一種nras基因突變檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明適用于生物技術(shù)以及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，涉及一種NRAS基因突變檢測試劑盒及檢測方法。本發(fā)明的檢測試劑盒包括第1-7號試劑，分別包括正向引物、反向引物和探針。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：采用熒光定量PCR方法對NRAS基因突變區(qū)域序列進(jìn)行特異性擴(kuò)增檢測，在6個(gè)單管中一次檢測17個(gè)突變位點(diǎn)，在保證高靈敏度和特異性的同時(shí)兼顧更多的突變位點(diǎn)。本發(fā)明實(shí)施例提供的檢測試劑盒靈敏度高，特異性好，是一種性能優(yōu)良的人類NRAS基因突變檢測試劑盒。
【專利說明】-種NRAS基因突變檢測試劑盒

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)以及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，尤其涉及一種人類NRAS基因突變檢測試劑 盒。

【背景技術(shù)】
[0002] NRAS基因定位于染色體1ρ31，是具有GTP酶活性的RAS家族成員之一，是細(xì)胞生 長、增殖和分化中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。正常的RAS蛋白定位于細(xì)胞內(nèi)膜，對GTP和GDP具有高 度親和力，并具有GTP酶的活性。通常情況下，細(xì)胞內(nèi)的RAS蛋白與GDP結(jié)合處于非活化狀 態(tài)，在受到上游途徑效應(yīng)因子刺激時(shí)，RAS蛋白發(fā)生構(gòu)型變化轉(zhuǎn)變?yōu)槟芘cGTP結(jié)合的構(gòu)型而 成為活化狀態(tài)，活化的RAS蛋白與下游效應(yīng)分子相互作用，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞生長信號傳導(dǎo)，而這種 作用發(fā)生后，RAS蛋白憑借GTP酶活性將GTP水解為GDP，并且使活化的RAS蛋白去活化，轉(zhuǎn) 變?yōu)榉腔钚誀顟B(tài)的RAS蛋白。RAS蛋白通過與⑶P和GTP結(jié)合并水解GTP完成其對正常細(xì) 胞生長信號傳遞和調(diào)節(jié)功能。RAS基因突變使得其喪失了 GTP酶活性，阻止了 GTP與RAS蛋 白的解離，使得結(jié)合有GTP的RAS蛋白一直保持活性狀態(tài)，導(dǎo)致持續(xù)激活下游效應(yīng)因子，從 而引起正常細(xì)胞的增殖生長失控向癌細(xì)胞轉(zhuǎn)化。自82年以來，已經(jīng)在膀胱癌、乳腺癌、結(jié)腸 癌、腎癌、肝癌、胰腺癌、胃癌以及造血系統(tǒng)腫瘤中檢測出了 RAS癌基因的異常。KRAS基因突 變通常出現(xiàn)在胰腺癌、肺癌以及結(jié)直腸癌實(shí)體瘤細(xì)胞中，HRAS -般在膀胱癌腫瘤中較為常 見，而NRAS常常出現(xiàn)在血液腫瘤和黑色素瘤細(xì)胞中。
[0003] 表1 :人類NRAS基因的17種突變
[0004]

【權(quán)利要求】
1. 一種用于檢測受試者中NRAS基因突變的試劑盒，包括分開設(shè)置的第1-7號試劑，其 中： a. 該第1號試劑包含：序列為SEQ ID NO: 1的反向引物、序列為SEQ ID NO:2的正向引 物、序列為SEQ ID N0:3的正向引物、序列為SEQ ID N0:4的正向引物、序列為SEQ ID N0:5 的正向引物、序列為SEQ ID N0:6的正向引物和核酸序列為SEQ ID N0:7的探針； b. 該第2號試劑包含：序列為SEQ ID NO: 1的反向引物、序列為SEQ ID N0:8的正向 引物、序列為SEQ ID N0:9的正向引物、序列為SEQ ID NO: 10的正向引物和核酸序列為SEQ ID NO:7的探針； c. 該第3號試劑包含：序列為SEQ ID NO: 11的反向引物、序列為SEQ ID NO: 12的正 向引物和核酸序列為SEQ ID NO: 13的探針； d. 該第4號試劑包含：序列為SEQ ID NO: 11的反向引物、序列為SEQ ID NO: 14的正 向引物、序列為SEQ ID NO: 15的正向引物、序列為SEQ ID NO: 16的正向引物和核酸序列為 SEQ ID NO: 13 的探針； e. 該第5號試劑包含：序列為SEQ ID NO: 17的反向引物、序列為SEQ ID NO: 18的正 向引物和核酸序列為SEQ ID NO: 19的探針； f. 該第6號試劑包含：序列為SEQ ID N0:20的反向引物、序列為SEQ ID N0:21的正 向引物和核酸序列為SEQ ID NO:22的探針； g. 該第7號試劑包含：序列為SEQ ID N0:23的正向引物、序列為SEQ ID NO: 11的反 向引物和核酸序列為SEQ ID NO: 13的探針； 并且，所述的核酸序列分別為SEQ ID NO:7、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 19和SEQ ID NO:22的探針在核酸的5'端連接有熒光報(bào)告基團(tuán)，在核酸的3'端連接有熒光淬滅基團(tuán)； 優(yōu)選地，所述的受試者是人類癌癥患者；進(jìn)一步優(yōu)選地，所述的受試者是人類癌癥患者 中的黑色素瘤和血液腫瘤患者。
2. 權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于： 在第1號試劑中，序列為SEQ ID N0:1的反向引物、序列為SEQ ID N0:2的正向引 物、序列為SEQ ID N0:3的正向引物、序列為SEQ ID N0:4的正向引物、序列為SEQ ID N0:5的正向引物、序列為SEQ ID N0:6的正向引物和核酸序列為SEQ ID N0:7的探針的 物質(zhì)的量比為：〇? 2 ii M-1. 2 ii M :0? 067 ii M-0. 4 ii M :0? 067 ii M-0. 4 ii M :0? 13 ii M-0. 8 ii M : 0. 033 u M-0. 2 u M ：0. 1 u M-〇. 6 u M ：0. 1 u M-〇. 5 u M ； 在第2號試劑中，序列為SEQ ID N0:1的反向引物、序列為SEQ ID N0:8的正向引 物、序列為SEQ ID N0:9的正向引物、序列為SEQ ID NO: 10的正向引物和核酸序列為SEQ ID N0:7 的探針的物質(zhì)的量比為 0.2iiM-1.2iiM:0.067iiM-0.4iiM:0.033iiM-0.2iiM : 0. 2uM-l. 2uM ：0. luM-0. 5uM； 在第3號試劑中，序列為SEQ ID NO: 11的反向引物、序列為SEQ ID NO: 12的正向 引物和核酸序列為SEQ ID N0:13的探針的物質(zhì)的量比為0.2iiM-liiM:0.2iiM-liiM: 0. 1 u M-0. 5 u M ； 在第4號試劑中，序列為SEQ ID NO: 11的反向引物、序列為SEQ ID NO: 14的正向 引物、序列為SEQ ID NO: 15的正向引物、序列為SEQ ID NO: 16的正向引物和核酸序列為 SEQ ID NO: 13 的探針的物質(zhì)的量比為 0? 1 ii M-0. 6 ii M :0? 05 ii M-0. 3 ii M :0? 05 ii M-0. 3 ii M : 0. 1 li M-0. 6 u M ：0. 1 u M-0. 5 u M ；； 在第5號試劑中，序列為SEQ ID NO: 17的反向引物、序列為SEQ ID NO: 18的正向 引物和核酸序列為SEQ ID N0:19的探針的物質(zhì)的量比為0.2iiM-liiM:0.2iiM-liiM: 0. 1 u M-0. 5 u M ； 在第6號試劑中，序列為SEQ ID N0:20的反向引物、序列為SEQ ID N0:21的正向 引物和核酸序列為SEQ ID N0:22的探針的物質(zhì)的量比為0.2iiM-liiM:0.2iiM-liiM: 0. 1 u M-0. 5 u M ； 在第7號試劑中，序列為SEQ ID N0:23的正向引物、序列為SEQ ID NO: 11的反向 引物和核酸序列為SEQ ID N0:13的探針的物質(zhì)的量比為0.2iiM-liiM:0.2iiM-liiM: 0. 1 u M-0. 5 u M〇
3. 如權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于，所述熒光報(bào)告基團(tuán)選自FAM、VIC、 R0X、CY3和CY5,或者為波長范圍相似的其它熒光報(bào)告基團(tuán)；所述熒光淬滅基團(tuán)選自TAMRA、 BHQ1、BHQ2和NFQ ;并且熒光報(bào)告基團(tuán)與熒光報(bào)告基團(tuán)的搭配需根據(jù)熒光能量共振轉(zhuǎn)移原 理來選擇； 優(yōu)選地，所述探針中，核酸的3'端采用了 MGB-NFQ修飾。
4. 權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于，所述第1-7號試劑中還包含PCR緩沖 液、R0X參比染料、Taq酶的一種或多種； 優(yōu)選地，所述的 PCR 緩沖液組成為 Tris-HCl、（NH)2S04、MgCl2、Tween 20 和 dNTPs。 進(jìn)一步優(yōu)選地，所述的Tris-HCl、（NH)2S04、MgCl2、Tween 20和dNTPs的濃度分別為 50-100mM、5-30mM、l-8mM、5% -15%、和 100-200 iiM。
5. 權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒還包括第8號試劑，并且 所述的第8號試劑是Taq酶。
6. 權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒還包括第9號試劑，并且 所述的第9號試劑是空白對照； 優(yōu)選地，所述的空白對照是pH為8. 0的10mM Tris-HCl。
7. 權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒還包括第10號試劑，并且 所述的第10號試劑是弱陽性對照； 優(yōu)選地，所述的弱陽性對照是含有NRAS基因6種突變類型質(zhì)粒和內(nèi)標(biāo)質(zhì)粒的混合液。
8. 權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于，所述第1-7號試劑中包含的dATP、dUTP、 dCTP和dGTP構(gòu)成的dNTPs混合液和UNG酶，形成抗污染系統(tǒng)； 優(yōu)選地,所述的dATP、dUTP、dCTP和dGTP的物質(zhì)的量比例為0. lmM-0. 5mM :0. : 0. lmM-0. 5mM :0. lmM-0. 5mM。
9. 如權(quán)利要求1或2所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述第1-6號試劑中包含根據(jù)特 定基因序列設(shè)計(jì)的內(nèi)標(biāo)引物探針，形成內(nèi)標(biāo)系統(tǒng)； 優(yōu)選地，所述內(nèi)標(biāo)系統(tǒng)優(yōu)選的內(nèi)標(biāo)引物探針的核酸序列分別為SEQ ID N0:24、SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26,其中SEQ ID NO:26為5'端連接有熒光報(bào)告基團(tuán)、3'端連接有熒光 淬滅基團(tuán)的探針； 更優(yōu)選地，核酸序列為SEQ ID N0:26的內(nèi)標(biāo)探針熒光報(bào)告基團(tuán)為VIC，熒光淬滅基團(tuán)為 TAMRA〇
10. 如權(quán)利要求1或2所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒還包酶混合液、空 白對照、弱陽性質(zhì)控、強(qiáng)陽性質(zhì)控、點(diǎn)樣用指示劑和樣品稀釋液等試劑盒輔助成分中的一種 或多種。
11. 如權(quán)利要求1或2所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括可用于核酸 提取的第11號、第12號、第13號和第14號試劑，并且所述的第11-14號試劑包括蛋白酶 K、裂解液、洗滌液和洗脫液。
【文檔編號】C12Q1/68GK104372103SQ201410735327
【公開日】2015年2月25日 申請日期:2014年12月5日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月5日
【發(fā)明者】蔡從利, 董瑞華, 彭盼, 張喆, 周鵬飛 申請人:武漢友芝友醫(yī)療科技有限公司