一種增強(qiáng)mlpa檢測(cè)snp位點(diǎn)的特異性方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種增強(qiáng)ＭＬＰＡ檢測(cè)ＳＮＰ位點(diǎn)的特異性方法，設(shè)計(jì)針對(duì)Ｋｒａｓ基因２１６Ｇ-ＣＳＮＰ位點(diǎn)的ＭＬＰＡ探針，使用ＭＬＰＡ實(shí)驗(yàn)，觀察其對(duì)ＳＮＰ位點(diǎn)檢測(cè)時(shí)的影響,本發(fā)明的核心是在ＳＮＰ位點(diǎn)檢測(cè)特異度時(shí)減少探針在ＳＮＰ位點(diǎn)的錯(cuò)配率，可以使用特定化學(xué)修飾的核苷酸合成探針，本研究發(fā)現(xiàn)使用ＬＮＡ修飾ＭＬＰＡ探針的ＳＮＰ位點(diǎn)后，ＬＮＡ修飾可明顯降低堿基錯(cuò)配率，消除假陽(yáng)性產(chǎn)物峰；但ＬＮＡ修飾探針的檢測(cè)靈敏度有所下降，表現(xiàn)為檢測(cè)陽(yáng)性標(biāo)本時(shí)，與未加修飾的ＭＬＰＡ探針相比，產(chǎn)物峰面積下降ＬＮＡ修飾可能導(dǎo)致探針雜交或連接效率下降，降低了ＭＬＰＡ檢測(cè)的靈敏度。
【專(zhuān)利說(shuō)明】—種增強(qiáng)M LPA檢測(cè)S N P位點(diǎn)的特異性方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種增強(qiáng)M L Ρ Α檢測(cè)S N P位點(diǎn)的特異性方法，屬于基因檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002]單核苷酸多態(tài)性(singlenucleotidepolymorphis m, S NP)是基因組水平上由單個(gè)核苷酸變異引起的D ΝΑ序列多態(tài)性，包括置換、顛倒、缺失和插入，且任一等位基因在人群中的頻率不小于1 %，隨著人類(lèi)基因組計(jì)劃的完成和S Ν Ρ數(shù)據(jù)庫(kù)Η AP MAP的繪制，S N P檢測(cè)在臨床分子診斷、法醫(yī)鑒定、新藥研發(fā)等領(lǐng)域發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用，常見(jiàn)的S NP檢測(cè)方法包括DN A芯片雜交、限制性長(zhǎng)度多態(tài)性(res t r i c t 1nf ragment 1 engthpolymor ph i s m, R F L P)及等位基因特異性 P CRCallelespe cificPCR，A S - P C R)等，但這些方法均無(wú)法同時(shí)滿(mǎn)足高通量、高準(zhǔn)確度和價(jià)格低廉的要求。多重連接依賴(lài)性探針擴(kuò)增(m ultiplexligat1n dependentprobeampl i f i cat i ο η , M L P A)技術(shù)由 Schouten 于 2002年發(fā)明，可同時(shí)檢測(cè)4 0多條目標(biāo)序列的拷貝數(shù)變化，且改進(jìn)后的M L Ρ A技術(shù)還可同時(shí)檢測(cè)RN A、S Ν P位點(diǎn)和甲基化的變化，已在產(chǎn)前、遺傳和腫瘤檢測(cè)等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，雖然M L Ρ A反應(yīng)中的探針連接反應(yīng)只有當(dāng)探針和目標(biāo)序列靶D Ν A完全配對(duì)，且兩條探針之間沒(méi)有空隙的條件下才可能發(fā)生，但由于堿基之間可能出現(xiàn)錯(cuò)配，而S Ν P序列只有一個(gè)堿基的區(qū)別，導(dǎo)致M L Ρ Α檢測(cè)S Ν P時(shí)經(jīng)常由于錯(cuò)配連接而出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果，影響結(jié)果判讀。此類(lèi)由于堿基錯(cuò)配導(dǎo)致的假陽(yáng)性問(wèn)題在A S - PCR中已通過(guò)堿基修飾、添加阻滯探針等方法得到改善，但在M L Ρ Α中尚未得到解決。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的是:提供一種增強(qiáng)M L Ρ Α檢測(cè)S Ν P位點(diǎn)的特異性方法，能快速檢測(cè)S Ν P位點(diǎn)，以克服現(xiàn)有技術(shù)的不足。
[0004]本發(fā)明的技術(shù)方案
一種增強(qiáng)M L Ρ Α檢測(cè)S Ν P位點(diǎn)的特異性方法，設(shè)計(jì)針對(duì)K r a s基因2 1 6 G -C SNP位點(diǎn)的ML PA探針，使用ML PA實(shí)驗(yàn)，觀察其對(duì)SNP位點(diǎn)檢測(cè)時(shí)的影響。
[0005]前述的一種增強(qiáng)M L Ρ Α檢測(cè)S Ν P位點(diǎn)的特異性方法中，直接用鎖核酸修飾ΜLΡΑ探針的S ΝP位點(diǎn)或添加阻滯探針均可顯著提高S Ν P檢測(cè)時(shí)的特異性，3個(gè)L NA修飾的阻滯探針能最好地保證檢測(cè)的靈敏度和特異性
由于采用上述技術(shù)方案，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的核心是在S Ν P位點(diǎn)檢測(cè)特異度時(shí)減少探針在S Ν P位點(diǎn)的錯(cuò)配率，可以使用特定化學(xué)修飾的核苷酸合成探針，包括L N八、肽核酸(卩eptidenu cleicaci d , Ρ Ν A)等,這些化學(xué)修飾能夠顯著降低堿基錯(cuò)配率，L Ν A是一種經(jīng)過(guò)修飾的核酸類(lèi)似物，和普通核酸分子的區(qū)別是碳環(huán)的2’-oxygen和4’- ca rbo n位置上引入了亞甲基橋形成鎖狀結(jié)構(gòu)，因此稱(chēng)為鎖核酸，L Ν Α修飾堿基的配對(duì)特異性高，結(jié)合力強(qiáng)，還可以提高寡核苷酸的解鏈溫度，被廣泛用于DN A芯片，熒光原位雜交和熒光定量P C R中，以提高探針雜交的特異性，本研究發(fā)現(xiàn)使用L Ν A修飾M L Ρ Α探針的S Ν P位點(diǎn)后，與未加修飾的M L Ρ Α探針相t匕，假陽(yáng)性產(chǎn)物峰面積明顯下降(32.9vsl8.4，P<0 01)，Ct值明顯上升(41.0 7 v s 3 4.17，P<0.01)31WL Ν A修飾可明顯降低堿基錯(cuò)配率，消除假陽(yáng)性產(chǎn)物峰HML Ν A修飾探針的檢測(cè)靈敏度有所下降，表現(xiàn)為檢測(cè)陽(yáng)性標(biāo)本時(shí)，與未加修飾的M L Ρ Α探針相比，產(chǎn)物峰面積下降(80.0 2 v s 9 5.0 0 , P< 0.01，Ct值上升(2 5.2 v s 2 4.5 3 , P< 0.Q 1 )，說(shuō)明L Ν Α修飾可能導(dǎo)致探針雜交或連接效率下降，降低了M L Ρ A檢測(cè)的靈敏度。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0006]附圖1為M L Ρ Α探針及阻滯探針序列表；
附圖2為各實(shí)驗(yàn)組探針組成示意圖；
附圖3為各組檢測(cè)探針?lè)迕娣e和C t值比較表；
附圖4為MLΡA產(chǎn)物毛細(xì)電泳結(jié)果示意圖。

【具體實(shí)施方式】
[0007]下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明，但不作為對(duì)本發(fā)明的任何限制。
[0008]本發(fā)明的實(shí)施例:
1材料和方法
1.1 主要試劑和儀器
鎖核酸(1 ockednuc 1 e i c a c i d , L N A)引物及探針由上海輝睿生物科技有限公司合成，質(zhì)粒P c DN A 3 K r a s 2 1 6 G和p c D Ν A 3 Kras2 1 6 C由本室保存，T a q酶(大連寶生物公司)，T 4 - D Ν A連接酶(北京Ν E B公司)，S Y B RG RE EN定量P C RM a s t e rm i x (上海羅氏公司)，測(cè)序儀(美國(guó)A B I 3 7 3 0 )，定量 P C R儀(美國(guó) A B 1 7 5 0 0 )。
[0009]1.2 方法
1.2.1引物
以包含野生型人K r a s基因(r e f I N M_ 0 0 4 9 8 5.3 |)的pcDNA3-K r a s 2 1 6 G質(zhì)粒和包含2 1 6位G - C SNP位點(diǎn)K r a s基因的p c D NA3- K r a s 2 1 6 C質(zhì)粒為模板，設(shè)計(jì)相應(yīng)的M L P A探針序列(附圖1 )。
[0010]1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組
實(shí)驗(yàn)共分為9組，以探討不同優(yōu)化方法對(duì)M LPAS Ν Ρ檢測(cè)結(jié)果的影響(附圖2 )。
[0011]1.2.3 ML Ρ Α實(shí)驗(yàn)流程
(1 )將 5 μ 1 DNAfe^:( 2 0 0 n g )置 P C R儀內(nèi) 9 8 °C變性 5 m i n，然后根據(jù)分組加入1.5 μ 1混合探針(根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組包含不同檢測(cè)探針和阻滯探針，每組均加入pcDNA3-cont r ο 1探針,每對(duì)探針各5 f m ο 1 / L )和1.5 μ 1雜交緩沖液，9 5 °C變性1 m i η后6 0 V雜交1 6 h ; ( 2 )在雜交產(chǎn)物內(nèi)加入d d Η 2 0、TaqDNALi g a s ebuf f e r和lUTaqDNALi g a s e ,調(diào)至 3 Ο μ1反應(yīng)體系，5 4 °C孵育1 5 m i η , 9 5 °C滅活5min;(3)取5μ 1連接產(chǎn)物作為模板進(jìn)行P C R擴(kuò)增，反應(yīng)體系2 Ο μ 1，上游引物Forward為FAM GGTTCCCTAAGGGTTGGA,下游 Re v e r s e為CTAGATTGGATCTTGCTGGCAC,反應(yīng)條件:9 5 °C 預(yù)變性 2min，95°C 3 0 s , 6 0 °C 3 0s,7 2 °C 3 0 s ;共3 3個(gè)循環(huán)，7 2 °C 2 0 m i η, 4 °C保存；(4 )取1 μ 1擴(kuò)增產(chǎn)物，加入 9μ lHiDiformamidehe 和 0.5μ 1ROX500 內(nèi)參，9 5 V 變性5 m i η，冰上放置2min，ABI373Q毛細(xì)電泳儀進(jìn)行片段分離，G e n e Μa ρ ρ e r 4.0軟件分析結(jié)果，計(jì)算各產(chǎn)物峰面積，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
[0012]1.2.4 定量PCR檢測(cè)各組只加檢測(cè)探針和阻滯探針，不加p c DN A3- c ο n t r ο 1內(nèi)參探針，其余雜交和連接反應(yīng)同前，各取2.5 μ 1連接產(chǎn)物作為模板進(jìn)行定量p c R檢測(cè)，引物同前，反應(yīng)體系為2 0 μ 1，反應(yīng)條件為9 5 °C預(yù)變性2 m iη，9 5 °C 1 5 s，6 Q°C 1 m i η ;共5 Q個(gè)循環(huán)，計(jì)算各組C t值。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
[0013]1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
使用S P S S 1 2.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各組毛細(xì)管電泳的峰面積比較及定量P C RC t值比較用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)，P< 0.0 5為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，由儀器自動(dòng)確定檢測(cè)閾值，比較各組C t值大小(附圖3)。
[0014]2 結(jié)果
MLP A毛細(xì)管電泳結(jié)果分析見(jiàn)附圖4。
[0015]以各組中pcDNA3-cont r ο 1探針的平均峰面積為參照進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，比較各組檢測(cè)探針產(chǎn)物的平均峰面積(附圖3 )。
[0016]3 討論
M L Ρ Α作為一種高通量、準(zhǔn)確、廉價(jià)的基因拷貝數(shù)檢測(cè)技術(shù)，對(duì)于一般的基因拷貝數(shù)變化檢測(cè)已十分可靠，但在檢測(cè)S Ν P位點(diǎn)時(shí)卻往往因?yàn)閴A基錯(cuò)配的原因出現(xiàn)假陽(yáng)性產(chǎn)物峰，嚴(yán)重影響結(jié)果判讀。本研究中組2的錯(cuò)配產(chǎn)物峰面積達(dá)到對(duì)照組的1 8.4%，而一般ML ΡA檢測(cè)的基因缺失閾值為1 5 %，可見(jiàn)這種錯(cuò)配產(chǎn)物可嚴(yán)重影響結(jié)果的判讀，必須加以改進(jìn)。
[0017]提高S Ν P位點(diǎn)檢測(cè)特異度的關(guān)鍵在于減少探針在S Ν P位點(diǎn)的錯(cuò)配率，可以使用特定化學(xué)修飾的核苷酸合成探針，包括L Ν A、肽核酸(P eptidenu cleic a c i d，Ρ Ν A)等，這些化學(xué)修飾能夠顯著降低堿基錯(cuò)配率，L Ν A是一種經(jīng)過(guò)修飾的核酸類(lèi)似物，和普通核酸分子的區(qū)別是碳環(huán)的2’-oxygen和4’ - ca rbon位置上引入了亞甲基橋形成鎖狀結(jié)構(gòu)，因此稱(chēng)為鎖核酸，L Ν A修飾堿基的配對(duì)特異性高，結(jié)合力強(qiáng)，還可以提高寡核苷酸的解鏈溫度，被廣泛用于D Ν A芯片，熒光原位雜交和熒光定量P C R中，以提高探針雜交的特異性，本研究發(fā)現(xiàn)使用LN A修飾ML Ρ A探針的SNP位點(diǎn)后，與未加修飾的MLPA探針相比，假陽(yáng)性產(chǎn)物峰面積明顯下降(3 2.9 νs 1 8.4 , Ρ < 0 01)，Ct 值明顯上升(41.0 7 v s 3 4.1 7 , Ρ < 0.0 1 ),說(shuō)明L N A修飾可明顯降低堿基錯(cuò)配率，消除假陽(yáng)性產(chǎn)物峰HML Ν A修飾探針的檢測(cè)靈敏度有所下降，表現(xiàn)為檢測(cè)陽(yáng)性標(biāo)本時(shí)，與未加修飾的ML Ρ A探針相比，產(chǎn)物峰面積下降(80.0 2 v s 9 5.0 0 , P < 0.0 1，Ct 值上升(25.2 v s 2 4.53，P<0.0 1)，說(shuō)明LNA修飾可能導(dǎo)致探針雜交或連接效率下降，降低了 MLPA檢測(cè)的靈敏度。
【權(quán)利要求】
1.一種增強(qiáng)M L P A檢測(cè)S N P位點(diǎn)的特異性方法，其特征在于:設(shè)計(jì)針對(duì)K r a s基因2 I 6 G - C S N P位點(diǎn)的M L P A探針，使用M L P A實(shí)驗(yàn)，觀察其對(duì)S N P位點(diǎn)檢測(cè)時(shí)的影響。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種增強(qiáng)ML P A檢測(cè)S N P位點(diǎn)的特異性方法，其特征在于:直接用鎖核酸修飾M L P A探針的S N P位點(diǎn)或添加阻滯探針均可顯著提高S N P檢測(cè)時(shí)的特異性，3個(gè)L N A修飾的阻滯探針能最好地保證檢測(cè)的靈敏度和特異性。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104450907SQ201410739866
【公開(kāi)日】2015年3月25日 申請(qǐng)日期:2014年12月8日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月8日
【發(fā)明者】敖云霞 申請(qǐng)人:敖云霞