用于檢測(cè)人hla-b*1301基因的引物、探針、熒光pcr試劑盒和方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供用于人HLA-B*1301等位基因檢測(cè)的引物、探針、熒光PCR試劑盒和檢測(cè)方法，根據(jù)“等位基因特異PCR”原理，在實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)平臺(tái)上檢測(cè)人白細(xì)胞抗原HLA-B*1301等位基因。
【專(zhuān)利說(shuō)明】用于檢測(cè)人HLA-B*1301基因的引物、探針、熒光PCR試劑盒 和方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)臨床分子檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及用于HLA等位基因型 HLA-B*1301等位基因檢測(cè)的引物、探針、熒光PCR試劑盒和檢測(cè)方法。

【背景技術(shù)】
[0002]人類(lèi)白細(xì)胞抗原（HLA)是一組位于第6號(hào)染色體上的基因，是迄今已知基因中等 位基因多態(tài)性最高的基因復(fù)合體，全世界已發(fā)現(xiàn)超過(guò)2700多種等位基因，雖然其中多數(shù)等 位基因非常罕見(jiàn)。HLA基因是人類(lèi)最復(fù)雜的遺傳多態(tài)性系統(tǒng)，其多態(tài)性分布存在明顯的族群 特征。研究表明，HLA-B*1301等位基因與藥物氨苯砜導(dǎo)致的"氨苯砜綜合癥"存在著很強(qiáng)的 相關(guān)性。
[0003] 氨苯砜為砜類(lèi)抑菌劑，對(duì)麻風(fēng)桿菌有較強(qiáng)的抑菌作用。其作用機(jī)制與磺胺類(lèi)藥物 相似，作用于細(xì)菌的二氫葉酸合成酶，干擾葉酸的合成。氨苯砜已經(jīng)拓展到治療艾滋病并發(fā) 癥、瘧疾、自身免疫性大皰病、無(wú)菌性膿皰病、血管炎、痤瘡、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、急性缺血性腦中 風(fēng)等疾病。氨苯砜綜合癥是氨苯砜治療引起的嚴(yán)重副作用，表現(xiàn)為患者在服用氨苯砜后4-6 周后，會(huì)突然發(fā)生高燒、皮疹、淺表淋巴結(jié)腫大、內(nèi)臟器官受累等藥物超敏綜合癥狀，嚴(yán)重 者可出現(xiàn)器官功能衰竭，死亡率高達(dá)11%_13%，且具有不可預(yù)測(cè)性。
[0004] 研究表明，HLA-B*1301等位基因攜帶者在使用氨苯砜后發(fā)生重癥藥物不良反應(yīng) 的風(fēng)險(xiǎn)是非攜帶者的37. 5倍；而有兩個(gè)拷貝的HLA-B*1301風(fēng)險(xiǎn)等位基因，風(fēng)險(xiǎn)增長(zhǎng) 到110. 8倍。因此HLA-B*1301等位基因可以作為"氨苯砜綜合癥"的風(fēng)險(xiǎn)位點(diǎn)。檢測(cè) HLA-B*1301對(duì)減少藥物不良反應(yīng)，提高治療效果有著重要意義。
[0005] HLA等位基因有2700多種，分為A、B、C、DRB等基因族。中國(guó)漢人中，HLA-B等位 基因大概有150種左右，HLA-B*1301的攜帶率達(dá)飛％，并呈區(qū)域性差異。等位基因間的差異 由多個(gè)編碼氨基酸的SNP位點(diǎn)組成。
[0006] 目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)HLA-B*1301等位基因進(jìn)行分析，大多采用PCR-SSCP、測(cè)序法（SBT) 和熒光PCR法。測(cè)序法最為準(zhǔn)備，但需要通過(guò)專(zhuān)業(yè)軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析，檢測(cè)分析周期 長(zhǎng)。PCR-SSCP法是一種經(jīng)典的方法，通過(guò)幾對(duì)HLA-B*1301特異性引物擴(kuò)增DNA并通過(guò)電泳 結(jié)果來(lái)分析，污染風(fēng)險(xiǎn)大，周期長(zhǎng)，不適合臨床應(yīng)用?，F(xiàn)行的熒光PCR法，采用染料對(duì)擴(kuò)增的 特異片段產(chǎn)生信號(hào)，特異性較弱，而且無(wú)法進(jìn)行PCR反應(yīng)內(nèi)控。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)檢測(cè)HLA_B*1301等位基因時(shí)價(jià)格昂貴、周期長(zhǎng)、低效率、數(shù) 據(jù)分析繁瑣等不足，提供了一種基于Taqman實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)平臺(tái)的HLA_B*1301等 位基因檢測(cè)的引物和熒光探針、試劑盒及檢測(cè)方法，用于檢測(cè)人HLA-B*1301等位基因。本 方法針對(duì)臨床檢測(cè)的要求，引入PCR反應(yīng)內(nèi)控，保證檢測(cè)反應(yīng)的真實(shí)性和準(zhǔn)確性。本發(fā)明快 速、成本低，具有廣泛推廣價(jià)值。
[0008] 為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是： 一種用于檢測(cè)人HLA-B* 1301等位基因的檢測(cè)引物及其相應(yīng)探針，根據(jù)HLA-B* 1301特 異的等位基因多態(tài)性設(shè)計(jì)，序列如下所示： 正向引物： HLA-B*1301 F: 5, - GGGCCAGGGTCTCACATCA-3'（ SEQ ID No. 1); 反向引物： HLA-B*1301 R: 5' - CACGGGCCGCCTCCCACTTGA-3'（ SEQ ID No.2) 熒光探針： TM-HLA-B*1301: 5' 熒光基團(tuán)-CCAGGTAGGCTCTCAGCTGCTCCG -3' 淬滅基團(tuán)（SEQ ID No. 3)。
[0009] 本發(fā)明還提供了一種用于檢測(cè)人HLA-B*1301等位基因的內(nèi)控引物對(duì)及相應(yīng)熒光 探針，序列如下所示： 內(nèi)控引物對(duì)： 正向引物：GAPDH F: 5'-GCTGCTTTTAACTCTGGTAAAGTG-3'（ SEQ ID No.4); 反向引物：GAPDH R: 5'-TAGCACTCACCATGTAGITGAG-3'（ SEQ ID No.5); 內(nèi)控?zé)晒馓结槪?TM-GAPDH: 5' 熒光基團(tuán)-TGATGCATCTATGAACGCTTC-3' 淬滅基團(tuán)（SEQ ID No.6)。
[0010] 上述檢測(cè)人HLA-B*1301等位基因的探針和內(nèi)控引物對(duì)應(yīng)的熒光探針5'端的熒 光基團(tuán)為適用于熒光PCR定量分析的常規(guī)使用的熒光報(bào)告基團(tuán)，優(yōu)選FAM，TET，VIC，HEX 或R〇X，3'端的淬滅基團(tuán)為適用于熒光PCR定量分析的常規(guī)使用的熒光淬滅基團(tuán)，優(yōu)選BHQ -1、BHQ -2、Dabcyl、Eclipse或TAMRA，更優(yōu)選的方案為檢測(cè)熒光探針的5'端連有的熒光 基團(tuán)為FAM，3'端連有的淬滅基團(tuán)為Dabcyl ;內(nèi)控?zé)晒馓结樀?'端連有的熒光基團(tuán)為R0X， 3'端連有的淬滅基團(tuán)為BHQ-2。
[0011] 本發(fā)明還提供了一種用于檢測(cè)人HLA-B*1301等位基因的熒光PCR試劑盒，包括本 發(fā)明所述檢測(cè)人HLA-B*1301等位基因的檢測(cè)引物和相應(yīng)的熒光探針和使用說(shuō)明書(shū)。具體 的說(shuō)，包括檢測(cè)人HLA-B*1301等位基因的PCR反應(yīng)液，其中PCR反應(yīng)液包含了 PCR反應(yīng)必 須的緩沖液、鎂離子、dNTP等物質(zhì)外，還對(duì)應(yīng)的包含上述檢測(cè)引物與探針。上述各特異性檢 測(cè)的PCR反應(yīng)液分別包含的引物與探針的序列如下 ： (1)HLA-B*1301 PCR 反應(yīng)液 HLA-B*1301 F :5' -GGGCCAGGGTCTCACATCA -3' ； HLA-B*1301 R::5' -CACGGGCCGCCTCCCACTTGA-3' TM-HLA- B*1301 : 5' 熒光基團(tuán)-CCAGGTAGGCTCTCAGCTGCTCCG-3' 淬滅基團(tuán) 上述試劑盒的PCR反應(yīng)液優(yōu)選方案中，除了包括檢測(cè)人HLA B*5801等位基因的檢測(cè)引 物和相應(yīng)的熒光探針外，還包括一對(duì)內(nèi)控引物及相應(yīng)熒光探針，內(nèi)控引物和探針的序列如 下： 內(nèi)控引物： GAPDH F: 5' - GCTGCTTTTAACTCTGGTAAAGTG -3' GAPDH R: 5' - TAGCACTCACCATGTAGTTGAG -3' 內(nèi)控?zé)晒馓结槪?TM-GAPDH: 5' 熒光基團(tuán)-TGATGCATCTATGAACGCTTC -3' 淬滅基團(tuán)。
[0012] 上述試劑盒使用說(shuō)明書(shū)包含對(duì)PCR擴(kuò)增條件的描述，優(yōu)選的PCR擴(kuò)增條件為：預(yù)變 性的條件為：溫度為95°C，時(shí)間為3分鐘； PCR反應(yīng)由第一階段和第二階段構(gòu)成： 第一階段由10次擴(kuò)增循環(huán)構(gòu)成，其條件為： 變性：溫度為95°C，時(shí)間為20秒； 退火延伸：起始溫度為62°C，時(shí)間為45秒； 第二階段由30次擴(kuò)增循環(huán)構(gòu)成，其條件為： 變性：溫度為95°C，時(shí)間為20秒； 退火延伸：起始溫度為62°C，時(shí)間為45秒；（設(shè)置熒光信號(hào)采集） 本發(fā)明還提供了一種利用上述檢測(cè)引物和熒光探針或者上述含有的檢測(cè)HLA-B*1301 等位基因的熒光PCR試劑盒進(jìn)行HLA-B*1301等位基因檢測(cè)的方法，步驟包括： (1)待測(cè)樣品處理和模板提取 a. 從待檢測(cè)者抽取血液樣本； b. 從血液樣本中獲取DNA，推薦使用商業(yè)化的試劑盒提取外周血基因組DNA ; c?測(cè)定DNA濃度和純度，要求濃度大于10ng/W ;0D260nm/0D280nm=l. 7?2. 0。
[0013] (2)熒光 PCR 擴(kuò)增： 將待檢測(cè)模板DNA與一定量的Taq DNA聚合酶加入含有本發(fā)明所述檢測(cè)人HLA_B*1301 等位基因的檢測(cè)引物和相應(yīng)的熒光探針PCR反應(yīng)液內(nèi)，在熒光PCR管內(nèi)混合均勻離心后，放 入熒光定量PCR儀器按照特定的溫度循環(huán)及信號(hào)采集程序進(jìn)行PCR反應(yīng)，優(yōu)選將待檢測(cè)模 板DNA與一定量的Taq DNA聚合酶加入含有內(nèi)控引物及相應(yīng)熒光探針的上述試劑盒優(yōu)選方 案的PCR反應(yīng)液內(nèi)，在熒光PCR管內(nèi)混合均勻離心后放入熒光定量PCR儀器按照特定的溫 度循環(huán)及信號(hào)采集程序進(jìn)行PCR反應(yīng)，用以監(jiān)測(cè)反應(yīng)有效性。
[0014] 上述熒光PCR擴(kuò)增方案優(yōu)選采用以下溫度循環(huán)及信號(hào)采集程序進(jìn)行PCR反應(yīng)： 預(yù)變性的條件為：溫度為95°C，時(shí)間為3分鐘； PCR反應(yīng)由第一階段和第二階段構(gòu)成： 第一階段由10次擴(kuò)增循環(huán)構(gòu)成，其條件為： 變性：溫度為95°C，時(shí)間為20秒； 退火延伸：起始溫度為62°C，時(shí)間為45秒； 第二階段由30次擴(kuò)增循環(huán)構(gòu)成，其條件為： 變性：溫度為95°C，時(shí)間為20秒； 退火延伸：起始溫度為62°C，時(shí)間為45秒；（設(shè)置熒光信號(hào)采集） (3)分析結(jié)果 在上述PCR反應(yīng)體系與溫度循環(huán)程序條件下，觀察特異性PCR反應(yīng)體系內(nèi)目的檢測(cè)熒 光信號(hào)是否形成對(duì)數(shù)擴(kuò)增"S"型曲線，如果形成對(duì)數(shù)擴(kuò)增"S"型曲線則該待檢DNA樣本為 該特異性反應(yīng)體系所代表的HLA-B*1301等位基因?yàn)殛?yáng)性。
[0015] 本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)人HLA-B*1301等位基因的檢測(cè)引物和相應(yīng)的熒光探針 以及內(nèi)控引物及相應(yīng)探針在檢測(cè)人HLA-B*1301等位基因的應(yīng)用。
[0016] 本發(fā)明還提供了一種含有檢測(cè)人HLA-B*1301等位基因的檢測(cè)引物和相應(yīng)的熒光 探針以及內(nèi)控引物及相應(yīng)探針的試劑盒在檢測(cè)人HLA-B*1301等位基因的應(yīng)用。
[0017] 本發(fā)明所述技術(shù)方案中的有關(guān)內(nèi)容解釋如下。
[0018] 1.本發(fā)明工作原理是：等位基因特異PCR (Allele Specific PCR，ASPCR)，又稱(chēng) 為等位基因特異性擴(kuò)增法（Allele Specific Amplification, ASA)或者擴(kuò)增受阻突變系統(tǒng) (Amplification Refractory Mutation System ARMS-PCR)，其基本原理是由于 Taq DNA 聚 合酶缺少3' 一 5'外切酶活性，在進(jìn)行PCR反應(yīng)時(shí)，若引物3'端形成錯(cuò)配，鏈延伸反應(yīng)就會(huì) 因?yàn)?'，5'-磷酸二酯鍵形成的障礙而受阻，導(dǎo)致PCR產(chǎn)物量急劇減少，在一定擴(kuò)增循環(huán)內(nèi)， 不會(huì)檢測(cè)出特異的擴(kuò)增產(chǎn)物；反之，3'端配對(duì)則能夠檢測(cè)出擴(kuò)增產(chǎn)物。于是，針對(duì)已知的多 態(tài)性位點(diǎn)，將其多態(tài)性堿基設(shè)計(jì)于檢測(cè)引物的3'端，擴(kuò)增反應(yīng)后，通過(guò)凝膠電泳觀察產(chǎn)物的 有無(wú)即可判斷多態(tài)性位點(diǎn)的堿基類(lèi)型。
[0019]突光定量PCR是（Real-time PCR)是1996年由美國(guó)Applied Biosystems公 司推出的一種新定量實(shí)驗(yàn)技術(shù)，在PCR擴(kuò)增時(shí)加入一對(duì)引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的熒光 探針，該探針被稱(chēng)"TaqMan探"，為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個(gè)報(bào)告突光基團(tuán)和一個(gè)淬滅 熒光基團(tuán)。探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收；剛開(kāi)始時(shí)，探針結(jié)合 在DNA任意一條單鏈上；PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的5'一3'外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào) 告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增一條DNA 鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。
[0020] 通過(guò)基于熒光探針的實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)檢測(cè)"等位基因特異PCR"反應(yīng)體系的產(chǎn) 物，根據(jù)形成擴(kuò)增曲線的熒光信號(hào)在特定閾值時(shí)循環(huán)數(shù)（ct值)的大小可判斷相應(yīng)檢測(cè)體系 內(nèi)模板相應(yīng)等位基因的類(lèi)型。
[0021] 2.本發(fā)明所述技術(shù)方案中的引物和探針的設(shè)計(jì)：根據(jù)美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息 中心NCBI的核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)GeneBank公開(kāi)的HLA-B基因的參考序列（NG_023187)以及 英國(guó)頂G/HLA數(shù)據(jù)庫(kù)公開(kāi)的HLA-B*1301 (HLA00152)的信息，采用ABI公司的Primer Express 3.0軟件分別設(shè)計(jì)檢測(cè)HLA-B*1301等為基因的引物與探針。為了監(jiān)測(cè)反應(yīng)體系的 有效性，在檢測(cè)體系內(nèi)加入內(nèi)控引物與探針，本發(fā)明選取人類(lèi)保守基因GAPDH的一段序列 (其GeneBank參考序列編號(hào)為：NG_007073. 2)，采用ABI公司的Primer Express 3. 0軟件 設(shè)計(jì)檢測(cè)引物及探針。
[0022] 本發(fā)明所述技術(shù)方案中，所述引物（primer)是指由一定數(shù)量的dNTP構(gòu)成的寡核 苷酸序列，通常由DNA合成儀人工合成，合成后經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳或其他適宜方法純 化。在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中，引物可與待擴(kuò)增目的核酸鏈上與之互補(bǔ)的區(qū)域結(jié)合，其功能是作 為核苷酸聚合作用的起始點(diǎn)，在引物的3' -0H上，核苷酸以二酯鍵形式進(jìn)行合成，因此引物 的3' -0H必須是游離的。DNA聚合酶可由其3'端開(kāi)始進(jìn)行延伸，合成新的核酸鏈。
[0023] 本發(fā)明所述技術(shù)方案中，所述熒光探針是一種寡聚核苷酸探針，熒光基團(tuán)連接在 探針的5'末端，而淬滅基團(tuán)則在3'末端，通常采用DNA合成儀人工合成，合成后經(jīng)聚丙烯酰 胺凝膠電泳或其他適宜方法純化。目前常用的熒光基團(tuán)有？411，1￡1'，￥1(：，冊(cè)乂，1?(?等。淬 滅基團(tuán)有BHQ -1、BHQ _2、0&1^71、￡(311口86、1六1狀等。
[0024] 3.本發(fā)明所述技術(shù)方案中，所述的內(nèi)控引物及其相應(yīng)的探針可以用來(lái)監(jiān)測(cè)反應(yīng) 有效性的指標(biāo)，用以判斷是否存在模板質(zhì)量、機(jī)器故障、試劑穩(wěn)定性等因素影響試驗(yàn)結(jié)果的 情況。正常情況下，PCR正常擴(kuò)增會(huì)形成的指數(shù)級(jí)擴(kuò)增曲線，形象的描述為"S"型擴(kuò)增曲線， 表明體系正常擴(kuò)增。當(dāng)特異性PCR反應(yīng)體系內(nèi)目的檢測(cè)熒光信號(hào)形成對(duì)數(shù)擴(kuò)增"S"型曲 線時(shí)，為多態(tài)性類(lèi)型的陽(yáng)性結(jié)果，也說(shuō)明PCR體系擴(kuò)增正常，無(wú)需采用內(nèi)控引物及其相應(yīng)的 探針進(jìn)行結(jié)果的驗(yàn)證。然而，當(dāng)特異性PCR反應(yīng)體系內(nèi)目的檢測(cè)熒光信號(hào)未形成對(duì)數(shù)擴(kuò)增 "S"型曲線，檢測(cè)結(jié)果為該特異性反應(yīng)體系所代表的多態(tài)性類(lèi)型的陰性結(jié)果，但也有可能是 模板質(zhì)量、機(jī)器故障、試劑穩(wěn)定性等因素影響試驗(yàn)結(jié)果，這種情況下，可以采用內(nèi)控引物及 其相應(yīng)的探針進(jìn)行排除。當(dāng)特異性PCR反應(yīng)體系內(nèi)目的檢測(cè)熒光信號(hào)未形成對(duì)數(shù)擴(kuò)增"S" 型曲線，而內(nèi)控信號(hào)形成正常對(duì)數(shù)擴(kuò)增"S"型曲線時(shí)，可以驗(yàn)證多態(tài)性類(lèi)型的陰性結(jié)果的準(zhǔn) 確性。而當(dāng)特異性PCR反應(yīng)體系內(nèi)目的檢測(cè)熒光信號(hào)未形成對(duì)數(shù)擴(kuò)增"S"型曲線，且內(nèi)控 信號(hào)也未形成正常對(duì)數(shù)擴(kuò)增"S"型曲線時(shí)，則說(shuō)明實(shí)驗(yàn)條件或儀器上出現(xiàn)問(wèn)題影響試驗(yàn)結(jié) 果，而非多態(tài)性類(lèi)型的陰性結(jié)果。
[0025] 由于上述技術(shù)方案運(yùn)用，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有下列優(yōu)點(diǎn)和效果： 1.本發(fā)明技術(shù)方案中的檢測(cè)人HLA-B*1301等位基因的檢測(cè)引物和相應(yīng)的熒光探針以 及內(nèi)控引物及相應(yīng)探針，其PCR檢測(cè)特異性非常高，并且采用實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)，檢測(cè)結(jié)果 判讀容易，更加適合臨床檢測(cè)。本發(fā)明技術(shù)方案采用Taqman探針，檢測(cè)信號(hào)比熒光染料根 據(jù)特異。
[0026] 2、本發(fā)明技術(shù)方案中的檢測(cè)引物與探針價(jià)格低廉，而且在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中不需測(cè)序， 在節(jié)省了檢測(cè)成本的同時(shí)，大大縮短了檢測(cè)周期，提高了檢測(cè)的效率。
[0027] 3、本發(fā)明技術(shù)方案中的檢測(cè)引物與探針，采用實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)平臺(tái)，可實(shí)現(xiàn)高 通量檢測(cè)。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0028] 附圖1為某HLA-B* 1301等位基因攜帶者樣本試劑盒檢測(cè)圖。
[0029] 附圖2為某樣本HLA_B*1301等位基因攜帶者樣本測(cè)序圖。

【具體實(shí)施方式】
[0030] 在本發(fā)明中所使用的術(shù)語(yǔ)，除非另有說(shuō)明，一般具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理 解的含義。
[0031] 下面結(jié)合具體實(shí)施例并參照數(shù)據(jù)進(jìn)一步詳細(xì)描述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例只 是為了舉例說(shuō)明本發(fā)明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
[0032] 在以下實(shí)施例中，未詳細(xì)描述的各種過(guò)程和方法是本領(lǐng)域中公知的常規(guī)方法，通 常米用常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊(cè)（NewYork:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的方法。本發(fā)明所使用的 熒光定量PCR儀型號(hào)為ABI 7500或BioRad CFX96。
[0033] 實(shí)施例1?引物和探針的設(shè)計(jì)： 根據(jù)美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心NCBI的核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)GeneBank公開(kāi)的HLA-B基因 的參考序列（NG_023187)以及英國(guó)IMG/HLA數(shù)據(jù)庫(kù)公開(kāi)的HLA-B*1301 (HLA00152)的信 息，采用ABI公司的Primer Express 3. 0軟件分別設(shè)計(jì)檢測(cè)HLA-B*1301等為基因的引物 與探針。引物與探針，具體如下： 正向引物： HLA-B*1301 F: 5' -GGGCCAGGGTCTCACATCA-3' 反向引物： HLA-B*1301 R: 5' -CACGGGCCGCCTCCCACTTGA -3' 熒光探針： TM-HLA-B*1301: 5'Fam- CCAGGTAGGCTCTCAGCTGCTCCG-3'BHQ1 為了監(jiān)測(cè)反應(yīng)體系的有效性，在檢測(cè)體系內(nèi)加入內(nèi)控引物與探針，本發(fā)明選取人類(lèi) 保守基因GAPDH的一段序列（其參考序列編號(hào)為：NG_007073. 2)，采用ABI公司的Primer Express 3. 0軟件設(shè)計(jì)檢測(cè)引物及探針，具體序列如下所示： 內(nèi)控引物對(duì)：

【權(quán)利要求】
1. 一種用于檢測(cè)人HLA-B*1301等位基因的檢測(cè)引物及其相應(yīng)探針，其特征在于所述 檢測(cè)引物及探針根據(jù)HLA-B*1301等位基因特異位點(diǎn)設(shè)計(jì)，序列如下所示： 正向引物： HLA-B*1301 F: 5' -GGGCCAGGGTCTCACATCA -3' 反向引物： HLA-B*1301 R: 5' -CACGGGCCGCCTCCCACTTGA-3' 熒光探針： TM-HLA-B*1301: 5' 熒光基團(tuán)-5CCAGGTAGGCTCTCAGCTGCTCCG -3' 淬滅基團(tuán)。
2. -種用于檢測(cè)人HLA-B*1301等位基因的內(nèi)控引物對(duì)及相應(yīng)熒光探針，其特征在于 所述內(nèi)控引物對(duì)及相應(yīng)熒光探針的序列如下所示： 內(nèi)控引物對(duì)： 正向引物：GAPDH F: 5' -GCTGCTTTTAACTCTGGTAAAGTG-3' 反向引物：GAPDH R: 5' -TAGCACTCACCATGTAGTTGAG-3,內(nèi)控?zé)晒馓结槪? 熒光探針：TM-GAPDH: 5' 熒光基團(tuán)-TGATGCATCTATGAACGCTTC-3' 淬滅基團(tuán)。
3. 如權(quán)利要求1-2所述的引物對(duì)及相應(yīng)熒光探針，其特征在于所述熒光探針5'端的熒 光基團(tuán)為？41^￡1\￥1(：、冊(cè)乂或1?(?，3'端的淬滅基團(tuán)為冊(cè)〇-1、8即-2、〇31^71、￡(311口86、 或 TAMRA。
4. 一種用于檢測(cè)人HLA-B*1301等位基因的試劑盒，其特征在于所述試劑盒包括權(quán)利 要求1所述的檢測(cè)引物及其相應(yīng)探針和/或括權(quán)利要求2所述的檢測(cè)引物及其相應(yīng)探針。
5. 如權(quán)利要求4所述的檢測(cè)人HLA-B*1301等位基因的試劑盒，其特征在于所述試劑盒 還包括如權(quán)利要求2所述內(nèi)控引物對(duì)及相應(yīng)熒光探針。
6. -種人HLA-B*1301等位基因的檢測(cè)方法，所述方法包括使用權(quán)利要求1和/或權(quán)利 要求2所述的引物及探針。
7. -種人HLA-B*1301等位基因的檢測(cè)方法，所述方法包括使用權(quán)利要求4-5所述的試 劑盒。
8. 權(quán)利要求1-2所述的引物及探針在檢測(cè)人HLA-B*1301等位基因中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK104450912SQ201410746909
【公開(kāi)日】2015年3月25日 申請(qǐng)日期:2014年12月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月10日
【發(fā)明者】王進(jìn), 吳夢(mèng)華, 趙小龍, 吳子俠, 石亦靜 申請(qǐng)人:蘇州曠遠(yuǎn)生物分子技術(shù)有限公司