H3n2亞型禽流感病毒雙重實時熒光定量pcr檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種H3N2亞型禽流感病毒雙重實時熒光定量PCR檢測試劑盒，包括引物組和探針組；引物組有引物1至4，它們分別具有序列表SEQ.ID.No.1和2、SEQ.ID.No.4和5的堿基序列；探針組有探針A和探針B，它們分別具有序列表SEQ.ID.No.3和6的堿基序列。實驗證明，本發(fā)明具有檢測時間短、檢測敏感性高且特異性強的優(yōu)點，可實現(xiàn)同時檢測和鑒別H3亞型AIV和N2亞型AIV兩種病原體，并對其相應病原含量進行定量，因而可用于H3N2亞型AIV的快速診斷和監(jiān)測，因此本發(fā)明對H3N2亞型AIV的防治有重要意義。
【專利說明】H3N2亞型禽流感病毒雙重實時熒光定量PCR檢測試劑盒

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于PCR檢測病毒【技術領域】，尤其涉及一種H3N2亞型禽流感病毒雙重實時 熒光定量PCR檢測試劑盒。

【背景技術】
[0002] 禽流感（Avian influenza, Al)是危害禽類養(yǎng)殖的一類重要傳染病，其病原 體AIV為單股負鏈分節(jié)段的RNA病毒，其中血凝素（Hemagglutinin，HA)和神經氨酸酶 (Neuraminidase，NA)是兩個比較重要的基因節(jié)段，Susan等的研宄表明HA和NA基因之間 存在某種平衡對病毒的致病性有很大關系。H3亞型AIV為低致病性AIV，在禽類中呈隱性 攜帶，通常不發(fā)病或癥狀表現(xiàn)較輕，往往不被人們所注意，這為H3亞型AIV與其它亞型AIV 發(fā)生基因重排提供了條件。同時，H3亞型AIV具有感染犬、豬、馬等哺乳動物的能力，對人類 社會的公共衛(wèi)生安全具有潛在的重大危害性。N2亞型AIV是感染家禽（H9N2)并能致病的 常見NA亞型，可與大多數(shù)HA亞型AIV組合形成不同血清型的AIV，而傳統(tǒng)的血清學檢測方 法對混合感染的AIV具有局限性，因此，建立一種能準確、快速且能同時檢測H3N2亞型AIV 的方法顯得尤為重要。
[0003] 實時熒光定量PCR是將普通PCR方法與熒光檢測方法相結合，在PCR反應體系中 加入能與擴增模板特異性結合并標有熒光基團的探針，通過熒光積累來實時監(jiān)測PCR進 程。該法具有操作簡便、結果直觀、敏感性高、特異性強、可定量檢測等特點。尤其是多重實 時熒光定量PCR在臨床多種病原混合感染的鑒別診斷上具有獨特的優(yōu)勢。目前，針對H3N2 亞型 AIV多重熒光定量PCR方法未見報道。


【發(fā)明內容】

[0004] 本發(fā)明要解決的技術問題是提供一種敏感性好、特異性高、準確可靠、快速方便的 H3N2亞型禽流感病毒雙重實時熒光定量PCR檢測試劑盒，以實現(xiàn)同時檢測并定量H3N2亞型 禽流感病毒，為H3N2亞型AIV的監(jiān)測提供技術支撐。
[0005] 為解決上述技術問題，本發(fā)明采用以下技術方案：H3N2亞型禽流感病毒雙重實時 熒光定量PCR檢測引物組，包括兩對特異性引物，分別是引物1和2、引物3和4,它們分別 具有序列表SEQ. ID. No. 1和2、SEQ. ID. No. 4和5的堿基序列。
[0006] H3N2亞型禽流感病毒雙重實時熒光定量PCR檢測試劑盒，包括引物組和探針組； 引物組有引物1至4,它們分別具有序列表SEQ. ID. No. 1和2、SEQ. ID. No. 4和5的堿基序 列；探針組有探針A和探針B，它們分別具有序列表SEQ. ID. No. 3和6的堿基序列。
[0007] 探針A的5'端標記有報告熒光染料FAM，3'端標記有淬滅熒光染料ECLIPSE ;探 針B的5'端標記有報告熒光染料R0X，3'端標記有淬滅熒光染料ECLIPSE。
[0008] 引物1、引物2、探針A、引物3、引物4和探針B的摩爾比為1 :1 :1 :1 :1 :1。
[0009] 該試劑盒含有以下試劑：
[0010] A液：PCR擴增緩沖液、引物1、引物2、探針A、引物3、引物4、探針B ;
[0011] B液：AIV-H3+AIV-N2模板，作為陽性對照；
[0012] C液：ddH20,作為陰性對照。
[0013] A液中引物1、引物2、探針A終濃度均為0. 4 μ M，引物3、引物4、探針B終濃度均 為 0· 4 μΜ。
[0014] 針對目前缺乏對Η3Ν2亞型禽流感病毒進行檢測和診斷的有效可靠的技術，發(fā)明 人研宄篩選了兩套特異性的探針和引物，并通過進行不同濃度的配比，獲得最佳引物和探 針的濃度組合，據(jù)此建立了 Η3Ν2亞型禽流感病毒的雙重實時熒光定量PCR的檢測方法，并 制備了相應的檢測試劑盒。實驗證明，本發(fā)明具有如下優(yōu)點：
[0015] 1)檢測時間短
[0016] 應用本發(fā)明可實現(xiàn)一管二檢的目的，僅需約30分鐘，并且反應結果可以直接通過 電腦觀察，而常規(guī)的RT-PCR方法起碼需要3. 5小時來完成擴增反應，然后還得花2小時進 行凝膠電泳來觀察結果；
[0017] 2)檢測敏感性高且特異性強
[0018] 當Η3亞型AIV和Ν2亞型AIV同時存在時，本發(fā)明對其檢測的CT值與單個病毒檢 測的CT值比較，結果基本一樣，并未影響對Η3亞型AIV和Ν2亞型AIV的檢出及檢出的敏 感性。另外，利用本發(fā)明還可對樣品中相應病原含量進行定量，并且檢測敏感性非常高，均 能檢測到100個拷貝的Η3Ν2亞型AIV，比常規(guī)PCR方法敏感性高100倍，因而可用于Η3Ν2 亞型AIV的快速診斷和監(jiān)測，因此本發(fā)明對Η3Ν2亞型AIV的防治有重要意義。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0019] 圖1是熒光定量PCR檢測Η3亞型禽流感病毒的敏感性（FAM通道）結果圖，圖中： 1?7分別為I X IO8?I X 10 2拷貝/ μ 1，8陰性對照。
[0020] 圖2是熒光定量PCR檢測Η3亞型禽流感病毒的敏感性（FAM通道）的標準曲線。
[0021] 圖3是熒光定量PCR檢測Ν2亞型禽流感病毒的敏感性（ROX通道）結果圖，圖中： 1?7分別為I X IO8?I X 10 2拷貝/ μ 1，8陰性對照。
[0022] 圖4是熒光定量PCR檢測Ν2亞型禽流感病毒的敏感性（ROX通道）的標準曲線。
[0023] 圖5是熒光定量PCR檢測Η3亞型禽流感病毒的特異性（FAM通道）結果圖，圖中： 1-12 分別為 Η3Ν2、HlNl、Η3Ν6、Η3Ν8、Η4Ν2、Η4Ν5、Η5Ν1、Η6Ν1、Η6Ν6、Η6Ν8、Η7Ν2、Η9Ν2 亞型 AIV ; 13. NDV ; 14. IBV ; 15. ILTV ; 16. MG ; 17. ARV ; 18.空白對照。
[0024] 圖6是熒光定量PCR檢測N2亞型禽流感病毒的特異性（ROX通道）結果圖，圖中： 1-12 分別為 H3N2、HlNl、H3N6、H3N8、H4N2、H4N5、H5N1、H6N1、H6N6、H6N8、H7N2、H9N2 亞型 AIV ; 13. NDV ; 14. IBV ; 15. ILTV ; 16. MG ; 17. ARV ; 18.空白對照。
[0025] 圖7是熒光定量PCR檢測H3亞型禽流感病毒的批內重復性（FAM通道）結果圖， 圖中：1-5為IXlO 8拷貝/yL;6.陰性對照。
[0026] 圖8是熒光定量PCR檢測Ν2亞型禽流感病毒的批內重復性（ROX通道）結果圖， 圖中：1-5為IXlO 8拷貝/yL;6.陰性對照。

【具體實施方式】
[0027] 以下實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所用的材料、試劑 等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。具體所用材料和試劑如下：
[0028] LightcyCler2· 0熒光定量PCR儀（Roche)。膠回收試劑盒和質粒提取試劑盒購自 廣州東盛生物科技有限公司；PMD-18T試劑盒、反轉錄試劑和熒光PCR Premix Ex Taq購自 大連寶生物公司，DNA/RNA抽提試劑盒購自北京全式金生物技術有限公司。
[0029] H3N2、H6N8 亞型禽流感病毒記載在 "Visual detection of H3subtype avian influenza viruses by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification assay"，Virol J, 2011，8:337,公眾可從廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研宄所獲得；
[0030] HlNl亞型禽流感病毒記載在"利用RT-LAMP可視化檢測技術檢測Hl亞型禽流感 病毒及NI、N2亞型的分型"，病毒學報，2013, 29(2) : 154-159,公眾可從廣西壯族自治區(qū)獸 醫(yī)研宄所獲得；
[0031] H3N6亞型禽流感病毒記載在基因庫NCBI中，登錄號為"KM186122-KM186129"，公 眾可從廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研宄所獲得；
[0032] H3N8 亞型禽流感病毒記載在 "Genetic Characterization of a Natural Reassortant H3N8Avian Influenza Virus Isolated from Domestic Geese in Guangxi, Southern China"，Genome Announc. 2014, 2(4) :e00747_14,公眾可從廣西壯族自 治區(qū)獸醫(yī)研宄所獲得；
[0033] H4N2亞型禽流感病毒記載在基因庫NCBI中，登錄號為"KJ881013-KJ881020"，公 眾可從廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研宄所獲得；
[0034] H4N5、H5N1、H7N2亞型禽流感病毒記載在"H7N9亞型AIV雙重實時熒光定量 RT-PCR檢測方法的建立"，動物醫(yī)學進展，2013, 34 (12) : 1-5,公眾可從廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī) 研宄所獲得；
[0035] H6N1 記載在"Complete genome sequence analysis of an H6Nlavian influenza virus isolated from Guangxi pockmark ducks"，J. Virol. 2012, 86:13868 - 13869,公眾 可從廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研宄所獲得；
[0036] H6N6亞型禽流感病毒和雞毒霉形體（MG) S6株記載在"Epidemiological Surveillance of Low Pathogenic Avian Influenza Virus (LPAIV) from Po μ Ltry in Guangxi Province, Southern ChinaT3LOS ONE, 2013,8(10) :1_6,公眾可從廣西壯族自治區(qū) 獸醫(yī)研宄所獲得；
[0037] H9N2 禽流感病毒記載在 "Characterization of an avain influenza virus H9N2strain isolated from a wild bird in southern China. Genome Announc''， 2014, 2: e00600-14,公眾可從廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研宄所獲得；
[0038] 新城疫病毒（NDV F48E9株）記載在"新城疫病毒強弱毒株LAMP鑒別檢測方法的 建立"中國獸醫(yī)科學，2011，41 (09) : 917-922,公眾可從廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研宄所獲得；
[0039] 雞傳染性支氣管炎病毒（IBV H52株）記載在"雞傳染性支氣管炎病毒RT-LAMP可 視化檢測方法的建立"，中國農學通報，2012, 28 (20) : 83-87,公眾可從廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī) 研宄所獲得；
[0040] 雞傳染性喉氣管炎病毒（ILTV北京株）記載在"雞傳染性喉氣管炎病毒LAMP檢測 方法的建立獸醫(yī)科技，2012, 44(11) :52-55,公眾可從廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研宄所獲得；
[0041] 禽呼腸孤病毒（ARV S1733株）記載在"禽呼腸孤病毒S1733株單克隆抗體的制備 及夾心ELISA檢測方法的建立"，畜牧與獸醫(yī)，2013, 45(5)，49-52,公眾可從廣西壯族自治區(qū) 獸醫(yī)研宄所獲得。
[0042] 實施例1、引物與Taqman探針的設計與合成
[0043] 根據(jù)GenBank中H3亞型AIV和N2亞型AIV的保守序列，米用Primer Express 3. 0 軟件，設計了多套探針和引物，通過分析其引物之間的二聚體，選定兩對特異性引物和兩條 Taqmam 探針（表 1)。
[0044] 表1引物和TaqMan探針序列（5' -3'）
[0045]

【權利要求】
1. H3N2亞型禽流感病毒雙重實時熒光定量PCR檢測引物組，其特征在于包括兩對特異 性引物，分別是引物1和2、引物3和4,它們分別具有序列表SEQ. ID. No. 1和2、SEQ. ID. No. 4 和5的堿基序列。
2. -種H3N2亞型禽流感病毒雙重實時熒光定量PCR檢測試劑盒，其特征在于包括引 物組和探針組；引物組有引物1至4,它們分別具有序列表SEQ. ID. No. 1和2、SEQ. ID. No. 4 和5的堿基序列；探針組有探針A和探針B，它們分別具有序列表SEQ. ID. No. 3和6的堿基 序列。
3. 根據(jù)權利要求1所述的H3N2亞型禽流感病毒雙重實時熒光定量PCR檢測試劑 盒，其特征在于：所述探針A的5'端標記有報告熒光染料FAM，3'端標記有淬滅熒光染料 ECLIPSE ;所述探針B的5'端標記有報告熒光染料R0X，3'端標記有淬滅熒光染料ECLIPSE。
4. 根據(jù)權利要求2所述的H3N2亞型禽流感病毒雙重實時熒光定量RT-PCR檢測試劑 盒，其特征在于：所述引物1、引物2、探針A、引物3、引物4和探針B的摩爾比為1 :1 :1 :1 : 1 :1〇
5. 根據(jù)權利要求3所述的H3N2亞型禽流感病毒雙重實時熒光定量PCR檢測試劑盒，其 特征在于該試劑盒含有以下試劑： A液：PCR擴增緩沖液、引物1、引物2、探針A、引物3、引物4、探針B ; B液：AIV-H3+AIV-N2模板，作為陽性對照； C液：ddH20,作為陰性對照。
6. 根據(jù)權利要求5所述的H3N2亞型禽流感病毒雙重實時熒光定量PCR檢測試劑盒，其 特征在于：所述A液中引物1、引物2、探針A終濃度均為0.4 yM，引物3、引物4、探針B終 濃度均為〇. 4 yM。
【文檔編號】C12Q1/70GK104498629SQ201410735120
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2014年12月5日 優(yōu)先權日:2014年12月5日
【發(fā)明者】謝芝勛, 劉婷婷, 謝志勤, 鄧顯文, 羅思思, 劉加波, 謝麗基, 黃莉, 黃嬌玲, 曾婷婷, 王盛, 張艷芳 申請人:廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所