一種高穩(wěn)定性的肌酸激酶檢測(cè)試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及體外診斷生化試劑領(lǐng)域，特別是涉及一種高穩(wěn)定性的肌酸激酶檢測(cè)試劑盒。本發(fā)明提供一種高穩(wěn)定性的肌酸激酶檢測(cè)試劑盒，由彼此獨(dú)立的試劑R1和試劑R2組成；其中試劑R1的組分包括：生物緩沖液、酶保護(hù)劑、反應(yīng)底物、絡(luò)合物、表面活性劑、防腐劑、激活劑；試劑R2的組分包括：生物緩沖液、反應(yīng)底物、防腐劑，所述試劑R1和試劑R2的體積比為4:1。本發(fā)明所提供的檢測(cè)試劑盒加入酶保護(hù)劑后，可以在提高試劑穩(wěn)定劑的前提下，選用酶保護(hù)劑來保護(hù)酶還有以下優(yōu)點(diǎn)、通過加入酶保護(hù)劑后，酶在水溶液中能夠保持較長時(shí)間穩(wěn)定，且對(duì)酶本身的活性無影響。
【專利說明】一種高穩(wěn)定性的肌酸激酶檢測(cè)試劑盒

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及體外診斷生化試劑領(lǐng)域，特別是涉及一種高穩(wěn)定性的肌酸激酶檢測(cè)試 劑盒。

【背景技術(shù)】
[0002] 肌酸激酶（CreatineKinase，CK)通常存在于動(dòng)物的心臟、肌肉以及腦等組織的細(xì) 胞漿及線粒體中，是一個(gè)與細(xì)胞內(nèi)能量運(yùn)轉(zhuǎn)、肌肉收縮、ATP再生有直接關(guān)系的重要激酶，它 可逆的催化肌酸與ATP之間的轉(zhuǎn)磷?；磻?yīng)。肌酸激酶有四種同工酶形式：肌肉型（MM)、腦 型（BB)、雜化型（MB)和線粒體型（MiMi)。MM型主要存在于各種肌肉細(xì)胞中，BB型主要存 在于腦細(xì)胞中，MB型主要存在于心肌細(xì)胞中，MiMi型主要存在于心肌和骨骼肌線粒體中。
[0003] 肌酸激酶在臨床上的測(cè)定指的是總CK活性，主要用于診斷心肌梗塞。心肌梗塞患 者發(fā)病后2-4小時(shí)，血液中肌酸激酶的活動(dòng)即開始增高。相比血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶和乳酸脫 氫酶的活力變化出現(xiàn)得更早。相比常用的谷草轉(zhuǎn)氨酶和乳酸脫氫酶，有以下優(yōu)點(diǎn)：肌酸激 酶升高迅速，患者疼痛出現(xiàn)后4小時(shí)肌酸激酶急劇上升，最高可達(dá)正常上限的10-12倍，是 目前最敏感的酶試驗(yàn)。因肝中肌酸激酶含量很少，心臟疾病伴有肝郁血或肝損傷時(shí)，谷丙轉(zhuǎn) 氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶和乳酸脫氫酶活力升高而肌酸激酶無變化，具有較強(qiáng)的特異性。此外，紅 細(xì)胞中此酶活力較低，溶血標(biāo)本對(duì)此酶測(cè)定的干擾較谷草轉(zhuǎn)氨酶和乳酸脫氫酶小，成為臨 床化學(xué)方面常用酶之一。在心肌梗死的病程中，如肌酸激酶活力再次升高，即說明心肌再梗 死。但此酶活力持續(xù)時(shí)間較短，2-4天后即恢復(fù)正常水平。故用此酶診斷心肌梗死，因特別 注意病程時(shí)間。對(duì)于發(fā)病時(shí)間較長的病例，應(yīng)測(cè)定能維持較長時(shí)間持續(xù)升高的酶活力的乳 酸脫氫酶，此時(shí)肌酸激酶活性正常并不能否定心肌梗死診斷。
[0004] 肌酸激酶還可用于肌肉疾病的診斷。在Duchenne肌萎縮患者血中，肌酸激酶極度 增高，甚至可高出正常上限的50倍，后隨病程延長下降。此病是和性染色體有關(guān)的遺傳病， 在無癥狀的女性，隱性攜帶者約75%肌酸激酶也高于正常。其他內(nèi)型的原發(fā)性肌萎縮患者 肌酸激酶也有不同程度的升高，這可用于區(qū)別繼發(fā)性肌病如神經(jīng)性或廢用性肌萎縮，此時(shí) 肌酸激酶活力往往正常。此外，肌酸激酶還可用于腦肌病的診斷。高肌酸激酶活力常見于 發(fā)作性癲癇、破傷風(fēng)。肌酸激酶增高也見于器質(zhì)性神經(jīng)肌病，如腦梗死、腦膜炎和腦炎等。
[0005]目前，肌酸激酶目前已有多種定性和定量的檢測(cè)方法可用?，F(xiàn)有檢測(cè)方法包含電 泳法、化學(xué)發(fā)光法、酶法等。而電泳法存在靈敏度不夠，操作時(shí)間長，且操作繁瑣等缺點(diǎn)，化 學(xué)發(fā)光法雖具有高靈敏性，但其重復(fù)性差也阻礙了其大量適用于臨床，而酶法具有酶活性 高，檢測(cè)靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)，但也存在酶在緩沖液中易失活的缺點(diǎn)。
[0006] 本專利的方法學(xué)為酶法，其基本原理是肌酸激酶（CK)催化磷酸肌酸轉(zhuǎn)變成肌酸， 同時(shí)ADP磷酸化成ATP。己糖激酶（HK)催化ATP和葡萄糖反應(yīng)，生成葡萄糖-6-磷酸。葡 萄糖-6-磷酸脫氫酶（G6PD)催化葡萄糖-6-磷酸生成磷酸葡萄糖酸，同時(shí)使氧化性煙酰胺 腺嘌呤二核苷酸磷酸（NAD+)轉(zhuǎn)變成還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷（NADH)，酶反應(yīng)速度 與樣本中肌酸激酶的活力成正比。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 鑒于以上所述現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，本發(fā)明的目的在于提供一種高穩(wěn)定性的肌酸激酶 檢測(cè)試劑盒，用于解決現(xiàn)有技術(shù)中的問題。
[0008] 為實(shí)現(xiàn)上述目的及其他相關(guān)目的，本發(fā)明提供一種高穩(wěn)定性的肌酸激酶檢測(cè)試劑 盒，由彼此獨(dú)立的試劑Rl和試劑R2組成；其中試劑Rl的組分包括：生物緩沖液、酶保護(hù)劑、 反應(yīng)底物、絡(luò)合物、表面活性劑、防腐劑、激活劑；試劑R2的組分包括：生物緩沖液、反應(yīng)底 物、防腐劑。
[0009] 優(yōu)選地，所述試劑Rl和試劑R2的體積比為4:1。
[0010] 優(yōu)選的，所述試劑Rl中的生物緩沖液為添加有5wt%牛血清白蛋白、AEP-HBCJg肪醇聚氧乙烯醚硫酸鈉的緩沖液。
[0011] 更優(yōu)選的，所述緩沖液為咪唑醋酸鹽緩沖液、Bis-Tris緩沖液、Good'生物緩沖液 中的一種。
[0012]優(yōu)選的，所述試劑R2中的生物緩沖液為咪唑醋酸鹽緩沖液、Bis-Tris緩沖液、Good'生物緩沖液的一種。
[0013] 更優(yōu)選的，所述生物緩沖液為咪唑醋酸緩沖液。
[0014] 上述技術(shù)方案中緩沖液的主要作用，使各個(gè)組分的性能保持穩(wěn)定。其中緩沖液的 加入量、pH值保持在一個(gè)適中的范圍，使各組份的酸堿度保持穩(wěn)定，不會(huì)對(duì)其他物質(zhì)的性能 產(chǎn)生影響，從而保證試劑盒整體性能的穩(wěn)定，使測(cè)試結(jié)果更準(zhǔn)確。
[0015] 優(yōu)選的，所述表面活性劑為吐溫系列、聚乙二醇，屬于非離子表面活性劑，易溶于 水，具有發(fā)泡、穩(wěn)泡、滲透去污、抗硬水等功能，并且在一定濃度下能完全溶解于不同種類的 表面活性劑中，增稠效果明顯，能防止水溶液游離氧的作用，在一定程度上提高試劑的穩(wěn)定 性。
[0016] 優(yōu)選的，所述Rl試劑中反應(yīng)底物為ADP、D-葡萄糖和NAD+。
[0017] 所述試劑R2中的反應(yīng)底物與試劑Rl中的反應(yīng)底物相對(duì)應(yīng)，可以為磷酸肌酸。
[0018] 優(yōu)選的，所述Rl試劑中還包括催化酶，所用催化酶為己糖激酶和葡萄糖-6-磷酸 脫氫酶。
[0019] 優(yōu)選的，所述Rl試劑中激活劑為N-乙酰半胱氨酸或硫代甘油。
[0020] 更優(yōu)選的，所述Rl試劑中激活劑為N-乙酰半胱氨酸，其激活效應(yīng)更強(qiáng)。
[0021 ] 優(yōu)選的，所述Rl試劑中絡(luò)合物為金屬離子絡(luò)合物，具體為乙二胺四乙酸二鈉、氨 基三乙酸、二亞乙基三胺五乙酸中的一種或幾種。
[0022] 更優(yōu)選的，所述Rl試劑中金屬離子絡(luò)合物為乙二胺四乙酸二鈉，其原因是乙二胺 四乙酸二鈉具有廣泛的配位性能，幾乎能與所有的金屬離子形成穩(wěn)定的螯合物。
[0023] 優(yōu)選的，所述防腐劑為疊氮鈉、硫柳汞、Pr〇Clin300中的一種。
[0024]更優(yōu)選的，所述防腐劑為疊氮鈉，其原因是疊氮鈉具有優(yōu)良的防腐殺菌性能，能較 長時(shí)間抑制細(xì)菌的增生。
[0025] 優(yōu)選的，所述Rl試劑中還包括Mg+，所述Mg+可以為醋酸鎂、氯化鎂，硫酸鎂等，但 由于緩沖液中含有醋酸離子，為避免引入其他離子會(huì)影響反應(yīng)結(jié)果，優(yōu)選醋酸鎂。
[0026] 本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)所述肌酸激酶檢測(cè)試劑盒中的各組分，以常規(guī)檢測(cè)試劑盒 的制備方法制備本發(fā)明的肌酸激酶檢測(cè)試劑盒。
[0027] 本發(fā)明第二方面提供一種提高肌酸激酶檢測(cè)試劑盒穩(wěn)定性的方法，具體為在肌酸 激酶檢測(cè)試劑盒的試劑中添加酶保護(hù)劑。
[0028] 優(yōu)選的，所述肌酸激酶檢測(cè)試劑盒，由彼此獨(dú)立的試劑Rl和試劑R2組成；其中試 劑Rl的組分包括：生物緩沖液、酶保護(hù)劑、反應(yīng)底物、絡(luò)合物、表面活性劑、防腐劑、激活劑； 試劑R2的組分包括：生物緩沖液、反應(yīng)底物、防腐劑。
[0029] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具如下明顯效果：
[0030] 加入酶保護(hù)劑后，可以在提高試劑穩(wěn)定劑的前提下，選用酶保護(hù)劑來保護(hù)酶還有 以下優(yōu)點(diǎn)。
[0031] 1、通過加入酶保護(hù)劑后，酶在水溶液中能夠保持較長時(shí)間穩(wěn)定，且對(duì)酶本身的活 性無影響。
[0032] 2、與其他保護(hù)酶的方法相比，可用于保護(hù)酶的緩沖液濃度范圍廣。
[0033] 3、對(duì)臨床常用的酶有廣泛的保護(hù)作用，且保護(hù)時(shí)間長，從而增加試劑的穩(wěn)定性。
[0034] 4、加入酶保護(hù)劑對(duì)酶本身的活性無影響，能夠更加準(zhǔn)確的測(cè)定酶活性。
[0035] 5、加入的酶保護(hù)劑可能還會(huì)對(duì)HPR標(biāo)記的抗原和部分抗體有保護(hù)作用。

【具體實(shí)施方式】
[0036] 以下由特定的具體實(shí)施例說明本發(fā)明的實(shí)施方式，熟悉此技術(shù)的人士可由本說明 書所揭露的內(nèi)容輕易地了解本發(fā)明的其他優(yōu)點(diǎn)及功效。
[0037] 以下通過特定的具體實(shí)例說明本發(fā)明的實(shí)施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員可由本說明書 所揭露的內(nèi)容輕易地了解本發(fā)明的其他優(yōu)點(diǎn)與功效。本發(fā)明還可以通過另外不同的具體實(shí) 施方式加以實(shí)施或應(yīng)用，本說明書中的各項(xiàng)細(xì)節(jié)也可以基于不同觀點(diǎn)與應(yīng)用，在沒有背離 本發(fā)明的精神下進(jìn)行各種修飾或改變。
[0038] 在進(jìn)一步描述本發(fā)明【具體實(shí)施方式】之前，應(yīng)理解，本發(fā)明的保護(hù)范圍不局限于下 述特定的具體實(shí)施方案；還應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明實(shí)施例中使用的術(shù)語是為了描述特定的具體 實(shí)施方案，而不是為了限制本發(fā)明的保護(hù)范圍；在本發(fā)明說明書和權(quán)利要求書中，除非文中 另外明確指出，單數(shù)形式"一個(gè)"、"一"和"這個(gè)"包括復(fù)數(shù)形式。
[0039] 當(dāng)實(shí)施例給出數(shù)值范圍時(shí)，應(yīng)理解，除非本發(fā)明另有說明，每個(gè)數(shù)值范圍的兩個(gè)端 點(diǎn)以及兩個(gè)端點(diǎn)之間任何一個(gè)數(shù)值均可選用。除非另外定義，本發(fā)明中使用的所有技術(shù)和 科學(xué)術(shù)語與本【技術(shù)領(lǐng)域】技術(shù)人員通常理解的意義相同。除實(shí)施例中使用的具體方法、設(shè)備、 材料外，根據(jù)本【技術(shù)領(lǐng)域】的技術(shù)人員對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的掌握及本發(fā)明的記載，還可以使用與本 發(fā)明實(shí)施例中所述的方法、設(shè)備、材料相似或等同的現(xiàn)有技術(shù)的任何方法、設(shè)備和材料來實(shí) 現(xiàn)本發(fā)明。
[0040] 除非另外說明，本發(fā)明中所公開的實(shí)驗(yàn)方法、檢測(cè)方法、制備方法均采用本技術(shù) 領(lǐng)域常規(guī)的分子生物學(xué)、生物化學(xué)、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和分析、分析化學(xué)、細(xì)胞培養(yǎng)、重組DNA技 術(shù)及相關(guān)領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)。這些技術(shù)在現(xiàn)有文獻(xiàn)中已有完善說明，具體可參見Sambrook 等MOLECULARCLONING:ALABORATORYMANUAL，Secondedition，ColdSpringHarbor LaboratoryPress,1989andThirdedition,2001;Ausubel等，CURRENTPROTOCOLSIN MOLECULARBI0L0GY,JohnWiley&Sons,NewYork,1987andperiodicupdates；theseries METHODSINENZYMOLOGY,AcademicPress,SanDiego；ffolffe,CHROMATINSTRUCTUREAND FUNCTION,Thirdedition,AcademicPress,SanDiego, 1998 ；METH0DSINENZYMOLOGY, Vol. 304,Chromatin(P.M.WassarmanandA.P.ffolffe,eds.),AcademicPress,SanDiego, 1999 ;和METHODSINMOLECULARBIOLOGY,Vol. 119,ChromatinProtocols(P.B.Becker, ed.)HumanaPress，Totowa，1999 等。
[0041] 實(shí)施例
[0042] 本發(fā)明肌酸激酶檢測(cè)試劑盒的制備：
[0043] 其中試劑Rl的組分為：50mM咪唑醋酸緩沖液pH7. 4,緩沖液中，其他各組分的含量 為：NAD+2mmol/L、ADP2mmol/L、D_ 葡萄糖 20mmol/L、乙二胺四乙酸二納 2mmol/L、聚乙二醇 2g/L、疊氮鈉lg/L、N-乙酰半胱氨酸20mmol/L;5wt%牛血清白蛋白濃度3g/L，AEP-HBC5g/ L，脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸鈉3g/L;
[0044] 試劑R2的組分為：50mM咪唑醋酸緩沖液pH7. 4,緩沖液中，其他各組分的含量為： 磷酸肌酸30mmol/L、疊氮鈉lg/L。
[0045] 對(duì)比例1肌酸激酶檢測(cè)試劑盒的制備：
[0046] 其中試劑Rl的組分為：50mM咪唑醋酸緩沖液pH7. 4、緩沖液中，其他各組分的含量 為：NAD+2mmol/L、ADP2mmol/L、D_ 葡萄糖 20mmol/L、乙二胺四乙酸二納 2mmol/L、聚乙二醇 2g/L、疊氮鈉lg/L、N-乙酰半胱氨酸20mmol/L;5wt%牛血清白蛋白濃度llg/L;
[0047] 試劑R2的組分為：50mM咪唑醋酸緩沖液pH7. 4,緩沖液中，其他各組分的含量為： 磷酸肌酸30mmol/L、疊氮鈉lg/L。
[0048] 對(duì)比例2肌酸激酶檢測(cè)試劑盒的制備：
[0049] 其中試劑Rl的組分為：50mM咪唑醋酸緩沖液pH7. 4、緩沖液中，其他各組分的含量 為：NAD+2mmol/L、ADP2mmol/L、D_ 葡萄糖 20mmol/L、乙二胺四乙酸二納 2mmol/L、聚乙二醇 2g/L、疊氮鈉lg/L、N-乙酰半胱氨酸20mmol/L;脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸鈉llg/L;
[0050] 試劑R2的組分為：50mM咪唑醋酸緩沖液pH7. 4,緩沖液中，其他各組分的含量為： 磷酸肌酸30mmol/L、疊氮鈉lg/L。
[0051] 對(duì)比例3肌酸激酶檢測(cè)試劑盒的制備：
[0052] 其中試劑Rl的組分為：50mM咪唑醋酸緩沖液pH7. 4、緩沖液中，其他各組分的含量 為：NAD+2mmol/L、ADP2mmol/L、D_ 葡萄糖 20mmol/L、乙二胺四乙酸二納 2mmol/L、聚乙二醇 2g/L、疊氮鈉lg/L、N-乙酰半胱氨酸 20mmol/L;AEP-HBCllg/L;
[0053] 試劑R2的組分為：50mM咪唑醋酸緩沖液pH7. 4,緩沖液中，其他各組分的含量為： 磷酸肌酸30mmol/L、疊氮鈉lg/L。
[0054] 將本發(fā)明肌酸激酶檢測(cè)試劑盒與對(duì)比例進(jìn)行肌酸激酶的活性對(duì)比實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)加入 酶保護(hù)劑后，可以在提高試劑穩(wěn)定劑，選用酶保護(hù)劑來保護(hù)酶可以使酶在水溶液中能夠保 持較長時(shí)間穩(wěn)定，且對(duì)酶本身的活性無影響。具體結(jié)果如表1所示：
[0055]表1
[0056]

【權(quán)利要求】
1. 一種高穩(wěn)定性的肌酸激酶檢測(cè)試劑盒，由彼此獨(dú)立的試劑R1和試劑R2組成；其中 試劑R1的組分包括：生物緩沖液、反應(yīng)底物、絡(luò)合物、表面活性劑、防腐劑、激活劑；試劑R2 的組分包括：生物緩沖液、反應(yīng)底物、防腐劑，所述試劑R1和試劑R2的體積比為4:1。
2. 如權(quán)利要求1所述的一種高穩(wěn)定性的肌酸激酶檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述試劑 R1中的生物緩沖液為添加有5wt%牛血清白蛋白、AEP-HBC、脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸鈉的緩 沖液。
3. 如權(quán)利要求2所述的一種高穩(wěn)定性的肌酸激酶檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述緩沖 液為咪唑醋酸鹽緩沖液、Bis-Tris緩沖液、Good'生物緩沖液中的一種。
4. 如權(quán)利要求1所述的一種高穩(wěn)定性的肌酸激酶檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述表面 活性劑為吐溫系列、聚乙二醇，屬于非離子表面活性劑。
5. 如權(quán)利要求1所述的一種高穩(wěn)定性的肌酸激酶檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述R1試 劑中反應(yīng)底物為ADP、D-葡萄糖和NAD+。
6. 如權(quán)利要求1所述的一種高穩(wěn)定性的肌酸激酶檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述R1試 劑中還包括催化酶，所用催化酶為己糖激酶和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶。
7. 如權(quán)利要求1所述的一種高穩(wěn)定性的肌酸激酶檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述R1試 劑中激活劑為N-乙酰半胱氨酸或硫代甘油，所述R1試劑中絡(luò)合物為金屬離子絡(luò)合物，具體 為乙二胺四乙酸二鈉、氨基三乙酸、二亞乙基三胺五乙酸中的一種或幾種。
8. 如權(quán)利要求1所述的一種高穩(wěn)定性的肌酸激酶檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述防腐 劑為疊氮鈉、硫柳汞、ProClin300中的一種，所述R1試劑中還包括Mg+，所述Mg+可以為醋 酸鎂、氯化鎂，硫酸鎂。
9. 一種提高肌酸激酶檢測(cè)試劑盒穩(wěn)定性的方法，具體為在肌酸激酶檢測(cè)試劑盒的試劑 中添加酶保護(hù)劑。
10. 如權(quán)利要求9所述的一種提高肌酸激酶檢測(cè)試劑盒穩(wěn)定性的方法，其特征在于，所 述肌酸激酶檢測(cè)試劑盒，由彼此獨(dú)立的試劑R1和試劑R2組成；其中試劑R1的組分包括：生 物緩沖液、酶保護(hù)劑、反應(yīng)底物、絡(luò)合物、表面活性劑、防腐劑、激活劑；試劑R2的組分包括： 生物緩沖液、反應(yīng)底物、防腐劑，所述試劑R1和試劑R2的體積比為4:1。
【文檔編號(hào)】C12Q1/48GK104357544SQ201410736402
【公開日】2015年2月18日 申請(qǐng)日期:2014年12月5日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月5日
【發(fā)明者】余英 申請(qǐng)人:重慶中元生物技術(shù)有限公司