用于檢測人ugt1a1基因多態(tài)性的引物、探針、熒光pcr試劑盒和方法
【專利摘要】本發(fā)明提供用于檢測UGT1A1基因*6型與*28型兩個位點核苷酸多態(tài)性的引物、探針、熒光PCR試劑盒和方法，根據(jù)“等位基因特異PCR”原理，在實時熒光定量PCR技術(shù)平臺上檢測亞甲基四氫葉酸還原酶UGT1A1基因*6型與*28型兩個多態(tài)性位點的核苷酸類型。
【專利說明】用于檢測人UGT1A1基因多態(tài)性的引物、探針、熒光PCR試劑 盒和方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)學臨床分子檢測領(lǐng)域，具體涉及用于UGTlAl基因*6型與*28 型兩個位點核苷酸多態(tài)性檢測的引物、探針、熒光PCR試劑盒和檢測方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 尿苷二磷酸葡萄糖醛酰轉(zhuǎn)移酶(UGTs)是一大類能催化葡萄糖醛酸與親核底物結(jié)合 的膜結(jié)合酶，主要存在于肝臟和肝外組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。UGT分為兩個家族，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有17種人類 的基因編碼不同序列的UGT。酶的表達具有明顯的組織特異性，主要在肝臟中表達，其他組織 包括腦、腎、胃腸道等。UDP-葡萄糖醛基轉(zhuǎn)移酶IAl(簡稱UGT1A1)，參與多種物質(zhì)的葡萄糖醛 基化，這一結(jié)合反應(yīng)的目的在于增加底物的水溶性，增加從膽汁和尿液中的排泄量，達到物質(zhì) 代謝、解毒的目的。UGTlAl基因有30多個等位基因，其中一些SNP可影響酶的功能和分步。
[0003] 伊利替康是（Irenotecan，CPT-Il)是喜樹堿半合成衍生物，在體內(nèi)經(jīng)羥酸酯酶水 解成7-乙基-10-羥基喜樹堿（SN-38)，SN-38是DNA拓撲異構(gòu)酶I的抑制劑，作用于細胞 周期S期，抑制、干擾DNA修復(fù)和轉(zhuǎn)錄。伊利替康自用于臨床后，一直是治療直結(jié)腸癌最有 效的化療藥物之一。但在臨床使用中，也發(fā)現(xiàn)伊利替康會導(dǎo)致嚴重的血液毒性和消化道毒 性，表現(xiàn)為腹瀉和中性粒細胞減少，發(fā)生率可達30%和50%，嚴重時會導(dǎo)致死亡。
[0004] 臨床研究研究表明UGT1A1*6型和*28型與伊利替康引發(fā)的副反應(yīng)有著強相關(guān)性， 且種族差異。在高加索患者中，UGT1A1*28純和子（TA7/7)和雜合子（TA6/7)顯著增加患者 發(fā)生嚴重粒細胞減少和腹瀉的風險。而在亞洲患者中，UGT1A1*6型突變顯著增加患者發(fā)生 3~4級中性粒細胞減少、血小板減少及腹瀉的風險。
[0005] UGT1A1*6型的多態(tài)性表現(xiàn)為c. 211G>A。亞洲人群中，A/G和A/A攜帶者在伊利替 康治療中，發(fā)生3~4級中性粒細胞減少和非血液學毒性的風險顯著提高，UGT1A1*6型突變 在亞洲人群中的攜帶比例高達13?23%。UGT1A1*28多態(tài)性是指UGTlAl基因啟動子區(qū)TA堿 基重復(fù)序列的多態(tài)性，正常野生型為6個TA重復(fù)序列（TA6)，而*28型則含7個TA重復(fù)序 列（TA7)，根據(jù)TA重復(fù)序列的多少，可以分為*1/*1、*1/*28和*28/*28。UGT1A1*28純合突 變型在非洲人和高加索人中頻率較高達到12?27%和5?15%，在亞洲人中，僅為1. 2?5%。
[0006] 對UGTlAl多態(tài)性基因型進行分析，大多采用PCR-RFLP、DNA直接測序法，熒光PCR 法，HRM法和毛細管電泳法。由于PCR-RFLP技術(shù)依賴限制性內(nèi)切酶消化、電泳分析等原因， 往往出現(xiàn)結(jié)果誤判現(xiàn)象，影響其檢測準確率，另外其檢測周期長、通量較低，亦不適用于大 量人群的快速篩選。另外，作為基因檢測金標準的DNA直接測序法，由于其需要昂貴的儀器 設(shè)備和復(fù)雜的操作流程以及檢測周期長的特點，難以實現(xiàn)大規(guī)模推廣。其他方法也存在特 異性不高，檢測周期長等缺點。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)檢測UGTlAl基因多態(tài)性時價格昂貴、周期長、低效率、數(shù)據(jù) 分析繁瑣等不足，提供了一種基于實時熒光定量PCR技術(shù)平臺的UGTlAl基因多態(tài)性檢測的 引物和熒光探針、試劑盒及檢測方法，用于檢測人UGT1A1*6型c. 221位點（G/A)多態(tài)性和 *28型啟動子（TA6/7)多態(tài)性，本發(fā)明快速、成本低，具有廣泛推廣價值。
[0008] 為達到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是： 一種用于檢測人UGTlAl基因多態(tài)性的檢測引物及其相應(yīng)探針，根據(jù)UGTlAl基因 c. 221 位點（G/A)多態(tài)性設(shè)計，序列如下所示： 反向引物： UGTlAl *6G: 5' - GTCTTCAAGGTGTAGCATGCACC -3'（ SEQ ID No. 1); UGTlAl *6A: 5' - GTCTTCAAGGTGTAGCATGCACT-3'（ SEQ ID Νο·2); 正向引物： UGTlAl *6F: 5' - ACTGTTGATCGCAGTGGATGG -3'（ SEQ ID Νο·3); 熒光探針： TM-UGT1A1*6: 5' 熒光基團-CTAGCACCTGACGCCTCGTTGT -3' 淬滅基團（SEQ ID No. 4)。
[0009] 本發(fā)明還提供了一種用于檢測UGTlAl基因多態(tài)性的檢測引物及其相應(yīng)探針，根 據(jù)UGTlAl基因*28型（TA6/7)多態(tài)性設(shè)計，序列如下所示： 反向引物： UGTlAl *28TA6: 5' - TCTCCTACTTATATATATATATATGGCA -3'（ SEQ ID Νο·5); UGTlAl *28TA7: 5'-TCTCCTACTTATATATATATATATATGGCA-3' （ SEQ ID Νο·6); 正向引物： UGTlAl *28F: 5' -GCTCCACCTTCTTTATCTCTG -3' （ SEQ ID Νο·7); 熒光探針： TM-UGT1A1*28: 5' 熒光基團-CTCCCTGCTACCTTTGTGGACTGACAGC -3' 淬滅基團（SEQ ID No. 8)。
[0010] 本發(fā)明還提供了一種用于檢測人UGTlAl基因多態(tài)性的內(nèi)控引物對及相應(yīng)熒光 探針，序列如下所示： 內(nèi)控引物對： 正向引物：GAPDH F: 5' -CGCCCTCTTAATGGGGAGGTGG-3'（ SEQ ID Νο·9); 反向引物：GAPDH R: 5' -CTTTGGGGCTCACCATGTAGCACT-3'（ SEQ ID No. 10); 內(nèi)控熒光探針： TM-GAPDH: 5' 熒光基團-TGTTGCCATCAATGACCCCTTC-3' 淬滅基團（SEQ ID No. 11)。
[0011] 上述檢測人UGT1A1*6基因 C. 221位點（G/A)多態(tài)性的探針、檢測人UGT1A1*28基 因多態(tài)性的探針以及內(nèi)控引物對應(yīng)的熒光探針5'端的熒光基團為適用于熒光PCR定量分 析的常規(guī)使用的熒光報告基團，優(yōu)選FAM，TET，VIC，HEX或R0X，3'端的淬滅基團為適用于 熒光PCR定量分析的常規(guī)使用的熒光淬滅基團，優(yōu)選BHQ -1、BHQ -2、Dabcyl、Eclipse或 TAMRA，更優(yōu)選的方案為檢測熒光探針的5'端連有的熒光基團為FAM，3'端連有的淬滅基團 為BHQl ;內(nèi)控熒光探針的5'端連有的熒光基團為Hex，3'端連有的淬滅基團為BHQl。
[0012] 本發(fā)明還提供了一種用于檢測人UGTlAl基因多態(tài)性的熒光PCR試劑盒，包括本發(fā) 明所述檢測人UGTlAl基因 c. 221位點（G/A)多態(tài)性和/或人UGTlAl基因*28型TA6/7多態(tài) 性的檢測引物和相應(yīng)的熒光探針和使用說明書。具體的說，包括檢測人UGTlAl基因 c. 221 位點（G/A)多態(tài)性的兩種特異性反應(yīng)液：UGT1A1 *6G PCR反應(yīng)液與UGTlAl *6A PCR反應(yīng) 液，和/或檢測人UGTlAl基因 *28型TA6/7多態(tài)性的兩種特異性反應(yīng)液：UGT1A1 *28TA6 PCR反應(yīng)液與UGTlAl *28TA7 PCR反應(yīng)液；其中PCR反應(yīng)液包含了 PCR反應(yīng)必須的緩沖液、 鎂離子、dNTP等物質(zhì)外，還對應(yīng)的包含上述檢測引物與探針。上述各特異性檢測的PCR反 應(yīng)液分別包含的引物與探針的序列如下： (1) UGTlAl *6G PCR 反應(yīng)液 UGTlAl 祁G: 5' - GTCTTCAAGGTGTAGCATGCACC -3' ； UGTlAl *6F: 5' - ACTGTTGATCGCAGTGGATGG -3' TM-UGT1A1 *6: 5' 熒光基團-CTAGCACCTGACGCCTCGTTGT -3' 淬滅基團 (2) UGTlAl *6A PCR 反應(yīng)液 UGTlAl 祁A(yù): 5' - GTCTTCAAGGTGTAGCATGCACT -3' ； UGTlAl *6F: 5' - ACTGTTGATCGCAGTGGATGG -3' TM-UGT1A1 *6: 5' 熒光基團-CTAGCACCTGACGCCTCGTTGT -3' 淬滅基團 (3) UGTlAl *28TA6 PCR 反應(yīng)液 UGTlAl *28TA6: 5' -TCTCCTACTTATATATATATATATGGCA -3' ； UGTlAl *28F: 5' -GCTCCACCTTCTTTATCTCTG -3' TM-UGT1A1 *28: 5' 熒光基團-CTCCCTGCTACCTTTGTGGACTGACAGC -3' 淬滅基團 (4) UGTlAl *28TA7 PCR 反應(yīng)液 UGTlAl *28TA7: 5' -TCTCCTACTTATATATATATATATATGGCA -3' ； UGTlAl *28F: 5' -GCTCCACCTTCTTTATCTCTG -3' TM-UGT1A1 *28: 5' 熒光基團-CTCCCTGCTACCTTTGTGGACTGACAGC -3' 淬滅基團 上述試劑盒的PCR反應(yīng)液優(yōu)選方案中，除了包括檢測人UGTlAl基因 c. 221位點（C/T) 多態(tài)性和/或人UGTlAl基因*28型TA6/7多態(tài)性的檢測引物和相應(yīng)的熒光探針外，還包括 一對內(nèi)控引物及相應(yīng)熒光探針，內(nèi)控引物和探針的序列如下： 內(nèi)控引物： GAPDH F: 5, -CGCCCTCTTAATGGGGAGGTGG-3' GAPDH R: 5' -CTTTGGGGCTCACCATGTAGCACT-3' 內(nèi)控熒光探針： TM-GAPDH: 5' 熒光基團-TGTTGCCATCAATGACCCCTTC-3' 淬滅基團。
[0013] 上述試劑盒中檢測人UGTlAl基因 c. 221位點（G/A)多態(tài)性的探針、檢測人UGTlAl 基因*28型TA6/7多態(tài)性的探針以及內(nèi)控引物對應(yīng)的熒光探針5'端的熒光基團可以為適 用于熒光PCR定量分析的常規(guī)使用的熒光報告基團，優(yōu)選FAM，TET，VIC，HEX或R0X，3'端 的淬滅基團為適用于熒光PCR定量分析的常規(guī)使用的熒光淬滅基團，優(yōu)選BHQ -UBHQ -2、 Dabcyl、Eclipse或TAMRA，更優(yōu)選的方案為檢測熒光探針的5'端連有的熒光基團為FAM， 3'端連有的淬滅基團為BHQl ;內(nèi)控熒光探針的5'端連有的熒光基團為HEX，3'端連有的淬 滅基團為BHQl。
[0014] 上述試劑盒使用說明書包含對PCR擴增條件的描述，優(yōu)選的PCR擴增條件為：預(yù)變 性的條件為：溫度為95°C，時間為3分鐘； PCR反應(yīng)由第一階段和第二階段構(gòu)成： 第一階段由10次擴增循環(huán)構(gòu)成，其條件為： 變性：溫度為95°C，時間為30秒； 退火：起始溫度為58°C，時間為30秒； 延伸：溫度為62°C，時間為30秒； 第二階段由30次擴增循環(huán)構(gòu)成，其條件為： 變性：溫度為95°C，時間為30秒； 退火：溫度為58°C，時間為30秒；（設(shè)置熒光信號采集） 延伸：溫度為62°C，時間為45秒。
[0015] 本發(fā)明還提供了一種利用上述檢測引物和熒光探針或者上述含有的檢測UGTlAl 基因多態(tài)性的熒光PCR試劑盒進行UGTlAl基因多態(tài)性檢測的方法，步驟包括： (1)待測樣品處理和模板提取 a. 從待檢測者抽取血液樣本； b. 從血液樣本中獲取DNA，推薦使用商業(yè)化的試劑盒提取外周血基因組DNA ; c. 測定DNA濃度和純度，要求濃度大于lOng/μΙ ;0D260nm/0D280nm=l. 7?2. 0。
[0016] (2)熒光 PCR 擴增： 將待檢測模板DNA與一定量的Taq DNA聚合酶加入含有本發(fā)明所述檢測人UGTlAl基 因 c. 221位點（G/A)多態(tài)性和/或人UGTlAl基因*28型TA6/7多態(tài)性的檢測引物和相應(yīng) 的熒光探針PCR反應(yīng)液內(nèi)，在熒光PCR管內(nèi)混合均勻離心后，放入熒光定量PCR儀器按照特 定的溫度循環(huán)及信號采集程序進行PCR反應(yīng)，優(yōu)選將待檢測模板DNA與一定量的Taq DNA 聚合酶加入含有內(nèi)控引物及相應(yīng)熒光探針的上述試劑盒優(yōu)選方案的PCR反應(yīng)液內(nèi)，在熒光 PCR管內(nèi)混合均勻離心后放入熒光定量PCR儀器按照特定的溫度循環(huán)及信號采集程序進行 PCR反應(yīng)，用以監(jiān)測反應(yīng)有效性。
[0017] 上述熒光PCR擴增方案優(yōu)選采用以下溫度循環(huán)及信號采集程序進行PCR反應(yīng)： 預(yù)變性的條件為：溫度為95°C，時間為3分鐘； PCR反應(yīng)由第一階段和第二階段構(gòu)成： 第一階段由10次擴增循環(huán)構(gòu)成，其條件為： 變性：溫度為95°C，時間為30秒； 退火：起始溫度為58°C，時間為30秒； 延伸：溫度為62°C，時間為30秒； 第二階段由30次擴增循環(huán)構(gòu)成，其條件為： 變性：溫度為95°C，時間為30秒； 退火：溫度為58°C，時間為30秒；（設(shè)置熒光信號采集） 延伸：溫度為62°C，時間為30秒。
[0018] (3)分析結(jié)果 在上述UGT1A1*6型c. 221 G和c. 221A PCR反應(yīng)體系與溫度循環(huán)程序條件下，觀察特 異性PCR反應(yīng)體系內(nèi)目的檢測熒光信號是否形成對數(shù)擴增"S"型曲線，則該待檢DNA樣本 為該特異性反應(yīng)體系所代表的多態(tài)性類型的陽性。
[0019] 在上述UGT1A1*28型TA6和TA7 PCR反應(yīng)體系與溫度循環(huán)程序條件下，觀察特異 性PCR反應(yīng)體系內(nèi)目的檢測熒光信號是否形成對數(shù)擴增"S"型曲線，并且目的檢測熒光信 號的Ct值與內(nèi)參熒光信號的Ct值得差值小于預(yù)設(shè)值4,則該待檢DNA樣本為該特異性反 應(yīng)體系所代表的多態(tài)性類型的陽性。
[0020] 本發(fā)明還提供了一種檢測人UGTlAl基因 C. 221位點（G/A)多態(tài)性和/或人UGTlAl 基因*28型TA6/7多態(tài)性的檢測引物和相應(yīng)的熒光探針以及內(nèi)控引物及相應(yīng)探針在檢測人 UGTlAl基因多態(tài)性中的應(yīng)用。
[0021] 本發(fā)明還提供了一種含有檢測人UGTlAl基因 c. 221位點（G/A)多態(tài)性和/或人 UGTlAl基因*28型TA6/7多態(tài)性的檢測引物和相應(yīng)的熒光探針以及內(nèi)控引物及相應(yīng)探針的 試劑盒在檢測人UGTlAl基因多態(tài)性中的應(yīng)用。
[0022] 本發(fā)明所述技術(shù)方案中的有關(guān)內(nèi)容解釋如下。
[0023] 1.本發(fā)明工作原理是：等位基因特異PCR (Allele Specific PCR，ASPCR)，又稱 為等位基因特異性擴增法（Allele Specific Amplification, ASA)或者擴增受阻突變系統(tǒng) (Amplification Refractory Mutation System ARMS-PCR)，其基本原理是由于 Taq DNA 聚 合酶缺少3' 一 5'外切酶活性，在進行PCR反應(yīng)時，若引物3'端形成錯配，鏈延伸反應(yīng)就會 因為3'，5'-磷酸二酯鍵形成的障礙而受阻，導(dǎo)致PCR產(chǎn)物量急劇減少，在一定擴增循環(huán)內(nèi)， 不會檢測出特異的擴增產(chǎn)物；反之，3'端配對則能夠檢測出擴增產(chǎn)物。于是，針對已知的多 態(tài)性位點，將其多態(tài)性堿基設(shè)計于檢測引物的3'端，擴增反應(yīng)后，通過凝膠電泳觀察產(chǎn)物的 有無即可判斷多態(tài)性位點的堿基類型。
[0024] 突光定量 PCR 是（Real-time PCR)是 1996 年由美國 Applied Biosystems 公 司推出的一種新定量實驗技術(shù)，在PCR擴增時加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光 探針，該探針被稱"TaqMan探"，為一寡核苷酸，兩端分別標記一個報告突光基團和一個淬滅 熒光基團。探針完整時，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收；剛開始時，探針結(jié)合 在DNA任意一條單鏈上；PCR擴增時，Taq酶的5' 一 3'外切酶活性將探針酶切降解，使報 告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA 鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。
[0025] 通過基于熒光探針的實時熒光PCR技術(shù)檢測"等位基因特異PCR"反應(yīng)體系的產(chǎn) 物，根據(jù)形成擴增曲線的熒光信號在特定閾值時循環(huán)數(shù)（Ct值)的大小可判斷相應(yīng)檢測體系 內(nèi)模板相應(yīng)目的位點的堿基類型。
[0026] 2.本發(fā)明所述技術(shù)方案中的引物和探針的設(shè)計：根據(jù)美國國立生物技術(shù)信息中 心NCBI的核酸序列數(shù)據(jù)庫GeneBank公開的UGTlAl基因的參考序列（NG_009254)以及 dbSNP數(shù)據(jù)庫公開的c. 221位點（G/A)多態(tài)性（SNP ID :rs4148323)與*28型TA6/7多態(tài) 性（SNP ID :rs34983651)的信息，采用ABI公司的Primer Express 3.0軟件分別設(shè)計 檢測UGTlAl基因 c. 221位點（G/A)多態(tài)性與*28型TA6/7多態(tài)性的引物與探針。為了監(jiān) 測反應(yīng)體系的有效性，在檢測體系內(nèi)加入內(nèi)控弓丨物與探針，本發(fā)明選取人類保守基因 GAPDH 的一段序列（其GeneBank參考序列編號為：NG_007073. 2)，米用ABI公司的Primer Express 3.0軟件設(shè)計檢測引物及探針。
[0027] 本發(fā)明所述技術(shù)方案中，所述引物（primer)是指由一定數(shù)量的dNTP構(gòu)成的寡核 苷酸序列，通常由DNA合成儀人工合成，合成后經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳或其他適宜方法純 化。在聚合酶鏈式反應(yīng)中，引物可與待擴增目的核酸鏈上與之互補的區(qū)域結(jié)合，其功能是作 為核苷酸聚合作用的起始點，在引物的3' -OH上，核苷酸以二酯鍵形式進行合成，因此引物 的3' -OH必須是游離的。DNA聚合酶可由其3'端開始進行延伸，合成新的核酸鏈。
[0028] 本發(fā)明所述技術(shù)方案中，所述熒光探針是一種寡聚核苷酸探針，熒光基團連接在 探針的5'末端，而淬滅基團則在3'末端，通常采用DNA合成儀人工合成，合成后經(jīng)聚丙烯酰 胺凝膠電泳或其他適宜方法純化。目前常用的熒光基團有FAM，TET，VIC，HEX，ROX等。淬 滅基團有 BHQ -UBHQ -2、Dabcyl、Eclipse、TAMRA 等。
[0029] 3.本發(fā)明所述技術(shù)方案中，所述的內(nèi)控引物及其相應(yīng)的探針可以用來監(jiān)測反應(yīng)有 效性的指標，用以判斷是否存在模板質(zhì)量、機器故障、試劑穩(wěn)定性等因素影響試驗結(jié)果的情 況。正常情況下，PCR正常擴增會形成的指數(shù)級擴增曲線，形象的描述為"S"型擴增曲線， 表明體系正常擴增。當特異性PCR反應(yīng)體系內(nèi)目的檢測熒光信號形成對數(shù)擴增"S"型曲 線時，為多態(tài)性類型的陽性結(jié)果，也說明PCR體系擴增正常，無需采用內(nèi)控引物及其相應(yīng)的 探針進行結(jié)果的驗證。然而，當特異性PCR反應(yīng)體系內(nèi)目的檢測熒光信號未形成對數(shù)擴增 "S"型曲線，檢測結(jié)果為該特異性反應(yīng)體系所代表的多態(tài)性類型的陰性結(jié)果，但也有可能是 模板質(zhì)量、機器故障、試劑穩(wěn)定性等因素影響試驗結(jié)果，這種情況下，可以采用內(nèi)控引物及 其相應(yīng)的探針進行排除。當特異性PCR反應(yīng)體系內(nèi)目的檢測熒光信號未形成對數(shù)擴增"S" 型曲線，而內(nèi)控信號形成正常對數(shù)擴增"S"型曲線時，可以驗證多態(tài)性類型的陰性結(jié)果的準 確性。而當特異性PCR反應(yīng)體系內(nèi)目的檢測熒光信號未形成對數(shù)擴增"S"型曲線，且內(nèi)控 信號也未形成正常對數(shù)擴增"S"型曲線時，則說明實驗條件或儀器上出現(xiàn)問題影響試驗結(jié) 果，而非多態(tài)性類型的陰性結(jié)果。 由于上述技術(shù)方案運用，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有下列優(yōu)點和效果： 1.本發(fā)明技術(shù)方案中的檢測人UGTlAl基因 c. 221位點（G/A)多態(tài)性和/或人UGTlAl 基因*28型TA6/7多態(tài)性的檢測引物和相應(yīng)的熒光探針以及內(nèi)控引物及相應(yīng)探針，其PCR 檢測特異性非常高，并且采用實時熒光PCR技術(shù)，檢測結(jié)果判讀容易。
[0030] 2、本發(fā)明技術(shù)方案中的檢測引物與探針價格低廉，而且在實驗過程中不需測序， 在節(jié)省了檢測成本的同時，大大縮短了檢測周期，提高了檢測的效率。
[0031] 3、本發(fā)明技術(shù)方案中的檢測引物與探針，采用實時熒光PCR技術(shù)平臺，可實現(xiàn)高 通量檢測。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0032] 附圖1為某樣本UGTlAl基因 c. 221位點（*6)試劑盒檢測圖 附圖2為某樣本UGTlAl基因 c. 221位點測序圖 附圖3為某樣本UGTlAl基因 *28型位點試劑盒檢測圖 附圖4為某樣本UGTlAl基因 *28型位點測序圖

【具體實施方式】 在本發(fā)明中所使用的術(shù)語，除非另有說明，一般具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的 含義。
[0033] 下面結(jié)合具體實施例并參照數(shù)據(jù)進一步詳細描述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例只 是為了舉例說明本發(fā)明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
[0034] 在以下實施例中，未詳細描述的各種過程和方法是本領(lǐng)域中公知的常規(guī)方法，通 常米用常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克?。簩嶒炇沂謨裕∟ewYork :Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的方法。本發(fā)明所使用的 熒光定量PCR儀型號為ABI 7500或BioRad CFX96。
[0035] 實施例1.引物和探針的設(shè)計： 根據(jù)美國國立生物技術(shù)信息中心NCBI的核酸序列數(shù)據(jù)庫GeneBank公開的UGTlAl 基因的參考序列（NG_009254)以及dbSNP數(shù)據(jù)庫公開的c. 221位點（G/A)多態(tài)性 (rs4148323)與UGTlAl基因*28型TA6/7多態(tài)性（rs34983651)的信息，采用ABI公司 的Primer Express 3. 0軟件分別設(shè)計檢測UGTlAl基因 c. 221位點（G/A)多態(tài)性與28型 TA6/7多態(tài)性的引物與探針，具體如下： 檢測UGTlAl基因*6型c. 221位點（G/A)多態(tài)性引物及探針的序列如下所示： 反向引物： UGTlAl 祁G: 5' - GTCTTCAAGGTGTAGCATGCACC -3' ； UGTlAl 祁A(yù): 5' - GTCTTCAAGGTGTAGCATGCACT -3' ； 正向引物： UGTlAl *6F: 5' - ACTGTTGATCGCAGTGGATGG -3' 熒光探針： TM-UGT1A1*6: 5' FAM - CTAGCACCTGACGCCTCGTTGT -3' BHQ1。
[0036] 檢測UGTlAl基因*28型TA6/7多態(tài)性引物及探針的序列如下所示： 反向引物： UGTlAl *28TA6: 5' - TCTCCTACTTATATATATATATATGGCA -3' ； UGTlAl *28TA7: 5' - TCTCCTACTTATATATATATATATATGGCA -3' ； 正向引物： UGTlAl *28F: 5' - GCTCCACCTTCTTTATCTCTG -3' ； 熒光探針： TM-UGT1A1 *28: 5' FAM -CTCCCTGCTACCTTTGTGGACTGACAGC -3'BHQ1。
[0037] 為了監(jiān)測反應(yīng)體系的有效性，在檢測體系內(nèi)加入內(nèi)控引物與探針，本發(fā)明選取人 類保守基因 GAPDH的一段序列(其參考序列編號為：NG_007073. 2)，采用ABI公司的Primer Express 3. 0軟件設(shè)計檢測引物及探針，具體序列如下所示： 內(nèi)控引物對： 正向引物：GAPDH F: 5' -CGCCCTCTTAATGGGGAGGTGG-3' ； 反向引物：GAPDH R: 5' -CTTTGGGGCTCACCATGTAGCACT-3' ； 內(nèi)控熒光探針： TM-GAPDH: 5' Hex-TGTTGCCATCAATGACCCCTTC-3' BHQ2。
[0038] 實施例2.引物的制備 將設(shè)計好的引物及探針序列交由合成公司合成，一般采用儀器自動化學合成，需提供 合成檢驗合格報告。
[0039] 實施例3 :突光PCR檢測人UGTlAl基因多態(tài)性的試劑盒的準備 制備檢測人UGTlAl基因 c. 221位點（G/A)多態(tài)性的兩種特異性反應(yīng)液：UGT1A1 *6G PCR反應(yīng)液與UGTlAl *6A PCR反應(yīng)液；檢測人UGTlAl基因 *28型TA6/7多態(tài)性的兩種特異 性反應(yīng)液；UGTlAl *28TA6 PCR反應(yīng)液與UGTlAl *28TA7 PCR反應(yīng)液；其中PCR反應(yīng)液包 含了 PCR反應(yīng)必須的緩沖液、鎂離子、dNTP等物質(zhì)外，還包含了檢測引物與探針和內(nèi)控引物 與探針。上述各特異性檢測的PCR反應(yīng)液組分濃度及包含的引物與探針的序列信息如下： 表I. PCR反應(yīng)液組分

【權(quán)利要求】
1. 一種用于檢測人UGT1A1基因多態(tài)性的檢測引物及其相應(yīng)探針，其特征在于所述檢 測引物及探針根據(jù)UGT1A1基因c. 221位點（G/A)多態(tài)性設(shè)計，序列如下所示： 反向引物： UGT1A1 *6G: 5' - GTCTTCAAGGTGTAGCATGCACC -3' ； UGT1A1 *6A: 5' - GTCTTCAAGGTGTAGCATGCACT -3' ； 正向引物： UGT1A1 *6F: 5' - ACTGTTGATCGCAGTGGATGG -3' 熒光探針： TM-UGT1A1 *6: 5' 熒光基團-CTAGCACCTGACGCCTCGITGT -3' 淬滅基團。
2. -種用于檢測UGT1A1基因多態(tài)性的檢測引物及其相應(yīng)探針，其特征在于所述檢測 引物及探針根據(jù)UGT1A1基因*28型位點TA6/7多態(tài)性設(shè)計，序列如下所示： 反向引物： UGT1A1 *TA6: 5' - TCTCCTACTTATATATATATATATGGCA -3' ； UGT1A1 *TA7: 5' - TCTCCTACTTATATATATATATATATGGCA- 3' ； 正向引物： UGT1A1 *28F: 5' - GCTCCACCTTCTTTATCTCTG -3' ； 熒光探針： TM-UGT1A1*28: 5' 熒光基團-CTCCCTGCTACCTTTGTGGACTGACAGC -3' 淬滅基團。
3. -種用于檢測人UGT1A1基因多態(tài)性的內(nèi)控引物對及相應(yīng)熒光探針，其特征在于所 述內(nèi)控引物對及相應(yīng)熒光探針的序列如下所示： 內(nèi)控引物對： 正向引物：GAPDH F: 5' -CGCCCTCTTAATGGGGAGGTGG-3' ； 反向引物：GAPDH R: 5' -CITTGGGGCTCACCATGTAGCACT-3' ； 內(nèi)控熒光探針： TM-GAPDH: 5' 熒光基團-TGTTGCCATCAATGACCCCTTC-3' 淬滅基團。
4. 如權(quán)利要求1-3所述的引物對及相應(yīng)熒光探針，其特征在于所述熒光探針5'端的熒 光基團為？41^￡1\￥1(：、冊乂或1?(?，3'端的淬滅基團為冊〇-1、8即-2、〇31^71、￡(311口86、 或 TAMRA。
5. -種用于檢測人UGT1A1基因多態(tài)性的試劑盒，其特征在于所述試劑盒包括權(quán)利要 求1所述的檢測引物及其相應(yīng)探針和/或括權(quán)利要求2所述的檢測引物及其相應(yīng)探針。
6. 如權(quán)利要求5所述的檢測人UGT1A1基因多態(tài)性的試劑盒，其特征在于所述試劑盒 還包括如權(quán)利要求3所述內(nèi)控引物對及相應(yīng)熒光探針。
7. -種人UGT1A1基因多態(tài)性的檢測方法，所述方法包括使用權(quán)利要求1和/或權(quán)利要 求2所述的引物及探針。
8. 如權(quán)利要求7所述的人UGT1A1基因多態(tài)性的檢測方法，其特征在于所述方法還包括 使用權(quán)利要求3所述的引物及探針。
9. 一種人UGT1A1基因多態(tài)性的檢測方法，所述方法包括使用權(quán)利要求5-6所述的試劑 盒。
10. 權(quán)利要求1-3所述的引物及探針在檢測人UGT1A1基因多態(tài)性中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N15/11GK104388572SQ201410744876
【公開日】2015年3月4日 申請日期:2014年12月9日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月9日
【發(fā)明者】王進, 吳夢華, 吳子俠, 何曉輝, 趙小龍, 彭飛 申請人:蘇州曠遠生物分子技術(shù)有限公司