次，吸水紙吸干水分；(2)選擇化學(xué)純的NaCl，5%(w/w)，處理時(shí)間為2min，提取葉片總RNA ;
(3)將得到的cDNA溶液用于下一步PCR擴(kuò)增；
(4)Real-time PCR引物設(shè)計(jì):
Irt-PPase Forwoard: aatgaagagtgttggaagtgct getReverse: cac gcacggtggt cttctcttcaReal-time PCR 反應(yīng)體系:
模板:3ul引物(0.4ηΜ):2ulAll-1n-one:10ulMOX:0.4ul水:2.6ul。
【權(quán)利要求】
1.一種用于測(cè)定番茄耐鹽性的特異性引物，它具有SEQ ID NO: 1-2所示的核苷酸序列:
Irt-PPase Forwoard: aatgaagagtgttggaagtgct get
Reverse: cac gcacggtggt cttctcttca。
2.一種采用權(quán)利要求1所述的特異性引物進(jìn)行番茄耐鹽性測(cè)定的方法，其特征在于按如下的步驟進(jìn)行: (1)以5-6葉番茄苗為材料，取番茄植株第一片成熟葉，離體葉片用蒸餾水沖洗3次，去離子水沖洗I次，葉片用剪刀剪成I X 2cm大小的長(zhǎng)方形，然后用去離子水沖洗3次，吸水紙吸干水分； (2)選擇化學(xué)純的NaCl，5-8%(w/w)，處理時(shí)間為2_6min，提取葉片總RNA ; (3)將得到的cDNA溶液用于下一步PCR擴(kuò)增；
(4)Real-time PCR
引物設(shè)計(jì):
Irt-PPase Forwoard: aatgaagagtgttggaagtgct get
Reverse: cac gcacggtggt cttctcttca
Real-time PCR 反應(yīng)體系: 模板:3ul 引物(0.4nM):2ul All-1n-one:1ul MOX:0.4ul 水:2.6ul。
3.權(quán)利要求1所述番茄耐鹽性的測(cè)定方法，其中所述的取番茄植株第一片成熟葉指的是從上往下數(shù)的第一片成熟葉。
4.權(quán)利要求1所述番茄葉片耐鹽性的測(cè)定方法，其中所述的NaCl，5%(w/w)，處理時(shí)間為 2min。
5.權(quán)利要求1所述番茄葉片耐鹽性的測(cè)定方法可在不同基因型番茄苗耐鹽性方面應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104450906SQ201410734091
【公開日】2015年3月25日 申請(qǐng)日期:2014年12月8日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月8日
【發(fā)明者】郟艷紅, 王姝, 宋建, 吉利柱 申請(qǐng)人:天津市農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心