芫荽花對(duì)稱性基因CsCYC2及其植物表達(dá)載體和構(gòu)建方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，公開(kāi)了芫荽花對(duì)稱性新基因 CsCYC2 及其表達(dá)載體和構(gòu)建方法。芫荽花對(duì)稱性基因 CsCYC2 ，序列為SEQ ID NO.1，本發(fā)明所構(gòu)建的表達(dá)載體為pCAMBIA 1300s- CsCYC2 是由 CsCYC2 基因連接到線性化的pCAMBIA 1300s質(zhì)粒而得到的。將該植物表達(dá)載體用于植物遺傳轉(zhuǎn)化， CsCYC2 基因在CaMV35S啟動(dòng)子的驅(qū)動(dòng)下超量表達(dá)大量CYC2蛋白，調(diào)控下游基因的表達(dá)，使擬南芥花型改變，花對(duì)稱性改變。
【專利說(shuō)明】芫荽花對(duì)稱性基因CsCYC2及其植物表達(dá)載體和構(gòu)建方法
一、【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，公開(kāi)了芫荽花對(duì)稱性新基因CSCYC2及其表達(dá)載體和構(gòu)建方法。

二、【背景技術(shù)】
[0002]被子植物的花不對(duì)稱性是由多個(gè)基因所共同控制的，其中控制花背腹不對(duì)稱性的為TCP轉(zhuǎn)錄因子的CYC類基因，其功能在被子植物中是相對(duì)保守的。有趣的是所有分離到的控制花背部屬性的TCP基因都屬于CYC2類基因。因此，該研究表明了廣義CYC類基因與核心真雙子葉植物的形態(tài)建成關(guān)系密切。
[0003]而傘形科植物屬于薔薇亞綱，它具有典型的傘形花序，而在一個(gè)小傘形花序中，處于中央位置的小花和邊緣小花的對(duì)稱性又有所不同，分別為輻射對(duì)稱花和兩側(cè)對(duì)稱花，中間還存在過(guò)渡類型的小花，這為花對(duì)稱性的研究提供了獨(dú)特的材料。本項(xiàng)目選用一種代表性的傘形科植物-芫荽作為研究對(duì)象，采用RACE-PCR技術(shù)分離控制芫荽花不對(duì)稱性的CYC類基因，然后利用轉(zhuǎn)基因等技術(shù)，研究CYC類基因的表達(dá)和功能分化，為闡明傘形科植物花不對(duì)稱性的分子機(jī)制提供依據(jù)，并對(duì)花不對(duì)稱性基因在不同亞綱的花序類群中可能存在的功能分化進(jìn)行初步探討。
[0004]在作物的遺傳轉(zhuǎn)化途徑中，農(nóng)桿菌介導(dǎo)法是應(yīng)用最為廣泛的方法之一，其中有效的植物表達(dá)載體至關(guān)重要。將控制花發(fā)育的基因構(gòu)建植物表達(dá)載體，用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物遺傳轉(zhuǎn)化，使該轉(zhuǎn)錄因子在CaMV35S啟動(dòng)子的啟動(dòng)下超量表達(dá)，并調(diào)控下游目的基因的表達(dá)，改變植物形態(tài)建成，具有重要意義。

三、
【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]技術(shù)問(wèn)題
[0006]本發(fā)明的目的在于為改良植物花不對(duì)稱性性，提供一個(gè)芫荽花不對(duì)稱性發(fā)育基因CsCYC2，該基因的序列為SEQ ID N0.1。
[0007]本發(fā)明的另一目的在于提供完萎花不對(duì)稱性發(fā)育基因CsCYC2的植物表達(dá)載體。
[0008]本發(fā)明的又一目的在于提供芫荽花不對(duì)稱性發(fā)育基因CsCYC2植物表達(dá)載體的構(gòu)建方法。所構(gòu)建的植物表達(dá)載體可直接用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的作物遺傳轉(zhuǎn)化，創(chuàng)制新花型、新種質(zhì)，可用于植物品種改良。
[0009]技術(shù)方案
[0010]本發(fā)明的目的可以通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
[0011]芫荽花不對(duì)稱性發(fā)育基因CsCYC2，該基因的序列為SEQ ID N0.1。所述基因可直接用于植物品種改良，創(chuàng)制新花型、新種質(zhì)。
[0012]芫荽(Coriandrum satium L.)花對(duì)稱性基因CsCYC2，該基因的序列為SEQ IDN0.1。
[0013]所述芫荽花對(duì)稱性基因CsCYC2的應(yīng)用，可直接用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化，改變植物花對(duì)稱性。
[0014]所述芫荽花對(duì)稱性基因CsCYC2的重組質(zhì)粒，其特征在于，由所述的芫荽花對(duì)稱性基因 CsCYC2 與 pMD18-T Vector 重組構(gòu)成的 pMD18_T Vector_CsCYC2 重組質(zhì)粒。
[0015]所述芫荽花對(duì)稱性基因CsCYC2的植物表達(dá)載體，為所述的芫荽花對(duì)稱性基因CsCYC2與pMD18-T Vector重組構(gòu)成的pMD18_T Vector_CsCYC2重組質(zhì)粒雙酶切后連接到線性化的pCAMBIA 1300s質(zhì)粒而得到的。
[0016]芫荽花不對(duì)稱性發(fā)育基因CsCYC2植物表達(dá)載體的構(gòu)建方法，包括如下步驟:
[0017]1、芫荽花對(duì)稱性基因CsCYC2序列的克隆
[0018]以芫荽小花蕾為材料，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，設(shè)計(jì)上游引物CsCYC2F，終止密碼子處設(shè)計(jì)下游引物CsCYC2R ;利用以上設(shè)計(jì)的引物，從cDNA中擴(kuò)增得到CsCYC2基因開(kāi)放閱讀框0RF，基因序列為SEQ ID N0.1 ；
[0019]上游引物CsCYC2F:SEQ ID N0.10
[0020]下游引物CsCYC2R:SEQ ID N0.11
[0021]2、植物表達(dá)載體pCAMBIA 1300s_CsCYC2的構(gòu)建
[0022]將CsCYC2基因連接到pMD18-T Vector載體中，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌T0P10菌株中，從T0P10菌株中提取pMD18-T Vector_CsCYC2重組質(zhì)粒，BamHI和SalI雙酶切后回收CsCYC2基因片段，同時(shí)將pCAMBIA 1300s雙元載體質(zhì)粒利用BamHI和SalI雙酶切線性化，利用T4連接酶同回收的CsCYC2基因片段進(jìn)行連接，然后轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞，提取陽(yáng)性質(zhì)粒，測(cè)序驗(yàn)證，植物表達(dá)載體pCAMBIA 1300s-CsCYC2構(gòu)建成功。
[0023]將CsCYC2基因的植物表達(dá)載體用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物遺傳轉(zhuǎn)化,方法如下:(I)農(nóng)桿菌菌株感受態(tài)制備及凍融法轉(zhuǎn)化；(2)擬南芥花序浸染及種子篩選；(3) PCR鑒定及植物形態(tài)觀察。
[0024]有益效果
[0025]1、本發(fā)明提供的芫荽花不對(duì)稱性發(fā)育基因CsCYC2是一個(gè)新的花發(fā)育基因，該基因可調(diào)控植物開(kāi)花和花器官發(fā)育。
[0026]2、本發(fā)明構(gòu)建的芫荽花不對(duì)稱性發(fā)育基因CsCYC2植物表達(dá)載體為首次報(bào)道，可直接用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化，改變植物花對(duì)稱性。

四、【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
:
[0027]圖1:CsCYC2基因瓊脂糖凝膠電泳分析:
[0028]M=DNAMarker(2kb/lkb/0.75kb/0.5kb/0.25kb/0.1kb)
[0029]I:CsCYC2 基因的 3’ RACE 擴(kuò)增；
[0030]2:CsCYC2基因的5’末端序列擴(kuò)增；
[0031]3:CsCYC2基因的序列開(kāi)放閱讀框擴(kuò)增；
[0032]4:pMD 18-T Vector_CsCYC2 質(zhì)粒 Sail 和 BamH I 雙酶切；
[0033]圖2植物表達(dá)載體pCAMBIA 1300s_CsCYC2的構(gòu)建過(guò)程示意圖。
[0034]圖3野生型與轉(zhuǎn)基因擬南芥PCR鑒定。
[0035]圖4植物表達(dá)載體pCAMBIA 1300s_CsCYC2導(dǎo)致擬南芥植株分蘗增多。。
[0036]圖5植物表達(dá)載體pCAMBIA 1300s_CsCYC2導(dǎo)致擬南芥花瓣排列的改變。五、

【具體實(shí)施方式】
[0037]實(shí)施例1植物表達(dá)載體pCAMBIA 1300s_CsCYC2的構(gòu)建
[0038]1、CsCYC2基因部分序列的克隆:
[0039]選用芫荽(Coriandrum satium L.)(種子購(gòu)自南京豐邦種業(yè)有限公司的“豐邦”牌“大葉香菜”)花蕾作為材料，提取花蕾總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa)將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用RNase消化cDNA產(chǎn)物，參照并根據(jù)被子植物其他物種設(shè)計(jì)兼并引物上游引物 CsF: 5 ’ -GGATAGGCACAGCAAGATCAA-3 ’ (SEQ ID N0.2)和下游引物 CsR:5’-TTCCCTTGCTTTCTGTCTAGC-3’ (SEQ ID N0.3)。以花蕾 cDNA 為模板，進(jìn)行 PCR 反應(yīng)，20 μ L反應(yīng)體系組成如下:10 X Taq Buffer 2μ L ；25mmol/L MgCl22 μ L ;2.5mmol/L dNTPs2 μ L ；上下游引物(2mmol/L)各 2μ L，ddH20 9.2 μ L ；cDNA 0.8 μ L ;Taq 酶 0.15 μ L。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)在Long Gene公司生產(chǎn)的MG96G PCR儀中進(jìn)行。擴(kuò)增程序?yàn)?94°C預(yù)變性3min ;然后94°C變性lmin，52°C退火45s，72°C延伸lmin，重復(fù)循環(huán)30次；最后72°C延伸10min，4°C保存。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳后，用Tanon 2500圖像分析儀觀察。反應(yīng)產(chǎn)物采用Axgen膠純化試劑盒進(jìn)行純化，用T4DNA連接酶(TaKaRa)連接到pMD18_T載體(TaKaRa)，轉(zhuǎn)化T0P10感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行序列測(cè)定，在GeneBank中進(jìn)行Blast比對(duì)，挑選出CYC的同源序列CsCYC2基因片段，獲得含有目的CsCYC2基因片段的T-載體質(zhì)粒。
[0040]2、3’ RACE-PCR獲得CsCYC2基因3’端部分序列
[0041 ] 利用步驟I得到的基因序列，以反轉(zhuǎn)錄的cDNA做模板，設(shè)計(jì)上游特異引物 CsCYC2Fl:5’-GAGGCGAATTACCAAAGAA-3’ (SEQ ID N0.4)和上游引物 CsCYC2F2:5’-GTTCGGGCTTGGAATGACC-3’ (SEQ ID N0.5)，下游分別采用 3’ RACE outer primer 和3’RACE innner primer (TakaRa公司試劑盒:D314)作引物，采用巢式PCR，擴(kuò)增得到CsCYC2基因的3’端序列。
[0042]3.利用改良的擴(kuò)增cDNA 5’末端的方法擴(kuò)增得到CsCYC2基因的5’末端序列，獲得CsCYC2序列起始密碼子附近序列
[0043]為了獲得CsCYC2基因的全長(zhǎng)，特別是起始密碼子的部位，然后根據(jù)步驟I和步驟2獲得的序列，設(shè)計(jì)下游引物。首先利用dCTP和末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TDT)對(duì)cDNA進(jìn)行加尾反應(yīng)；然后采用巢式PCR，上游利用5 ’ -AP: 5 ’ -AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGGGGGGGGG-3’ (SEQ ID N0.6)，5’ -NP:5’ -AAGCAGTGGTATCAACGCAG AGT-3’ (SEQIDN0.7)作引物，下游設(shè)計(jì)特異引物 CsCYC2Rl:5’-GGTTCTGGTGTG GGTTTAG-3，(SEQ ID N0.8)和 CsCYC2R2:5’ -ATTGCATTTTTCGCCTTG-3’ (SEQ ID N0.9)，采用巢式 PCR，擴(kuò)增得到 CsCYC2基因的5’端序列。
[0044]4.CsCYC2基因開(kāi)放閱讀框ORF序列的克隆
[0045]利用步驟1-3獲得的CsCYC2基因的部分序列，進(jìn)行拼接，可獲得CsCYC2基因的全長(zhǎng)序列(包含一部分5’和3’非編碼區(qū))；利用獲得的全長(zhǎng)序列，從起始密碼子處設(shè)計(jì)上游引物 CsCYC2F(5’ -CGCGGATCCATGTGTGCAGGAGGAAGC-3’ )，終止密碼子處設(shè)計(jì)下游引物 CsCYC2R(5’ -ACGCGTCGACCTAAAAGTCTGTGAACTG-3’)；利用以上設(shè)計(jì)的引物，從 CDNA 中擴(kuò)增得到CsCYC2基因開(kāi)放閱讀框0RF，基因序列為SEQ ID N0.1。
[0046]5.植物表達(dá)載體pCAMBIA 1300s_CsCYC2的構(gòu)建
[0047]提取含有目的基因CsCYC2的pMD18-T載體質(zhì)粒及表達(dá)載體質(zhì)粒pCAMBIA1300s (公知公用，見(jiàn) Zhou X, Yuan YX, Yang Y.et al.2009.1nvolvement of a BroccoliC0Q5MethyItransferase in the Product1n of Volatile Selenium Compounds.PlantPhys1l, 151:528-540)(是通過(guò)對(duì)載體pCAMBIA 1300改造而來(lái)，質(zhì)粒結(jié)構(gòu)圖如圖2所示)并雙酶切，酶切體系為:10Xbuffer T 7.5ul, Sail 2.0ul, BamHI 2.0ul，質(zhì)粒 DNA30ul，ddH20 8.5ul，37°C酶切5h。將含有CsCYC2基因完整開(kāi)放閱讀框的片段和pCAMBIA 1300s線性化質(zhì)粒片段分別回收，并將兩個(gè)片段連接。連接反應(yīng)體系為:T4Buffer 1.0ul，T4連接酶l.0ul，載體回收液l.0ul，目的基因回收液7.0ul，4°C過(guò)夜連接。將連接好的重組質(zhì)粒pCAMBIA 1300s-CsCYC2轉(zhuǎn)化T0P10細(xì)胞，提取陽(yáng)性質(zhì)粒，酶切電泳檢測(cè)并測(cè)序驗(yàn)證。
[0048]實(shí)施例2植物表達(dá)載體pCAMBIA 1300s-CsCYC2轉(zhuǎn)化擬南芥及花發(fā)育特性觀察
[0049]1、農(nóng)桿菌菌株EHA105感受態(tài)制備及凍融法轉(zhuǎn)化
[0050]從YEP (50mg/L利福平)平板上挑取EHA105單菌落，接種于50mL含50mg/L利福平的YEP液體培養(yǎng)基中，200rpm，28°C培養(yǎng)至OD值0.5，而后冰浴菌液30min，離心收集菌體，懸浮于2mL預(yù)冷的10mM CaCl (20%甘油)溶液中，200uL每管分裝，待用。
[0051]取1uL pCAMBIA 1300s_CsCYC2載體質(zhì)粒，加入200u L感受態(tài)細(xì)胞，冰浴30min，液氮冷凍5min，37°C 5min,加入800uL YEP液體培養(yǎng)基，28 V 200rpm預(yù)培養(yǎng)4h，菌液涂板于YEP (50mg/L利福平+50mg/L卡那霉素)固體培養(yǎng)基上，28°C暗培養(yǎng)2天，挑取單克隆檢測(cè)，選取陽(yáng)性克隆搖菌，用于擬南芥花序轉(zhuǎn)化。
[0052]2、擬南芥花序浸染及種子篩選
[0053]將陽(yáng)性單克隆接到50mL的YEP(50mg/L利福平+50mg/L卡那霉素)液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24小時(shí)，5000rpm離心20分鐘，然后用轉(zhuǎn)化液(1/2MS，添加50克/升的蔗糖，調(diào)pH為
5.8，然后加200uL/L的Silwet L-77混合)劇烈懸浮沉淀至完全懸起。將擬南芥地上部分直接浸泡于上述懸浮液中I分鐘，然后用保鮮膜完全包裹植株以保濕，放回培養(yǎng)室培養(yǎng)12小時(shí)，打開(kāi)保鮮膜，待種子成熟時(shí)米收。
[0054]種子消毒與播種:將野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥種子分別放入1.5mL的離心管中，加入lmL75%酒精搖晃I分鐘，吸取酒精，添加15% (體積比)的次氯酸鈉搖晃10分鐘，然后在超凈臺(tái)中用無(wú)菌水洗6次，而后直接把種子連無(wú)菌水倒在滅菌過(guò)篩選培養(yǎng)基上(l/2MS+30mg/L潮霉素)，吹干后篩造培養(yǎng)10天，然后將抗性苗移栽到土中，用透明的蓋子覆蓋幼苗I周以保濕。
[0055]3、PCR鑒定及植物形態(tài)觀察。
[0056]以經(jīng)抗生素篩選的抗性植株總DNA為模板，以未轉(zhuǎn)基因擬南芥為陰性對(duì)照進(jìn)行PCR反應(yīng)(如圖3)。反應(yīng)體系見(jiàn)實(shí)施例1。
[0057]將鑒定出的轉(zhuǎn)基因T2代種子和野生型擬南芥種子同時(shí)播到栽培基質(zhì)中，人工培養(yǎng)條件為:相對(duì)濕度80%，溫光周期為16h光照，22°C /8h黑暗，18°C，并用體式顯微鏡觀察花器官的變化。轉(zhuǎn)基因苗相比野生型擬南芥，植株葉片數(shù)明顯增多，而且花序分枝數(shù)也有所增加，葉片數(shù)可由10多片增加至20幾片，花序分枝數(shù)也增加I倍左右(圖4);花瓣的排列也發(fā)生了變化，野生型的擬南芥花瓣呈輻射對(duì)稱，而轉(zhuǎn)基因的花瓣卻不再是輻射對(duì)稱，呈現(xiàn)兩側(cè)對(duì)稱花樣式(圖5)。
[0058]綜上所述，本發(fā)明構(gòu)建了含有芫荽花器官發(fā)育基因的植物表達(dá)載體pCAMBIA1300s-CsCYC2，其中CsCYC2基因?yàn)槭状螆?bào)道。所構(gòu)建的植物表達(dá)載體可導(dǎo)入多種植物中，使之分蘗增多并改變植物花的對(duì)稱性。
【權(quán)利要求】
1.芫荽33七1皿11.)花對(duì)稱性基因該基因的序列為3四10 ^0.1。
2.權(quán)利要求1所述芫荽花對(duì)稱性基因06762的應(yīng)用。
3.權(quán)利要求1所述芫荽花對(duì)稱性基因06762的重組質(zhì)粒，其特征在于，由權(quán)利要求1所述的芫荽花對(duì)稱性基因&與1)1018-1 76(^01'重組構(gòu)成的1)1018-1 ^60^01- 080702重組質(zhì)粒。
4.權(quán)利要求1所述芫荽花對(duì)稱性基因0^762的植物表達(dá)載體，其特征在于，所述的植物表達(dá)載體為由權(quán)利要求1所述的芫荽花對(duì)稱性基因。哪2與1)1018-1 ^60^01-重組構(gòu)成的1)1018-1 ^60^01- 06762重組質(zhì)粒雙酶切后連接到線性化的成艦81八13008質(zhì)粒而得到的。
5.權(quán)利要求4所述芫荽花對(duì)稱性基因06762的植物表達(dá)載體的構(gòu)建方法，其特征在于包括如下步驟: 1)芫荽花對(duì)稱性基因0^762序列的克隆 以芫荽小花蕾為材料，提取總I？嫩，反轉(zhuǎn)錄為⑶嫩，設(shè)計(jì)上游引物終止密碼子處設(shè)計(jì)下游引物；利用以上設(shè)計(jì)的引物，從⑶嫩中擴(kuò)增得到6^762基因開(kāi)放閱讀框0咫，基因序列為卿10勵(lì).1； 上游引物卿10勵(lì).10 下游引物卿10勵(lì).11 2)植物表達(dá)載體成艦81八13008-06762的構(gòu)建 將06762基因連接到1)1018-1 ^60^01-載體中，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌10？10菌株中，從丁0？ 10菌株中提取1)1018-1 ^60^01- 06762重組質(zhì)粒，8肅??！1和&111雙酶切后回收。3哪2基因片段，同時(shí)將八13008雙元載體質(zhì)粒利用831^1和&111雙酶切線性化，利用丁4連接酶與回收的0^762基因片段進(jìn)行連接，然后轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞，提取陽(yáng)性質(zhì)粒，測(cè)序驗(yàn)證，植物表達(dá)載體成艦81八13008-067^^1建成功。
【文檔編號(hào)】C12N15/66GK104498489SQ201410738398
【公開(kāi)日】2015年4月8日 申請(qǐng)日期:2014年12月5日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月5日
【發(fā)明者】宋春鳳, 劉啟新, 張所兵 申請(qǐng)人:江蘇省中國(guó)科學(xué)院植物研究所