基于核酸內(nèi)切酶特異性識別的細(xì)胞分選系統(tǒng)的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種基于核酸內(nèi)切酶特異性識別的細(xì)胞分選系統(tǒng)，所述的分選系統(tǒng)包含以下組分：第一單鏈核苷酸、第二單鏈核苷酸、抗體、細(xì)胞分選介質(zhì)、限制性內(nèi)切酶；所述的第一單鏈核苷酸和第二單鏈核苷酸互補(bǔ)，且互補(bǔ)區(qū)域含有所述限制性內(nèi)切酶的識別位點(diǎn)；所述的第一單鏈核苷酸、第二單鏈核苷酸、抗體、細(xì)胞分選介質(zhì)均被修飾，修飾后的第一單鏈核苷酸可與修飾后的抗體相連接，修飾后的第二單鏈核苷酸可與修飾后的細(xì)胞分選介質(zhì)相連接。本發(fā)明還提供了利用上述系統(tǒng)分選細(xì)胞的方法，從細(xì)胞樣品中分選DC細(xì)胞、NK細(xì)胞和CIK細(xì)胞的試劑盒及方法。本發(fā)明的細(xì)胞分選技術(shù)實(shí)現(xiàn)了同時(shí)分選多種細(xì)胞，可進(jìn)行大量及脆弱細(xì)胞的分選，細(xì)胞得率和存活率高。
【專利說明】基于核酸內(nèi)切酶特異性識別的細(xì)胞分選系統(tǒng)

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】，具體地說，涉及一種基于核酸內(nèi)切酶特異性識別 的細(xì)胞分選系統(tǒng)。

【背景技術(shù)】
[0002] 現(xiàn)有的細(xì)胞分選技術(shù)主要有以下兩種：
[0003] ①流式細(xì)胞分離技術(shù)
[0004] 通過分離含有單細(xì)胞的液滴而實(shí)現(xiàn)的。將待測細(xì)胞與單克隆抗體和熒光染料結(jié)合 后制成懸浮標(biāo)本，在一定氣體壓力下樣品進(jìn)入流動(dòng)室，在不含細(xì)胞的緩沖液包裹下單行排 列。在流動(dòng)室的超尚頻的壓電晶體的尚頻振蕩下，液流斷裂為均勾的液滴，待測細(xì)胞就包含 在液滴之中。將這些液滴充上正或負(fù)電荷，當(dāng)帶電液滴通過電場，在電場的作用下發(fā)生偏 轉(zhuǎn)，然后落入相應(yīng)的收集器之中，從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞分選。
[0005] ②免疫磁珠技術(shù)
[0006] 磁珠表面包被具免疫反應(yīng)性的抗體，與細(xì)胞表面的抗原進(jìn)行特異性結(jié)合；后者置 于強(qiáng)大的磁場下，就會與未結(jié)合的細(xì)胞分開；脫離磁場后會立即消失磁性，這樣就可以篩選 或去除所標(biāo)記的細(xì)胞，從而達(dá)到篩選出陽性或陰性細(xì)胞的目的。其流程圖如圖1所示。
[0007] 以上技術(shù)存在以下不足：流式細(xì)胞分離技術(shù)雖然可以分選得到目的細(xì)胞，但是① 細(xì)胞必須能被熒光分子標(biāo)記；②只能檢測懸浮的單細(xì)胞；③分選過程不夠溫和，對細(xì)胞傷 害大；④可能污染細(xì)胞；⑤不利于大體積樣品的分選。免疫磁珠分選技術(shù)雖然可以通過正、 負(fù)兩種篩選獲得目的細(xì)胞，但是①無法完成"一次結(jié)合"分離多種細(xì)胞；②如果需要從一個(gè) 樣品里面篩選多個(gè)目的細(xì)胞，需要多次結(jié)合和洗脫，得到的細(xì)胞活性差、得率低；③多次分 選，成本高；④目的細(xì)胞與磁珠不能完全分離，不利于后續(xù)研宄。
[0008] 目前關(guān)于對細(xì)胞傷害小、可同時(shí)分選多種細(xì)胞、獲得的目的細(xì)胞能夠與載體徹底 分離，適用于大量及脆弱細(xì)胞分選的技術(shù)還未見報(bào)道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種基于核酸內(nèi)切酶特異性識別的 細(xì)胞分選系統(tǒng)。
[0010] 本發(fā)明的再一的目的是，提供一種從細(xì)胞樣品中分選目的細(xì)胞的方法。
[0011] 本發(fā)明的另一的目的是，提供一種分選DC細(xì)胞、NK細(xì)胞和CIK細(xì)胞的試劑盒。
[0012] 本發(fā)明的第四個(gè)目的是，提供一種從細(xì)胞樣品中分選DC細(xì)胞、NK細(xì)胞和CIK細(xì)胞 的方法。
[0013] 為實(shí)現(xiàn)上述第一個(gè)目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：
[0014] -種基于核酸內(nèi)切酶特異性識別的細(xì)胞分選系統(tǒng)，所述的分選系統(tǒng)包含以下組 分：第一單鏈核苷酸、第二單鏈核苷酸、抗體、細(xì)胞分選介質(zhì)、限制性內(nèi)切酶；所述的第一單 鏈核苷酸和第二單鏈核苷酸互補(bǔ)，且互補(bǔ)區(qū)域含有所述限制性內(nèi)切酶的識別位點(diǎn)；所述的 第一單鏈核苷酸、第二單鏈核苷酸、抗體、細(xì)胞分選介質(zhì)均被修飾，修飾后的第一單鏈核苷 酸可與修飾后的抗體相連接，修飾后的第二單鏈核苷酸可與修飾后的細(xì)胞分選介質(zhì)相連 接。
[0015] 其中，所述的第一單鏈核苷酸和第二單鏈核苷酸為部分序列互補(bǔ)或完全互補(bǔ)。
[0016] 優(yōu)選地，所述的第一單鏈核苷酸或第二單鏈核苷酸的長度為6bp_lkb。
[0017] 更優(yōu)選地，所述的第一單鏈核苷酸或第二單鏈核苷酸的長度為18bp_50bp。
[0018] 優(yōu)選地，所述的細(xì)胞分選介質(zhì)是磁珠、分離柱或聚陽離子納米顆粒。
[0019] 更優(yōu)選地，所述的第一單鏈核苷酸被巰基修飾，所述的第二單鏈核苷酸被生物素 修飾，所述的抗體被順丁烯二酰亞胺修飾，所述的磁珠被鏈霉親和素修飾。
[0020] 為實(shí)現(xiàn)上述第二個(gè)目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：
[0021] 一種從細(xì)胞樣品中分選目的細(xì)胞的方法，所述的方法包括以下步驟：
[0022] a)合成互補(bǔ)的單鏈核苷酸，制備"磁珠/單鏈核苷酸"和"抗體/單鏈核苷酸"復(fù) 合物；
[0023] b)在細(xì)胞樣品中加入"抗體/單鏈核苷酸"復(fù)合物，形成"單鏈核苷酸/抗體/細(xì) 胞"復(fù)合物；
[0024] c)將"磁珠/單鏈核苷酸"復(fù)合物加入到"單鏈核苷酸/抗體/細(xì)胞"復(fù)合物中， 形成"磁珠/雙鏈核苷酸/抗體/細(xì)胞"復(fù)合物；
[0025] d)通過外加磁場的作用，磁性吸附目的細(xì)胞，去除非目的細(xì)胞；
[0026] e)針對不同的目的細(xì)胞，每次使用不同的限制性內(nèi)切酶剪切含有特定識別序列的 雙鏈核苷酸，逐次洗脫不同的目的細(xì)胞。
[0027] 優(yōu)選地，步驟b)中細(xì)胞樣品的體積、細(xì)胞樣品中目的細(xì)胞個(gè)數(shù)、目的細(xì)胞對應(yīng)的 抗體質(zhì)量的比例為：ImL細(xì)胞樣品：IO 6-IO9個(gè)目的細(xì)胞：5-100 yg目的細(xì)胞對應(yīng)的抗體。
[0028] 優(yōu)選地，步驟c)中所述的"單鏈核苷酸/抗體/細(xì)胞"復(fù)合物與"磁珠/單鏈核苷 酸"復(fù)合物的個(gè)數(shù)比為1:5-1:100。
[0029] 優(yōu)選地，步驟b)反應(yīng)條件為2-8°C，5-30min。
[0030] 優(yōu)選地，步驟c)反應(yīng)條件為15-25°C，5-30min。
[0031] 為實(shí)現(xiàn)上述第三個(gè)目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：
[0032] 一種分選DC細(xì)胞、NK細(xì)胞和CIK細(xì)胞的試劑盒，所述的試劑盒包含以下組分：巰 基與生物素修飾的三對單鏈核苷酸，⑶3、⑶56和HLA-DR抗體，鏈霉親和素磁珠，限制性內(nèi) 切酶 BamH I、EcoR I、Hind III。
[0033] 優(yōu)選地，所述的三對單鏈核苷酸的序列分別如SEQ ID NO. I-SEQ ID NO. 6所示。
[0034] 為實(shí)現(xiàn)上述第四個(gè)目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：
[0035] 一種從細(xì)胞樣品中分選DC細(xì)胞、NK細(xì)胞和CIK細(xì)胞的方法，它包括以下步驟：
[0036] a)合成三對互補(bǔ)的單鏈核苷酸，制備三種"磁珠/單鏈核苷酸"和三種"抗體/單 鏈核苷酸"復(fù)合物，所述的抗體分別為CD3、CD56和HLA-DR抗體，所述的三對單鏈核苷酸片 段的序列分別如SEQ ID NO. I-SEQ ID NO. 6所示；
[0037] b)在細(xì)胞樣品中加入三種"抗體/單鏈核苷酸"復(fù)合物，形成"單鏈核苷酸/抗體 /細(xì)胞"復(fù)合物；
[0038] c)將三種"磁珠/單鏈核苷酸"復(fù)合物加入到"單鏈核苷酸/抗體/細(xì)胞"復(fù)合物 中，形成"磁珠/雙鏈核苷酸/抗體/細(xì)胞"復(fù)合物；
[0039] d)通過外加磁場的作用，分離獲得與磁珠結(jié)合的細(xì)胞；
[0040] e)針對不同的目的細(xì)胞，分別使用限制性內(nèi)切酶BamH I、EcoR I、Hind III逐次 洗脫。
[0041] 優(yōu)選地，步驟b)中細(xì)胞樣品的體積、細(xì)胞樣品中目的細(xì)胞個(gè)數(shù)、目的細(xì)胞對應(yīng)的 抗體質(zhì)量的比例為：ImL細(xì)胞樣品：IO 6-IO9個(gè)目的細(xì)胞：5-100 yg目的細(xì)胞對應(yīng)的抗體。
[0042] 優(yōu)選地，步驟c)中所述的"單鏈核苷酸/抗體/細(xì)胞"復(fù)合物與"磁珠/單鏈核苷 酸"復(fù)合物的個(gè)數(shù)比為1:5-1:100。
[0043] 優(yōu)選地，步驟b)反應(yīng)條件為2-8°C，5-30min。
[0044] 優(yōu)選地，步驟c)反應(yīng)條件為15-25°C，5-30min。
[0045] 本文中，所述的"細(xì)胞分選介質(zhì)"包含所有用于分選細(xì)胞的介質(zhì)，例如磁珠、分離 柱、聚陽離子納米顆粒等其他可以達(dá)到分選目的的介質(zhì)。所述的第一單鏈核苷酸、第二單鏈 核苷酸、抗體、細(xì)胞分選介質(zhì)的修飾方式并不限于以上內(nèi)容記載的方式，任何可以使這些分 子結(jié)合的方式都是可以接受的。
[0046] 本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于：
[0047] 本發(fā)明在常規(guī)細(xì)胞分選技術(shù)的基礎(chǔ)上引入了兩種特異性識別機(jī)制（限制性內(nèi)切 酶對雙鏈核苷酸序列的特異性識別、抗體與抗原的特異性識別），實(shí)現(xiàn)一次吸附再多次分離 得到多種目的產(chǎn)物。
[0048] 本發(fā)明的細(xì)胞分選技術(shù)可以彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足，與流式細(xì)胞技術(shù)相比對細(xì)胞傷 害?。慌c免疫磁珠技術(shù)相比，可同時(shí)分選多種細(xì)胞，且獲得的目的細(xì)胞能夠與細(xì)胞分選介質(zhì) 分離，因而細(xì)胞可用于再次分選。本發(fā)明的技術(shù)可進(jìn)行大量及脆弱細(xì)胞的分選，細(xì)胞得率和 存活率高。
[0049] 本發(fā)明的技術(shù)在細(xì)胞分選基礎(chǔ)上，可作為細(xì)胞治療中的配套技術(shù)，為細(xì)胞治療提 供高純度、有活力的細(xì)胞，也可用于檢測分析領(lǐng)域，與微量的核酸檢測設(shè)備聯(lián)合使用，對不 同的目標(biāo)物進(jìn)行定量檢測。其為臨床診斷、細(xì)胞分離、檢測、細(xì)胞療法等領(lǐng)域帶來福音。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0050] 圖1是免疫磁珠分選技術(shù)的原理與流程圖。
[0051] 圖2是本發(fā)明基于核酸內(nèi)切酶特異性識別的細(xì)胞分選系統(tǒng)的原理與流程圖。
[0052] 圖3是單鏈核苷酸與抗體通過Thiol/Malemide結(jié)合示意圖。Ab :抗體；Oligo :單 鏈核苷酸；SH-:巰基。
[0053] 圖4是本發(fā)明分選的NK細(xì)胞流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果。
[0054] 圖5是本發(fā)明分選的CIK細(xì)胞流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果。
[0055] 圖6是本發(fā)明分選的DC細(xì)胞流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果。
[0056] 圖7是兩種方法分選的NK細(xì)胞培養(yǎng)后形態(tài)。A.流式細(xì)胞儀分選的細(xì)胞形態(tài)，B.本 發(fā)明分選的細(xì)胞形態(tài)。

【具體實(shí)施方式】
[0057] 下面結(jié)合附圖對本發(fā)明提供的【具體實(shí)施方式】作詳細(xì)說明。
[0058] 本發(fā)明基于核酸內(nèi)切酶特異性識別的細(xì)胞分選系統(tǒng)分選流程圖如圖2所示，步驟 如下：
[0059] ①選擇不同的抗體對不同目的細(xì)胞表面標(biāo)記，合成兩個(gè)互補(bǔ)的單鏈寡核苷酸（約 20bp)，一個(gè)單鏈寡核苷酸末端修飾有Thiol (疏基），另一個(gè)單鏈寡核苷酸末端修飾有 Biotin (生物素）。
[0060] ②兩個(gè)單鏈寡核苷酸分別與被Maleimide (順丁烯二酰亞胺）修飾的抗體以及 Str印tavidin (鏈霉親和素）包被的細(xì)胞分選介質(zhì)表面進(jìn)行反應(yīng)，分別形成"細(xì)胞分選介質(zhì) /單鏈核苷酸"和"抗體/單鏈核苷酸"兩種結(jié)構(gòu)。
[0061] ③在細(xì)胞樣品中加入"抗體/單鏈核苷酸"復(fù)合物，抗體將識別目的細(xì)胞上的表面 標(biāo)記，并與細(xì)胞結(jié)合，形成"單鏈核苷酸/抗體/細(xì)胞"結(jié)構(gòu)。
[0062] ④隨后將"細(xì)胞分選介質(zhì)/單鏈核苷酸"結(jié)構(gòu)加入到分離體系中，兩條單鏈核苷酸 通過堿基互補(bǔ)配對，形成"細(xì)胞分選介質(zhì)/雙鏈核苷酸/抗體/細(xì)胞"結(jié)構(gòu)。
[0063] ⑤當(dāng)所述的細(xì)胞分選介質(zhì)為磁珠時(shí)，則通過外加磁場的作用，目的細(xì)胞將被磁性 吸附，從而去除非目的細(xì)胞；當(dāng)所述的細(xì)胞分選介質(zhì)為磁珠以外的其它介質(zhì)時(shí)，則使用相應(yīng) 的吸附該介質(zhì)的方法以去除非目的細(xì)胞。
[0064] ⑥針對不同的目的細(xì)胞，每次使用不同的限制性內(nèi)切酶來剪切含有特定識別序列 的核苷酸，可以逐次洗脫不同的目的細(xì)胞，完成一次結(jié)合分離多種不同目的細(xì)胞。
[0065] 其中，以上步驟中，也可以先將"抗體/單鏈核苷酸"復(fù)合物與"細(xì)胞分選介質(zhì)/單 鏈核苷酸"結(jié)合，隨后再加入到細(xì)胞樣品中。
[0066] 實(shí)施例1
[0067] 以免疫細(xì)胞治療為主導(dǎo)的細(xì)胞治療在癌癥治療方面有很大的作用，免疫細(xì)胞治療 中用到的主要細(xì)胞類型有：DC細(xì)胞、NK細(xì)胞和CIK細(xì)胞。這些細(xì)胞因培養(yǎng)條件不同，所以需 要分開后再進(jìn)行培養(yǎng)才能取得良好的擴(kuò)增效果。本實(shí)施例的目的是一次分離血液中的這三 種細(xì)胞，具體的分離方案如下：
[0068] 1實(shí)驗(yàn)材料
[0069] ① CD3、CD56 和 HLA-DR 抗體，購于 Biolegend 公司；
[0070] ②巰基與生物素修飾的單鏈核苷酸片段，合成于金唯智公司；
[0071] ③核酸內(nèi)切酶BamH I、EcoR I、Hind III，購于NEB公司；
[0072] ④鏈霉親和素磁珠，購于東莞市漢諾生物技術(shù)有限公司；
[0073] ⑤細(xì)胞培養(yǎng)基X-VIV0?15ChemicalIy Defined, Serum-free Hematopoietic Cell Medium，購于美國Lonza公司；
[0074] ⑥洗脫緩沖液（限制性核酸內(nèi)切酶的反應(yīng)體系即NEB公司核酸內(nèi)切酶的通用 Buffer)；
[0075] ⑦人外周血單核細(xì)胞，提取方法如下：
[0076] a收集人外周血樣品10mL，用2-4倍體積的PBS稀釋樣品；50mL離心管中加入15mL 淋巴細(xì)胞分離液；
[0077] b將稀釋的血液樣品緩慢加入到淋巴細(xì)胞分離液上，盡量使血液樣品保持在淋巴 細(xì)胞分離液上層；
[0078] c室溫X400gX30min，收集云霧層的PBMC細(xì)胞；
[0079] d 40mL無菌的PBS重懸PBMC細(xì)胞，室溫X200gX10min，去上清；
[0080] e 40mL無菌的PBS重懸一次，室溫X200gX10min，用凍存液重懸分裝凍存。
[0081] 2實(shí)驗(yàn)方法
[0082] CD3、CD5和HLA-DR抗體（各種細(xì)胞表面的抗體如表1)分別與不同的單鏈核苷酸 片段結(jié)合，同時(shí)與其配對的單鏈核苷酸序列與不同的磁珠結(jié)合（核苷酸序列及核酸內(nèi)切酶 如表2)，特異性的核酸內(nèi)切酶配置在洗脫緩沖液中。
[0083] 生物素修飾的單鏈核苷酸與鏈霉親和素包被的磁珠結(jié)合反應(yīng)條件為：二者混合在 37°C 反應(yīng) 30min。
[0084] 疏基修飾的單鏈核苷酸與順丁稀二酰亞胺修飾的抗體結(jié)合反應(yīng)使用Thermo公 司的 Imject Maleimide-Activated Mariculture KLH and Kit 試劑盒。具體原理為： sulfo-SMCC交聯(lián)劑修飾過的Malemide具有與疏基緊密結(jié)合的特性，且很穩(wěn)定；抗體與單鏈 核苷酸的連接依賴抗體蛋白的氨基與sulfo-SMCC交聯(lián)劑的S<V的相互作用；Malemide可 以與帶有巰基的單鏈核苷酸相互作用形成穩(wěn)定的硫醚鍵（參見圖3)。
[0085] 表1.各種細(xì)胞的主要表面標(biāo)記
[0086]
[0087] 表2.核苷酸序列及核酸內(nèi)切酶

【權(quán)利要求】
1. 一種基于核酸內(nèi)切酶特異性識別的細(xì)胞分選系統(tǒng)，其特征在于，所述的分選系統(tǒng)包 含以下組分：第一單鏈核苷酸、第二單鏈核苷酸、抗體、細(xì)胞分選介質(zhì)、限制性內(nèi)切酶；所述 的第一單鏈核苷酸和第二單鏈核苷酸互補(bǔ)，且互補(bǔ)區(qū)域含有所述限制性內(nèi)切酶的識別位 點(diǎn)；所述的第一單鏈核苷酸、第二單鏈核苷酸、抗體、細(xì)胞分選介質(zhì)均被修飾，修飾后的第一 單鏈核苷酸可與修飾后的抗體相連接，修飾后的第二單鏈核苷酸可與修飾后的細(xì)胞分選介 質(zhì)相連接。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的分選系統(tǒng)，其特征在于，所述的第一單鏈核苷酸或第二單鏈 核苷酸的長度為6bp-lkb。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的分選系統(tǒng)，其特征在于，所述的細(xì)胞分選介質(zhì)為磁珠、分離柱 或聚陽離子納米顆粒。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的分選系統(tǒng)，其特征在于，所述的第一單鏈核苷酸被巰基修飾， 所述的第二單鏈核苷酸被生物素修飾，所述的抗體被順丁烯二酰亞胺修飾，所述的磁珠被 鏈霉親和素修飾。
5. -種從細(xì)胞樣品中分選目的細(xì)胞的方法，其特征在于，所述的方法包括以下步驟： a) 合成互補(bǔ)的單鏈核苷酸，制備"磁珠/單鏈核苷酸"和"抗體/單鏈核苷酸"復(fù)合物； b) 在細(xì)胞樣品中加入"抗體/單鏈核苷酸"復(fù)合物，形成"單鏈核苷酸/抗體/細(xì)胞" 復(fù)合物； c) 將"磁珠/單鏈核苷酸"復(fù)合物加入到"單鏈核苷酸/抗體/細(xì)胞"復(fù)合物中，形成 "磁珠/雙鏈核苷酸/抗體/細(xì)胞"復(fù)合物； d) 通過外加磁場的作用，磁性吸附目的細(xì)胞，去除非目的細(xì)胞； e) 針對不同的目的細(xì)胞，每次使用不同的限制性內(nèi)切酶剪切含有特定識別序列的雙鏈 核苷酸，逐次洗脫不同的目的細(xì)胞。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，步驟b)中細(xì)胞樣品的體積、細(xì)胞樣品 中目的細(xì)胞個(gè)數(shù)、目的細(xì)胞對應(yīng)的抗體質(zhì)量的比例為：lmL細(xì)胞樣品：106-109個(gè)目的細(xì) 胞：5-100 y g目的細(xì)胞對應(yīng)的抗體；步驟c)中所述的"單鏈核苷酸/抗體/細(xì)胞"復(fù)合物 與"磁珠/單鏈核苷酸"復(fù)合物的個(gè)數(shù)比為1:5-1:100。
7. -種分選DC細(xì)胞、NK細(xì)胞和CIK細(xì)胞的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒包含以 下組分：巰基與生物素修飾的三對單鏈核苷酸，⑶3、⑶56和HLA-DR抗體，鏈霉親和素磁珠， 限制性內(nèi)切酶 BamH I、EcoR I、Hind III。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征在于，所述的三對單鏈核苷酸的序列分別如 SEQ ID NO. 1-SEQ ID NO. 6 所示。
9. 一種從細(xì)胞樣品中分選DC細(xì)胞、NK細(xì)胞和CIK細(xì)胞的方法，其特征在于，它包括以 下步驟： a) 合成三對互補(bǔ)的單鏈核苷酸，制備三種"磁珠/單鏈核苷酸"和三種"抗體/單鏈核 苷酸"復(fù)合物，所述的抗體分別為CD3、CD56和HLA-DR抗體，所述的三對單鏈核苷酸片段的 序列分別如SEQ ID NO. 1-SEQ ID NO. 6所示； b) 在細(xì)胞樣品中加入三種"抗體/單鏈核苷酸"復(fù)合物，形成"單鏈核苷酸/抗體/細(xì) 胞"復(fù)合物； c) 將三種"磁珠/單鏈核苷酸"復(fù)合物加入到"單鏈核苷酸/抗體/細(xì)胞"復(fù)合物中， 形成"磁珠/雙鏈核苷酸/抗體/細(xì)胞"復(fù)合物； d) 通過外加磁場的作用，分離獲得與磁珠結(jié)合的細(xì)胞； e) 針對不同的目的細(xì)胞，分別使用限制性內(nèi)切酶BamH I、EcoR I、Hind III逐次洗脫。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，步驟b)中細(xì)胞樣品的體積、細(xì)胞樣品 中目的細(xì)胞個(gè)數(shù)、目的細(xì)胞對應(yīng)的抗體質(zhì)量的比例為：lmL細(xì)胞樣品：106-109個(gè)目的細(xì) 胞：5-100 y g目的細(xì)胞對應(yīng)的抗體，步驟c)中所述的"單鏈核苷酸/抗體/細(xì)胞"復(fù)合物 與"磁珠/單鏈核苷酸"復(fù)合物的個(gè)數(shù)比為1:5-1:100。
【文檔編號】C12Q1/34GK104498595SQ201410735762
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2014年12月5日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月5日
【發(fā)明者】藍(lán)田, J·蓋茨, 鄭敦武 申請人:賽業(yè)（蘇州）生物科技有限公司