抗pcsk9的高親和力人抗體的制作方法
【專利摘要】一種與人類前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草溶菌素9(hPCSK9)特異性結(jié)合并抑制其活性的人抗體或人抗體的抗原結(jié)合片段，其特征為，相對于給藥前水平，能使血清LDL膽固醇含量下降40至80％達(dá)24天、60天或90天，而血清HDL膽固醇含量則下降很少或不下降，且經(jīng)ALT和AST測量確定對肝功能影響很小或沒有可測量的影響。
【專利說明】抗PCSK9的高親和力人抗體 本申請是發(fā)明人于2009年12月15日提交的題為"抗PCSK9的高親和力人抗體"的中 國專利申請200980150206. X的分案申請。 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及與人類前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草溶菌素9(PCSK9)特異性結(jié)合的人抗體和人 抗體的抗原結(jié)合片段，W及使用該些抗體的治療方法。 關(guān)于相關(guān)技術(shù)的陳述
[0002] 前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草溶菌素9(PCSK9)是一種前蛋白轉(zhuǎn)化酶，屬于分泌的枯草桿菌 酶家族的蛋白酶K亞族。該編碼蛋白是作為可溶性酶原合成的，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中經(jīng)過自身催化 分子內(nèi)加工。證據(jù)顯示，PCSK9促進(jìn)LDL受體的降解從而增加血漿中LDL膽固醇含量，而 LDL受體介導(dǎo)肝內(nèi)的LDL胞吞過程，后者是從循環(huán)系統(tǒng)清除LDL的主要途徑。PCSK9蛋白的 結(jié)構(gòu)顯示，它具有一個信號序列、接著是一個前結(jié)構(gòu)域、一個含有保守H元殘基值186、H226 和S386)的催化結(jié)構(gòu)域，W及一個C端結(jié)構(gòu)域。它是作為可溶性74-kDa前體合成的，在內(nèi) 質(zhì)網(wǎng)中經(jīng)過自身催化裂解而產(chǎn)生一個14-kDa前結(jié)構(gòu)域和60-kDa催化片段。業(yè)已顯示該自 身催化活性是分泌過程所需要的。裂解之后，上述前結(jié)構(gòu)域保持與催化結(jié)構(gòu)域緊密相連的 狀態(tài)。
[0003] PCSK9 的抗體在例如 W0 2008/057457、W0 2008/057458、W0 2008/057459、W0 2008/063382、W0 2008/125623 W及 US2008/0008697 等專利中均有述及。 發(fā)明概要
[0004] 在第一個方面，本發(fā)明提供了一些與人PCS腳化PCS腳）特異性結(jié)合且中和其活性 的完全人單克隆抗體（mAbs)及其抗原結(jié)合片段。
[0005] 在一個實施方案中，本發(fā)明包括一種與hPCSK9特異性結(jié)合的抗體或抗體的抗原 結(jié)合片段，并至少具有W下一個特征： (i)相對于給藥前水平，能夠使血清總膽固醇含量下降至少約25至35%并保持該種下 降趨勢達(dá)至少24天，較佳的是使血清總膽固醇含量下降至少約30至40% ; (i)相對于給藥前水平，能夠使血清LDL膽固醇含量下降至少約65至80%并保持該種 下降趨勢達(dá)至少24天； (iii) 相對于給藥前水平，能夠使血清甘油H醋含量下降至少約25至40% ; (iv) 不降低血清皿L膽固醇含量，或相對于給藥前水平，降低血清皿L膽固醇含量不超 過5%。
[0006] 在一個實施方案中，本發(fā)明包括一種與hPCSK9特異性結(jié)合的抗體或抗體的抗原 結(jié)合片段，并至少具有W下一個特征： (i) 相對于給藥前水平，能夠使血清LDL膽固醇含量下降至少約40至70%并保持該種 下降趨勢達(dá)至少60天或90天； (ii) 相對于給藥前水平，能夠使血清甘油H醋含量下降至少約25至40% ; (iii)不降低血清HDL膽固醇含量，或相對于給藥前水平，降低血清HDL膽固醇含量不 超過5%。
[0007] 在一個實施方案中，該抗體或其片段的特征是與包含hPCSK9(SEQ ID N0:755) 的氨基酸殘基238的表位結(jié)合。在一個較特殊的實施方案中，該抗體或其片段與包含 hPCS腳(SEQ ID NO: 755)的一個或一個W上氨基酸殘基238、153、159和343的表位結(jié)合。 在一個較特殊的實施方案中，該抗體或其片段的特征是與在SEQ ID NO: 755的192、194、197 和/或237位置不含氨基酸殘基的表位結(jié)合。
[0008] 在一個實施方案中，該抗體或其片段的特征是與包含hPCSK9(SEQ ID NO:755)的 氨基酸殘基366的表位結(jié)合。在一個較特殊的實施方案中，該抗體或其片段與在SEQ ID NO: 755的147、366和380位置包含一個或一個W上氨基酸殘基的表位結(jié)合。在一個較特殊 的實施方案中，該抗體或其片段的特征是，在SEQ ID NO: 755的215和/或238位置與不含 氨基酸殘基的表位結(jié)合。
[0009] 在一個實施方案中，該抗體或其片段的特征是，經(jīng)表面等離子體共振技術(shù)測量，相 對于抑7. 4條件下的結(jié)合親和力Og，在抑5. 5條件下顯示與hPCSK9的結(jié)合親和力Kd增 強。在一個特殊的實施方案中，經(jīng)表面等離子體共振技術(shù)測量，該抗體或其片段在酸性抑 條件下與PCSK9的結(jié)合親和力比在中性抑條件下增強至少20倍、至少40倍或至少50倍。
[0010] 在一個實施方案中，該抗體或其片段的特征是，經(jīng)表面等離子體共振技術(shù)測量，未 顯示在酸性抑條件下與PCSK9的結(jié)合親和力比在中性抑條件下有所增強。在一個特殊的 實施方案中，與中性抑條件相比，酸性抑條件下的結(jié)合力較小且Ti/2較短。
[0011] 在另一個實施方案中，該抗體或抗原結(jié)合片段與人、人G0F突變D374Y、縣猴、恒河 猴、小鼠、大鼠W及倉鼠的PCSK9結(jié)合。
[0012] 在一個實施方案中，該抗體或抗原結(jié)合片段與人和猴的PCSK9結(jié)合，但不與小鼠、 大鼠或倉鼠的PCSK9結(jié)合。
[0013] 該些mAbs抗體可W是全長的（例如IgGl或IgG4抗體），或可僅包含一個抗原結(jié) 合部分（例如Fab、F(ab' )2或scFv片段），并可加W修飾W影響其功能，例如消除殘余的 效應(yīng)子功能化eddy et al. (2000) J. Immunol. 164:1925-1933)。
[0014] 在一個實施方案中，本發(fā)明包括一種抗體或抗體的抗原結(jié)合片段，其包含一個選 自下列一組序列的重鏈可變域（HCVR) ;SEQ ID N0:2、18、22、26、42、46、50、66、70、74、90、 94、98、114、118、122、138、142、146、162、166、170、186、190、194、210、214、218、234、238、 242、258、262、266、282、286、290、306、310、314、330、3：34、338、354、358、362、378、382、386、 402、406、410、426、430、434、450、454、458、474、478、482、498、502、506、522、526、530、546、 550、554、570、574、578、594、598、602、618、622、626、642、646、650、666、670、674、690、694、 698、714、718、722、738和742,或一種與其實質(zhì)上相似具有至少90%、至少95%、至少98% 或至少99%序列同一性的序列。在一個實施方案中，該HCVR是一個選自下列一組序列的氨 基酸序列；SEQ ID N0:50、66、70、74、90、94、122、138、142、218、234、238、242、258、262、314、 330和334。在一個較特殊的實施方案中，該HCVR包含SEQ ID NO: 90或218。
[0015] 在一個實施方案中，該抗體或其片段進(jìn)一步包含一個選自下列一組序列的輕鏈 可變域（LCVR) ;SEQ ID N0:10、20、24、：M、44、48、58、68、72、82、92、96、106、116、120、130、 140、144、154、164、168、178、188、192、202、212、216、226、236、240、250、260、264、274、284、 288、298、308、312、322、332、336、：346、356、360、370、380、384、394、404、408、418、428、432、 442、452、456、466、476、480、490、500、504、514、524、528、538、548、552、562、572、576、586、 596、600、610、620、624、6：34、644、648、658、668、672、682、692、696、706、716、720、730、740 和 744,或一種與其實質(zhì)上相似具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性的 序列。在一個實施方案中，該LCVR是一個選自下列一組序列的氨基酸序列；SEQ ID NO:58、 68、72、82、92、96、130、140、144、226、236、240、250、260、264、322、332和 336。在一個較特殊 的實施方案中，該LCVR包含SEQ ID NO:92或226。
[0016] 在一個特殊的實施方案中，該抗體或其片段包含一個選自下列一組序列的HCVR 和 LCVR(肥VR/LCVR)序列對；SEQ ID N0:2/10、18/20、22/24、26/34、42/44、46/48、50/58、 66/68、70/72、74/82、90/92、94/96、98/106、114/116、118/120、122/130、138/140、142/144、 146/154、162/164、166/168、170/178、186/188、190/192、194/202、210/212、214/216、 218/226、234/236、238/240、242/250、258/260、262/264、266/274、282/284、286/288、 290/298、306/308、310/312、314/322、330/332、334/336、338/346、354/356、358/360、 362/370、378/380、382/384、386/394、402/404、406/408、410/418、426/428、430/432、 434/442.450/452.454/456.458/466.474/476.478/480.482/490.498/500.502/504. 506/514、522/524、526/528、530/538、546/548、550/552、554/562、570/572、574/576、 578/586、594/596、598/600、602/610、618/620、622/624、626/634、642/644、646/648、 650/658、666/668、670/672、674/682、690/692、694/696、698/706、714/716、718/720、 722/730、738/740和742/744。在一個實施方案中，該HCVR和LCVR是一對選自下列一組 序列對的氨基酸序列對；SEQ ID N0:50/58、66/68、70/72、74/82、90/92、94/96、122/130、 138/140、142/144、218/226、234/236、238/240、242/250、258/260、262/264、314/322、 330/332和334/336。在一個較特殊的實施方案中、該HCVR/LCVR序列對包含SEQ ID N0:90/92 或 218/226。
[0017] 在第二個方面，本發(fā)明的特點是有一種抗體或抗體的抗原結(jié)合片段，其包含一個 選自下列一組序列的重鏈CDR3化CDR3)域；SEQ ID N0:8、32、56、80、104、128、152、176、200、 224、248、272、296、320、344、368、392、416、440、464、488、512、536、560、584、608、632、656、 680、704和728,或一種與其實質(zhì)上相似具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99% 序列同一性的序列；W及一個選自下列一組序列的輕鏈CDR3(LCDR3)域；SEQ ID N0:16、 40、64、88、112、136、160、184、208、232、256、280、304、328、352、376、400、424、448、472、496、 520、544、568、592、616、640、664、688、712和736,或一種與其實質(zhì)上相似具有至少90%、至 少95%、至少98%或至少99%序列同一性的序列。在一個實施方案中，該HCDR3/LCDR3序 列對是 SEQ ID N0:56/64、80/88、128/136、224/232、248/256 或 320/328。在一個較特殊的 實施方案中，該肥033/1〔01?3包含569 10^:80/88 或 224/232。
[0018] 在一個進(jìn)一步的實施方案中，本發(fā)明包括一種抗體或抗體的抗原結(jié)合片段，其包 含一個選自下列一組序列的重鏈 CDRl(HCDRl)域；SEQ ID N0:4、28、52、76、100、124、148、 172、196、220、244、268、292、316、：340、364、388、412、436、460、484、508、532、556、580、604、 628、652、676、700和724,或一種與其實質(zhì)上相似具有至少90%、至少95%、至少98%或至 少99%序列同一性的序列；一個選自下列一組序列的重鏈CDR2 (HCDR2)域；SEQ ID N0:6、 30、54、78、102、126、150、174、198、222、246、270、294、318、342、366、390、414、438、462、 486、510、5：M、558、582、606、630、654、678、702 和 726、或一種與其實質(zhì)上相似具有至少 90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性的序列；一個選自下列一組序列的輕鏈 CDRl(LCDRl)域；SEQ ID N0:12、36、60、84、108、132、156、180、204、228、252、276、300、324、 348、372、396、420、444、468、492、516、540、564、588、612、636、660、684、708 和 732,或一種 與其實質(zhì)上相似具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性的序列；W及 一個選自下列一組序列的輕鏈 CDR2(LCDR2)域；SEQ ID N0:14、38、62、86、110、134、158、 182、206、230、254、278、302、326、350、374、398、422、446、470、494、518、542、566、590、614、 638、662、686、710和734、或一種與其實質(zhì)上相似具有至少90%、至少95%、至少98%或至 少99%序列同一性的序列。在一個實施方案中，該重鏈和輕鏈CDR序列是SEQ ID NO: 52、 54、56、60、62、64 ;76、78、80、84、86、88 ;124、126、128、132、134、136 ;220、222、224、228、 230、232 ;244、246、248、252、254、256 及 316、318、320、324、326、328。在一個較特殊的實 施方案中，該重鏈和輕鏈CDR序列是SEQ ID N0:76、78、80、84、86、88 ;或220、222、224、228、 230、232。
[0019] 在一個相關(guān)的實施方案中，本發(fā)明包括一種與hPCSK9特異性結(jié)合的抗體或抗體 的抗原結(jié)合片段，其中該抗體或抗體片段包含位于選自下列一組序列的重鏈和輕鏈序列 對內(nèi)的重鏈和輕鏈 CDR 域；SEQ ID N0:2/10、18/20、22/24、26/34、42/44、46/48、50/58、 66/68、70/72、74/82、90/92、94/96、98/106、114/116、118/120、122/130、138/140、142/144、 146/154、162/164、166/168、170/178、186/188、190/192、194/202、210/212、214/216、 218/226.234/236.238/240.242/250.258/260.262/264.266/274.282/284.286/288. 290/298、306/308、310/312、314/322、330/332、334/336、338/346、354/356、358/360、 362/370、378/380、382/384、386/394、402/404、406/408、410/418、426/428、430/432、 434/442.450/452.454/456.458/466.474/476.478/480.482/490.498/500.502/504. 506/514、522/524、526/528、530/538、546/548、550/552、554/562、570/572、574/576、 578/586、594/596、598/600、602/610、618/620、622/624、626/634、642/644、646/648、 650/658、666/668、670/672、674/682、690/692、694/696、698/706、714/716、718/720、 722/730、738/740和742/744。在一個實施方案中，該CDR序列位于選自下列一組氨基酸序 列對的HCVR 和 LCVR 域內(nèi)；SEQ ID N0:50/58、66/68、70/72、74/82、90/92、94/96、122/130、 138/140、142/144、218/226、234/236、238/240、242/250、258/260、262/264、314/322、 330/332和334/336。在一個較特殊的實施方案中，該CDR序列位于選自下列一組氨基酸序 列對的 HCVR 和 LCVR 域內(nèi)；SEQ ID N0:90/92 或 218/226。
[0020] 在一個實施方案中，本發(fā)明提供了一些與hPCSK9特異性結(jié)合且中和其活性的完 全人單克隆抗體（mAbs)或其抗原結(jié)合片段，其中該抗體或其片段顯示了一個或多個如下 特征： (i) 相對于給藥前水平，能夠使血清總膽固醇含量下降至少約25至35%并保持該種下 降趨勢達(dá)至少24天，較佳的是使血清總膽固醇含量下降至少約30至40% ; (ii) 相對于給藥前水平，能夠使血清LDL膽固醇含量下降至少約65至80%并保持該 種下降趨勢達(dá)至少24天； (iii) 相對于給藥前水平，能夠使血清甘油H醋含量下降至少約25至40% ; (iv) 不降低血清皿L膽固醇含量，或相對于給藥前水平降低血清皿L膽固醇含量不超 過5% ; (V)與包含hPCSK9(SEQ ID N0:755)的氨基酸殘基238的表位結(jié)合； (Vi)相對于抑7. 4條件下，在抑5. 5時，表面等離子體共振測量顯示hPCSK9的結(jié)合 親和力（Kd)增強，親和力增加至少約20倍至50倍； (vii) 與人、人GOF突變D374Y、縣猴、恒河猴、小鼠、大鼠W及倉鼠的PCSK9結(jié)合； (viii) 包含含有SEQ ID N0:80和88的重鏈和輕鏈CDR3序列； (ix) 包含選自SEQ ID NO: 90和92的CDR序列。
[0021] 在一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種與hPCSK9特異性結(jié)合及中和其活性的完 全人單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段，其中該抗體或其片段顯示了一個或多個如下特征： (i) 相對于給藥前水平，能夠使血清LDL膽固醇含量下降至少約40至70%并保持該種 下降趨勢達(dá)至少60天或90天； (ii) 相對于給藥前水平，能夠使血清甘油H醋含量下降至少約25至40% ; (iii) 不降低血清皿L膽固醇含量，或相對于給藥前水平降低血清皿L膽固醇含量不超 過5%。 (iv) 與包含hPCSK9(SEQ ID N0:755)的氨基酸殘基366的表位結(jié)合； (V)經(jīng)表面等離子體共振技術(shù)測量，未顯示在酸性抑條件下與PCSK9的結(jié)合親和力比 在中性抑條件下有所增強； (Vi)與人和猴的PCSK9結(jié)合，但不與小鼠、大鼠或倉鼠的PCSK9結(jié)合； (vii)包含含有SEQ ID NO: 224和232的重鏈和輕鏈CDR3序列； (viU)包含選自SEQ ID N0:218和226的CDR序列。
[0022] 在第H方面，本發(fā)明提供了編碼抗PCSK9抗體或其片段的核酸分子。本發(fā)明還包 括運載本發(fā)明核酸的重組表達(dá)載體，W及引入該類載體的宿主細(xì)胞，并包括一些在允許產(chǎn) 生抗體和收集所產(chǎn)生抗體的條件下通過培養(yǎng)宿主細(xì)胞而生產(chǎn)抗體的方法。
[0023] 在一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種抗體或其片段，其包含一個由選自下列序 列的核酸序列編碼的 HCVR ;SEQ ID N0:l、17、21、25、41、45、49、65、69、73、89、93、97、113、 117、121、137、141、145、161、165、169、185、189、193、209、213、217、233、237、241、257、261、 265、281、285、289、305、309、313、329、333、337、353、357、361、377、381、385、401、405、409、 425、429、433、449、453、457、473、477、481、497、501、505、521、525、529、545、549、553、569、 573、577、593、597、601、617、621、625、641、645、649、665、669、673、689、693、697、713、717、 72U737和741，或一種與其實質(zhì)上相似具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序 列同源性的序列。在一個實施方案中，該HCVR是由選自下列序列的核酸序列編碼的；SEQ ID N0:49、65、69、73、89、93、121、137、141、217、233、237、241、257、261、313、329 和 333。在 一個較特殊的實施方案中，該HCVR是由選自下列序列的核酸序列編碼的；SEQ ID N0:89和 217。
[0024] 在一個實施方案中，該抗體或其片段進(jìn)一步包含一個由選自下列一組序列的核酸 序列編碼的 LCVR ;沈Q ID N0:9、19、23、33、43、47、57、67、71、81、91、95、105、115、119、129、 139、143、153、163、167、177、187、191、201、211、215、225、235、239、249、259、263、273、283、 287、297、307、311、321、331、335、345、355、359、369、379、383、393、403、407、417、427、431、 441、451、455、465、475、479、489、499、503、513、523、527、537、547、551、561、571、575、585、 595、599、609、619、623、633、643、647、657、667、671、681、691、695、705、715、719、729、739 和 743,或一種與其實質(zhì)上相似具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同源性 的序列。在一個實施方案中，該LCVR是由選自下列一組序列的核酸序列編碼的；SEQ ID NO:57、67、71、81、91、95、129、139、143、225、235、239、249、259、263、321、331 和 335。在一個 較特殊的實施方案中，該LCVR是由選自下列序列的核酸序列編碼的；SEQ ID NO:91和225。
[0025] 在一個實施方案中，本發(fā)明的特點是一種抗體或抗體的抗原結(jié)合片段，其包含一 個由選自下列序列的核巧酸序列編碼的HCDR3域；SEQ ID N0:7、31、55、79、103、127、151、 175、199、223、247、271、295、319、：343、367、391、415、439、463、487、511、535、559、583、607、 631、655、679、703和727,或一種與其實質(zhì)上相似具有至少90%、至少95%、至少98%或至 少99%序列同源性的序列；W及一個由選自下列序列的核巧酸序列編碼的LCDR3域；SEQ ID N0:15、39、63、87、lll、135、159、183、207、231、255、279、303、327、351、375、399、423、 447、471、495、519、543、567、591、615、639、663、687、711 和 735,或一種與其實質(zhì)上相似具 有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同源性的序列。在一個實施方案中， 該HCDR3和LCDR3序列是由下列核酸序列分別編碼的；SEQ ID N0:55/63、79/87、127/135、 223/23U247/255和319/327。在一個較特殊的實施方案中，該HCDR3和LCDR3序列對是由 下列核酸序列編碼的；SEQ ID N0:79/87和223/231。
[0026] 在一個進(jìn)一步的實施方案中，該抗體或其片段進(jìn)一步包含一個由選自下列一組序 列的核巧酸序列編碼的 HCDR1 域；SEQ ID N0:3、27、51、75、99、123、147、171、195、219、243、 267、291、315、339、363、387、411、435、459、483、507、531、555、579、603、627、651、675、699 和 723,或一種與其實質(zhì)上相似具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性 的序列；一個由選自下列一組序列的核巧酸序列編碼的HCDR2域；SEQ ID N0;5、29、53、77、 101、125、149、173、197、221、245、269、293、317、：341、365、389、413、437、461、485、509、533、 557、581、605、629、653、677、701和725,或一種與其實質(zhì)上相似具有至少90%、至少95%、 至少98%或至少99%序列同源性的序列；一個由選自下列一組序列的核巧酸序列編碼的 LCDR1 域；SEQ ID N0:11、35、59、83、107、131、155、179、203、227、251、275、299、323、：M7、 371、395、419、443、467、491、515、539、563、587、611、635、659、683、707 和 731，或一種與其 實質(zhì)上相似具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同源性的序列；W及一 個由選自下列一組序列的核巧酸序列編碼的LCDR2域；SEQ ID N0:13、37、61、85、109、133、 157、181、205、229、253、277、301、325、：349、373、397、421、445、469、493、517、541、565、589、 613、637、661、685、709和733,或一種與其實質(zhì)上相似具有至少90%、至少95%、至少98% 或至少99%序列同源性的序列。在一個實施方案中，該重鏈和輕鏈CDR序列是由下列核酸 序列編碼的；SEQ ID N0:51、53、55、59、61、63 ;75、77、79、83、85、87 ;123、125、127、131、133、 135 ;219、221、223、227、229、231 ;243、245、247、251、253、255 ; W及 315、317、319、323、325、 327。在一個較特殊的實施方案中，該重鏈和輕鏈CDR序列是由下列核酸序列編碼的；SEQ ID N0:75、77、79、83、85、87 及 219、221、223、227、229、231。
[0027] 在第四個方面，本發(fā)明的特點是一種與hPCSK9特異性結(jié)合的分離的抗體或抗體 的抗原結(jié)合片段，其包含一個HCDR3和一個LCDR3,其中HCDR3包含一個結(jié)構(gòu)式為Xi-X 2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X 9-Xi°-Xii-Xi2-X"-X"-X"-Xi6-Xi7-Xi8-Xi 9-X2° 的氨基酸序列（SEQ ID N0:747)， 其中Xi是Ala來是Arg或Lys龍是Asp成是Ser或lie來是Asn或Val片6是Leu或 了巧擊是Gly或Met犀是Asn或Val來是化e或Tyr班°是Asp ;X"是Leu或Met班2是 Asp或缺位；X"是Tyr或缺位；X"是Tyr或缺位；X"是Tyr或缺位；X"是Tyr或缺位；X" 是Gly或缺位；公 8是Met或缺位；公9是Asp或缺位，W及X2°是Val或缺位；LCDR3包含一 個結(jié)構(gòu)式為Xi-X 2-X3-X4-X5-X6-X 7-X8-X9的氨基酸序列（SEQ ID NO: 750)，其中XI是Gin或 Met ;X2 是 Gin ;X3 是 Tyr 或！'虹；X4 是 Tyr 或 Leu ;X5 是 T虹或 Gin ;X6 是！'虹；X7 是 Pro ;X8 是Tyr或Leu, W及X9是"T虹。
[0028] 在一個進(jìn)一步的實施方案中，該抗體或其片段進(jìn)一步包含一個結(jié)構(gòu)式為 Xl-X2-X 3-X4-X5-x6-X7-X8的肥DRl序列（SEQIDN0:745)，其中Xl是Gly;X 2是化e;X3是I'虹； X4是化e ;X5是Ser或Asn ;X6是Ser或Asn ;X7是Tyr或His ; W及X8是Ala或T巧；一個結(jié) 構(gòu)式為 Xi-X2-X3-X4-X5-X6-X 7-X8 的 HCDR2 序列（SEQ ID N0:746);其中 Xi 是 Ile;X2 是 Ser 或 Asn來是Gly或Gin成是Asp或Ser來是Gly弁是Ser或Gly擊是T虹或Glu ; W及X? 是 T虹或 Lys ;-個結(jié)構(gòu)式為 Xi-X2-X3-X4-X5-X6-X 7-X8-X9-XW-Xii-Xi2 的 LCDR1 序列（SEQ ID NO: 748)，其中 Xi 是 Gin ;X2 是 Ser ;X3 是 Val 或 Leu ;X4 是 Leu ;X5 是 His 或 Tyr ;X6 是 Arg 或 Ser擊是Ser或Asn并是Asn或Gly來是Asn班°是Arg或Asn ;X"是Asn或Tyr ; W及 Xi2是Phe或缺位；一個結(jié)構(gòu)式為Xi-X2-X3的LCDR2序列（SEQ ID NO: 749)，其中Xi是T巧或 Leu ;X2是Ala或Gly ; W及X3是Ser。圖1顯示了 316P和300N mAbs的重鏈和輕鏈可變域 的序列比對。
[0029] 在第五個方面，本發(fā)明的特點是一種人抗PCSK9抗體或抗體的抗原結(jié)合片段，其 包含一個由衍生自Vh、Dh和Jh種系序列的核巧酸序列片段編碼的重鏈可變區(qū)化CVR)，W及 一個由衍生自Vk和Jk種系序列的核巧酸序列片段編碼的輕鏈可變區(qū)（LCVR)，其中該種系 序列是（a) Vh基因片段3-23、Dh基因片段7-27、Jh基因片段2、Vk基因片段4-1 W及Jk基 因片段2 ;或化)Vh基因片段3-7、Dh基因片段2-8、Jh基因片段6、Vk基因片段2-28 W及Jk 基因片段4。
[0030] 在第六個方面，本發(fā)明的特點是一種與PCSK9蛋白（SEQ ID NO:755)結(jié)合的抗體 或其抗原結(jié)合片段，其中該抗體或其片段與一種變異PCSK9蛋白的結(jié)合比抗體或其片段與 SEQ ID N0:755的PCSK9蛋白之間的結(jié)合低50%。在一個特殊的實施方案中，該抗體或其 抗原結(jié)合片段與該變異PCSK9蛋白的結(jié)合親和力（Kd)比與PCS腳(SEQ ID NO: 755)的結(jié)合 力低約50%、低約60%、低約70%、低約80%、低約90%或低約95%。
[0031] 在一個實施方案中，該變異PCSK9蛋白在SEQ ID NO: 755的238位包含至少一個突 變。在一個較特殊的實施方案中，該突變?yōu)镈238R。在一個實施方案中，相對于野生型蛋白 SEQ ID NO: 755,該抗體或抗體片段與變異PCSK9蛋白的結(jié)合親和力至少低90%，其中該變 異蛋白在殘基238處包含一個突變。在一個實施方案中，相對于野生型蛋白SEQ ID N0:755， 該抗體或抗體片段與變異PCSK9蛋白的結(jié)合親和力至少低80%，其中該變異蛋白在一個或 一個W上殘基153、159、238和343處包含一個突變。在一個較特殊的實施方案中，該突變 是 S153R、E159R、D238R 和 D：M3R 之一。
[0032] 在一個實施方案中，該變異PCSK9蛋白在SEQ ID NO: 755的366位包含至少一個突 變。在一個較特殊的實施方案中，該突變?yōu)镋366K。在一個實施方案中，相對于野生型蛋白 SEQ ID NO: 755,該抗體或抗體片段與變異PCSK9蛋白的結(jié)合親和力至少低95%，其中該變 異蛋白在殘基366處包含一個突變。在一個實施方案中，相對于野生型蛋白SEQ ID N0:755， 該抗體或抗體片段與變異PCSK9蛋白的結(jié)合親和力至少低70%、80%或90%，其中該變異 蛋白在一個或一個W上殘基147、366和/或380處包含一個突變。在一個較特殊的實施方 案中，該突變是S147F、E36服和V380M之一。
[0033] 本發(fā)明包括具有一種經(jīng)修飾的糖基化模式的抗PCSK9抗體。在某些應(yīng)用中，進(jìn)行 修飾W除去某些不希望的糖基化位點也許是有益的，或例如除去巖藻糖基W提高抗體依賴 性細(xì)胞毒性（ADCC)功能（參閱aiield et al. (2002) JBC 277:26733)。在其它一些應(yīng)用 中，為了改變補體依賴性細(xì)胞毒性（CDC)，可進(jìn)行半乳糖基化的修飾。
[0034] 在第走個方面，本發(fā)明之特點是一種含有與hPCSK9特異性結(jié)合的重組人抗體或 其片段W及一種藥學(xué)上可接受載體的藥物組合物。在一個實施方案中，本發(fā)明之特點是 一種組合物，它是本發(fā)明之抗體或抗體的抗原結(jié)合片段和第二種治療劑的結(jié)合。第二種 治療劑可為與本發(fā)明之抗體或其片段有利地結(jié)合的任何藥劑，例如，一種通過抑制3-輕 基-3-甲基戊二醜（HMG)-輔酶A(CoA)還原酶能夠誘導(dǎo)膽固醇合成的細(xì)胞清除的藥劑，例 如西利維司?。╟erovastatin)、阿巧伐他?。╝torvastatin)、辛伐他?。╯imvastatin)、匹 伐他?。╬itavastin)、瑞舒伐它汀（rosuvastatin)、氣伐他?。╢luvastatin)、洛伐他汀 (lovastatin)、普伐他?。╬ravastatin)等；能夠抑制膽固醇吸收和/或膽汁酸再吸收的藥 劑；能夠增加脂蛋白分解代謝的藥劑（如煙酸）；和/或在膽固醇如22-輕基膽固醇的清除 過程中起作用的LXR轉(zhuǎn)錄因子的活化劑。
[00巧]在第八個方面，本發(fā)明的特點是一些用本發(fā)明之抗PCSK9抗體或抗體的抗原結(jié)合 片段抑制hPCSK9活性的方法，其中該治療方法包括施用一種療效量的含有本發(fā)明之抗體 或抗體的抗原結(jié)合片段的藥物組合物。所治療的疾病是通過除去、抑制或降低PCSK9的活 性而得到改善、減輕、抑制或預(yù)防的任何疾病或癥狀。可W本發(fā)明之方法治療的具體人群包 括需要LDL血漿置換的患者、PCSK9激活突變（獲得功能的突變，即G0F)的患者、雜合家族 性高膽固醇血癥患者化eFH);不耐受抑制素或抑制素?zé)o法控制的原發(fā)性高膽固醇血癥患 者；W及具有患高膽固醇血癥的危險但可進(jìn)行預(yù)防性治療的患者。其它癥狀包括與次要原 因如II型糖尿病相關(guān)的血脂異常、膽汁郁積型肝病（原發(fā)性膽汁性肝硬變化）、腎病綜合 征、甲狀腺機能減退、服胖癥；W及動脈粥樣硬化和也血管疾病的預(yù)防和治療。
[0036] 在本發(fā)明之方法的一些特殊的實施方案中，本發(fā)明之抗hPCSK9抗體或抗體片段 可用于降低偏高的總膽固醇、非皿L膽固醇、LDL膽固醇、和/或載脂蛋白B (載脂蛋白B100) 的含量。
[0037] 本發(fā)明之抗體或抗體片段可單獨使用或與第二種藥劑如一種HMG-CoA還原酶的 抑制劑和/或其它降低脂質(zhì)的藥物結(jié)合使用。
[0038] 其它的實施方案包括將如上所定義的抗體或抗體的抗原結(jié)合片段用于減輕或抑 制PCSK9介導(dǎo)的疾病或病癥。
[0039] 本發(fā)明包括在用于減輕或抑制PCSK9介導(dǎo)的疾病或病癥的藥劑的制造過程中，使 用如上所定義的抗體或抗體的抗原結(jié)合片段。在一些特殊的實施方案中，其中PCSK9介導(dǎo) 的疾病或癥狀是高膽固醇血癥、高血脂癥、需要LDL血漿置換、雜合家族性高膽固醇血癥、 抑制素不耐受癥、抑制素?zé)o法控制、具有患高膽固醇血癥的危險、血脂異常、膽汁郁積型肝 病、腎病綜合征、甲狀腺機能減退、服胖癥、動脈粥樣硬化W及也血管疾病。
[0040] 在閱讀W下詳細(xì)敘述的過程中，其它的實施方案將變得很明顯。 附圖的簡要說明
[0041] 圖1 ;重鏈（A)和輕鏈做可變區(qū)和抗體Hm316P和化M300N的CDR序列比較表。 [004引 圖2 ;血清中抗體濃度隨時間的變化。316P 5mg/kg( □ ) ;300N 5mg/kg( 0 ) ;316P 15mg/kg0 ;300N 15mg/kg(參）。
[0043] 圖3 緩衝液對照變化百分比表示的血清總膽固醇水平。對照0 ;316P 5mg/ kgO ；300N 5mg/kg() ；316P 15mg/kg( □ ) ；300N 15mg/kg(A)〇
[0044] 圖4 ;化緩衝液對照變化百分比表示的血清LDL膽固醇水平。對照0 ;316P 5mg/ kgO ；300N 5mg/kg() ；316P 15mg/kg( □ ) ；300N 15mg/kg(A)〇
[0045] 圖5 ;相對于緩沖液對照歸一化的血清LDL膽固醇水平。緩衝液對照0 ;316P 5mg/kg() ；300N 5mg/kg() ；316P 15mg/kg( □ ) ；300N 15mg/kg(A)〇
[0046] 圖6 ;化緩衝液對照變化百分比表示的血清皿L膽固醇水平。對照0 ;316P 5mg/ kgO ；300N 5mg/kg() ；316P 15mg/kg( □ ) ；300N 15mg/kg(A)〇
[0047] 圖7 ;化緩衝液對照變化百分比表示的血清甘油H醋水平。緩衝液對照0 ;316P 5mg/kg() ；300N 5mg/kg() ；316P 15mg/kg( □ ) ；300N 15mg/kg(A)〇
[0048] 圖8 ;單劑量皮下注射后，W從基線的變化百分比表示的血清LDL膽固醇水平。 316P 5mg/kg〇 ;300N 5mg/kg(參）。
[0049] 圖9 ;單劑量皮下注射后血清抗體濃度隨時間的變化。316P 5mg/kg( ? ) ;300N 5mg/kg 0。
[0050] 圖10 :小鼠總肝勻漿LDL受體的西方印跡試驗。于注射PBS(l-3行）、5mg/ kg 316P (4-6 行）或 5mg/kg 非 hPCSK9 特異性 mAb (7-8 行）后 24 小時，W 及 1. 2mg/kg hPCSK9-mmh (所有行）注射后4小時取樣。
[005。 圖11 ;316P對PCSK9hu/hu小鼠體內(nèi)血清LDL膽固醇水平的響。緩沖液對照（0 ; 316P Img/kg (冒）；316P 5mg/kg (囲）；316P lOmg/kg (|||)。
[005引 圖12 ;C57化/6小鼠的抗hPCSK9mAb血清藥代動力學(xué)特性。單劑量注射：對照I mAb0 為 lOmg/kg ;316P0 為 lOmg/kg W及 300NQ 為 lOmg/kg。
[0053] 圖13 ;hPCSK9雜合小鼠的抗hPCSK9mAb血清藥代動力學(xué)特性；單劑量lOmg/kg ;對 照 I mAbO ;316P〇 和 300NQ。
[0054] 圖14 ;316P對喂W正常飼料的敘利亞倉鼠體內(nèi)血清LDL膽固醇水平的影響。緩沖 液對照（參）；316P Img/kgO ;316P 3mg/kg〇 ;316P 5mg/kg〇。 本發(fā)明的詳細(xì)說明
[00巧]在描述本發(fā)明的方法之前，應(yīng)該理解，本發(fā)明并非局限于所描述的具體方法和實 驗條件，因為該些方法和條件是可W改變的。還應(yīng)理解，本文所用的術(shù)語僅出于描述具體實 施方案的目的，并非意在限制本發(fā)明，因為本發(fā)明之范圍僅受所附權(quán)利要求書的限制。
[0056] 除非另有定義，本文所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語將具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技 術(shù)人員通常所理解的相同含義。盡管與本文所述的方法和材料類似或相當(dāng)?shù)娜魏畏椒ê筒?料都可用于本發(fā)明之實施或試驗，但現(xiàn)將描述的是首選的方法和材料。 定義
[0057] 本文所用的術(shù)語"人類前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草溶菌素9"或"hPCS腳"是指具有SEQ ID NO: 754所示核酸序列和SEQ ID NO: 755所示氨基酸序列或其生物活性片段的hPCSK9。
[005引本文所用的術(shù)語"抗體"意指由四條多膚鏈即兩條重鏈化）和兩條輕鏈（L) W二 硫鍵相互連接而組成的免疫球蛋白分子。每條重鏈均由一個重鏈可變區(qū)（HCVR或VH)和一 個重鏈恒定區(qū)組成（由CH1、C肥和C冊域組成）。每條輕鏈均由一個輕鏈可變區(qū)（LCVR或 VL)和一個輕鏈恒定區(qū)（CL)組成。VH和化區(qū)可進(jìn)一步分成被稱為互補決定區(qū)（CDR)的高 變區(qū)，其中散布著保存性更好的被稱為框架區(qū)（FR)的區(qū)域。每個VH和化均由H個CDR和 四個FR組成，從氨基端到駿基端按W下順序排列；FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。
[0059] -個或多個CDR殘基的取代或一個或多個CDR的刪除也是可能的。在科學(xué)文獻(xiàn) 中已經(jīng)敘述了其中一個或兩個CDR被刪除W用于結(jié)合的抗體。化dlan et al. (1995FASEB J. 9:133-139)基于已發(fā)表的晶體結(jié)構(gòu)，分析了抗體及其抗原之間的接觸域，并得出結(jié)論， 只有約五分之一至H分之一的CDR殘基與抗原實際接觸。化dlan還發(fā)現(xiàn)了許多抗體，其 中一個或兩個CDR不含與抗原接觸的氨基酸（還可參閱Vajdos et al.2002J Mol Biol 320:415-428)。
[0060] 不接觸抗原的CDR殘基可基于先前的研究利用分子模擬和/或根據(jù)經(jīng)驗從位于 化othia CDR域外的K油at CDR域識別（例如CDR肥中的冊0-冊5殘基往往是不需要的）。 如果一個CDR或其殘基被刪除，通常它會被另一人抗體序列或該類序列共有區(qū)內(nèi)占據(jù)相應(yīng) 位置的氨基酸取代。CDR和氨基酸內(nèi)的取代位置也可根據(jù)經(jīng)驗選擇。經(jīng)驗取代可W是保守 的或不保守的取代。
[0061] 本文所用的術(shù)語"人抗體"意在包括含有衍生自人種系免疫球蛋白序列的可變區(qū) 和恒定區(qū)的抗體。本發(fā)明之人mAbs抗體可包括不是由人種系免疫球蛋白序列編碼的氨 基酸殘基（例如通過體外隨機誘變或位點特異性誘變或通過體內(nèi)體細(xì)胞突變而引入的突 變），例如可在CDR中尤其是在CDR3中包括該樣的氨基酸殘基。但是，本文所用的術(shù)語"人 抗體"并不意在包括其中衍生自另一哺乳動物物種如小鼠的CDR序列被嫁接到人構(gòu)架序列 上的mAbs抗體。
[0062] "特異性結(jié)合"或類似術(shù)語意為一個抗體或抗原結(jié)合片段與一個在生理條件下相 對穩(wěn)定的抗原形成復(fù)合體。特異性結(jié)合可W-個至少約1x1(T6m或更小的平衡離解常數(shù)來 描述（例如一個較小的Kd就意味著較緊密的結(jié)合）。確定兩個分子是否特異性結(jié)合的方法 是本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知的，包括例如平衡透析、表面等離子體共振等方法。但是，特異性結(jié)合 hPCSK9的分離抗體對于其它抗原如來自其它物種的PCSK9分子可顯示交叉反應(yīng)性。然而， 與hPCSK9及一個或一個W上其它抗原結(jié)合的多特異性抗體（例如雙特異性抗體）依然被 認(rèn)為是"特異性結(jié)合"hPCSK9的抗體，如本文所用。
[0063] 術(shù)語"高親和力"抗體是指經(jīng)表面等離子共振技術(shù)例如BIAC0RE?或溶液親和 ELISA法測定，與hPCSK9的結(jié)合親和力為至少l〇-i°M、較佳的是l〇-iiM、更佳的是1〇-i 2M的 mAbs抗體。
[0064] 術(shù)語"慢離解速率（slow off rate) "、"Koff"或"kd"是指經(jīng)表面等離子共振技 術(shù)例如BIAC0RE?測定，W lx 1(T3s4或更低、較佳的是W lx 1(T4s4或更低的速率常數(shù)從 hPCSK9離解的抗體。
[0065] 本文所用的抗體的"抗原結(jié)合部分"（或簡稱"抗體片段"）該一術(shù)語是指抗體中 一個或多個保持了與hPCSK9特異性結(jié)合能力的片段?？贵w片段可包括一個Fab片段、一個 F(ab'）2片段、一個Fv片段、一個dAb片段、一個含有CDR的片段，或一個分離的CDR。
[0066] 本發(fā)明的具體實施方案、抗體或抗體片段可與一種治療基團（"免疫偶聯(lián)物"）如 細(xì)胞毒素、化療藥物、免疫抑制劑或放射性同位素等偶聯(lián)。
[0067] 本文所用的"分離抗體"意指實質(zhì)上不含其它具有不同抗原特異性的mAbs的抗 體（例如特異性結(jié)合hPCSK9的分離抗體就在實質(zhì)上不含能特異性結(jié)合hPCSK9之外抗原的 mAbs)。但是，特異性結(jié)合hPCSK9的分離抗體對于其它抗原如來自其它物種的PCSK9分子 可具有交叉反應(yīng)性。
[006引本文所用的"中和抗體"（或"中和PCSK9活性的抗體"）意指其與hPCSK9的結(jié)合 將導(dǎo)致PCSK9的至少一種生物活性被抑制的抗體。PCSK9生物活性的該種抑制可通過W本 領(lǐng)域內(nèi)眾所周知的若干標(biāo)準(zhǔn)體外或體內(nèi)測定法中一種或多種方法測定PCSK9生物活性的 一個或多個指標(biāo)進(jìn)行評估（參閱下文的實施例）。
[0069] 本文所用的術(shù)語"表面等離子共振"是指一種光學(xué)現(xiàn)象?；谠摲N光學(xué)現(xiàn)象可利 用例如 BIAC0RE? 系統(tǒng)（Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden and Piscataway,NJ) 來檢測生物傳感器基質(zhì)中蛋白質(zhì)濃度的變化，從而對實時生物特異性相互作用進(jìn)行分析。
[0070] 本文所用的術(shù)語"Kd"意指特定的抗體-抗原相互作用的平衡離解常數(shù)。
[0071] 術(shù)語"表位"是指抗原中與抗體結(jié)合的區(qū)域。表位可定義為結(jié)構(gòu)性表位或功能性 表位。功能性表位通常是結(jié)構(gòu)性表位的一個亞型，并具有直接影響相互作用親和力的殘基。 表位可W是構(gòu)象表位，即由非線性氨基酸組成。在某些實施方案中，表位可包括決定簇，后 者是分子的化學(xué)活性表面基團，如氨基酸、糖側(cè)鏈、磯醜基類或賴醜基類；在某些實施方案 中，表位可具有特定的H維結(jié)構(gòu)特征和/或特定的電荷特征。
[0072] 術(shù)語"本質(zhì)上同一性"或"本質(zhì)上相同"當(dāng)指核酸或其碎片時，表示當(dāng)W適當(dāng)?shù)暮饲?酸插入或刪除與另一個核酸（或其互補鏈）最佳比對時，用下述任何著名的算法如FASTA、 BLAST或GAP測量，至少具有90%的核巧酸堿基序列相同性，更首選的是至少具有95%、 96 %、97 %、98 %或99 %的核巧酸堿基序列相同性。
[0073] 當(dāng)應(yīng)用于多膚時，術(shù)語本質(zhì)上相似"指兩個膚序列用諸如GAP或BESTFIT等程序 的預(yù)設(shè)間隙重量達(dá)排列到最佳比對時，兩者至少有90%的序列相同性，更首選的是至少有 95%、98%或99%的序列相同性。首選的是，不相同的殘基位置的差別僅在于保守的氨基酸 取代。"保守的氨基酸取代"是指該樣一種取代，即一個氨基酸殘基被另一個含有化學(xué)性質(zhì) (例如電荷或疏水性）相似側(cè)鏈化基團）的氨基酸殘基所取代。一般來說，保守的氨基酸 取代不會在實質(zhì)上改變蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)。在兩個或更多的氨基酸序列相互之間的差別僅 在于某些保守取代的情況中，可將序列相似性程度向上調(diào)整，W針對取代的保守特性作出 校正。進(jìn)行該種調(diào)整的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。參閱例如化arson(1994)Methods Mol. Biol. 24:307-331。含有化學(xué)性質(zhì)相似側(cè)鏈的氨基酸類別的實例包括；1)脂族側(cè)鏈：甘 氨酸、丙氨酸、額氨酸、亮氨酸和異亮氨酸；2)脂族輕基側(cè)鏈：絲氨酸和蘇氨酸；3)含醜胺側(cè) 鏈：天冬氨酸和谷氨醜胺；4)芳族側(cè)鏈：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；5)堿性側(cè)鏈：賴氨酸、 精氨酸和組氨酸；和6)含硫側(cè)鏈；天冬氨酸鹽和谷氨酸鹽，W及7)含硫側(cè)鏈；半脫氨酸和 甲硫氨酸。首選的保守氨基酸取代基是；額氨酸-亮氨酸-異亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、 賴氨酸-精氨酸、丙氨酸-精氨酸、丙氨酸-額氨酸、谷氨酸-天冬氨酸和天冬醜胺-谷氨 醜胺?；蛘撸Ｊ氐娜〈荊onnet et al. (1992)Science 256:144345中所公開的PAM250 對數(shù)似然矩陣（PAM2501og-l化elihood matrix)中任何正值的變化。"中度保守的"取代是 PAM250對數(shù)似然矩陣中非負(fù)值的任何變化。
[0074] 多膚的序列相似性通常用序列分析軟件來測量。蛋白質(zhì)分析軟件是用指定給各種 取代（包括保守氨基酸取代）、缺失和其它修飾的相似性程度對相似的序列進(jìn)行比對。例 如，GCG軟件含有諸如"GAP"和"邸STFIT"的程序，可W默認(rèn)參數(shù)使用該些程序，W確定緊密 相關(guān)的多膚例如來自不同生物物種的同源多膚之間的序列同源性或序列同一性，或者野生 型蛋白質(zhì)及其突變蛋白之間的序列同源性或序列同一性。參閱例如GCG Version 6. 1。還可 W用GCG Version 6. 1中的FASTA程序W默認(rèn)參數(shù)或推薦參數(shù)來比較多膚序列。FASTA(例 如FASTA2和FASTA3)能提供被查詢序列和被搜索序列之間的最佳重迭區(qū)域的比對和序列 同一性百分?jǐn)?shù)（Pearson(2000)，出處同上）。當(dāng)將本發(fā)明之序列與含有大量的源自不同生 物的序列的數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較時，另一首選的算法是BLAST計算機程序，尤其是BLASTP或 TBLASTN，使用默認(rèn)參數(shù)。參閱如Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:40:3410及（1997) Nucleic Acids Res. 25:3389402.
[0075] 在一些特殊的實施方案中，本發(fā)明之方法所使用的抗體或抗體片段可為單特異 性、雙特異性或多特異性。多特異性抗體可W針對同一目標(biāo)多膚的不同表位，或可含有針對 一個W上目標(biāo)多膚之表位的抗原結(jié)合域。可用于本發(fā)明的代表性雙特異性抗體形式涉及使 用第一個免疫球蛋白（Ig)C冊結(jié)構(gòu)域和第二個Ig C冊結(jié)構(gòu)域，其中第一個和第二個Ig 013 結(jié)構(gòu)域相互之間相差至少一個氨基酸，且與無氨基酸差別的雙特異性抗體相比，其中至少 一個氨基酸的差別降低了雙特異性抗體與蛋白A的結(jié)合力。在一個實施方案中，第一個Ig C冊結(jié)構(gòu)域與蛋白A結(jié)合，第二個Ig C冊結(jié)構(gòu)域包含一個降低或消除與蛋白A結(jié)合的突變， 例如一個H95R修飾（按照IMGT表現(xiàn)序列編號法；按照歐盟編號法則為H435R)。第二個C冊 結(jié)構(gòu)域可進(jìn)一步包含一個Y96F修飾（按照IMGT編號法；按照歐盟編號法則為Y436巧?？?在第二個C冊域內(nèi)找到的其它修飾包括：在IgGlmAbs的情況下為D16E、L18M、M4S、K52N、 V57M和V82I (按照IMGT編號法；按照歐盟編號法則為D356E、L358M、N384S、K392N、V397M 和V422I);在IgG2mAbs的情況下為M4S、K52N和V82I (按照IMGT編號法；按照歐盟編號 法則為 N384S、K392N 和 V422I) 及在 IgG4mAbs 情況下為 Q15R、M4S、K52N、V57M、R69K、 E79Q和V82I (按照IMGT編號法；按照歐盟編號法則為Q355R、N384S、K392N、V397M、R409K、 E419Q和V422I)。上述雙特異性抗體的各種變化形式均被認(rèn)為是在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
[0076] "有效治療量"該一短語意為對受藥對象能產(chǎn)生所需作用的量。確切的劑量將取 決于治療的目的，并可由本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員使用已知技術(shù)確定（例如參閱Lloyd(1999)化e Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding)。 人抗體的制備
[0077] 在轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)產(chǎn)生人抗體的方法是眾所周知的（例如參閱美國第6, 596, 541 號專利，Regeneron Wiarmaceuticals，VELOCIMMraE?)。VEL0CIMMU肥? 技術(shù)涉及到該樣 一種轉(zhuǎn)基因小鼠的產(chǎn)生；該小鼠的基因組包含一些與內(nèi)源小鼠恒定區(qū)基因座有效地連接 (oper油ly linked)的人重鏈和輕鏈可變區(qū)，使得該小鼠能響應(yīng)抗原刺激而產(chǎn)生一種包含 人可變區(qū)和小鼠恒定區(qū)的抗體。將編碼該抗體的重鏈和輕鏈的可變區(qū)的DNA分離出來，并 與編碼人重鏈和輕鏈恒定區(qū)的DNA有效地連接。然后在能夠表達(dá)完全人抗體的細(xì)胞中表達(dá) 該DNA。在具體的實施方案中，該細(xì)胞是一種C冊細(xì)胞。
[0078] 抗體可在治療過程中用于阻斷配體-受體之間的相互作用或抑制受體組分之間 的相互作用，而不是通過固定補體和參與補體依賴性細(xì)胞毒性（CDC)來殺滅細(xì)胞，或通過 抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性（ACDC)來殺滅細(xì)胞。因此，抗體的恒定區(qū)對于抗體固定補 體和介導(dǎo)細(xì)胞依賴性細(xì)胞毒性的能力是重要的。因此，可根據(jù)是否需要抗體介導(dǎo)細(xì)胞毒性 來選擇抗體的同型。
[0079] 人抗體可W兩種與較鏈異質(zhì)性有關(guān)的形式存在。在一種形式中，抗體分子包含一 種約150-160kDa的穩(wěn)定的四鏈構(gòu)建物，其中兩個二聚體通過一個重鏈間的二硫鍵連接在 一起。在第二種形式中，該二聚體不是通過重鏈間的二硫鍵連接在一起，而是形成了一種由 共價偶聯(lián)的輕鏈和重鏈（半抗體）組成的約75-80kDa的分子。該兩種形式的分離一直極 為困難，甚至在親和純化之后也是如此。
[0080] 第二種形式在各種完整IgG同型中的出現(xiàn)頻率，是由于但不限于與抗體的較鏈區(qū) 同型相關(guān)的結(jié)構(gòu)差異。人IgG4較鏈的較鏈區(qū)之單個氨基酸取代可將第二種形式（Angal et al. (1993)Molecular Immunology30:105)的出現(xiàn)頻度顯著地降低到利用人IgGl較鏈所觀 察到的水平。本發(fā)明包括在較鏈區(qū)、C肥區(qū)或C冊區(qū)中含有一個或多個突變的抗體。所述 的突變可能是合乎需要的，例如在生產(chǎn)中用于提高所需抗體形式的產(chǎn)率。
[0081] 通常，用所研究抗原沖擊致敏VELOCIMMTOE?小鼠，并從表達(dá)抗體的小鼠回收淋己 細(xì)胞（如B細(xì)胞）。淋己細(xì)胞可與一個骨髓瘤細(xì)胞系融合來制備永生雜交瘤細(xì)胞系，然后 對該種雜交瘤細(xì)胞系進(jìn)行篩選，W識別能產(chǎn)生對相關(guān)抗原具有特異性之抗體的雜交瘤細(xì)胞 系?？蓪⒕幋a重鏈和輕鏈可變區(qū)的DNA分離出來，并與合乎需要的重鏈和輕鏈的同型恒定 區(qū)連接。該種抗體蛋白可在一種細(xì)胞如CK)細(xì)胞中產(chǎn)生。另外，編碼抗原特異的嵌合抗體 或輕鏈和重鏈可變域的DNA可直接從抗原特異的淋己細(xì)胞中分離出來。
[0082] 首先，分離包含一個人可變區(qū)和一個小鼠恒定區(qū)的抗體的高親和力嵌合抗體。如 下所述，根據(jù)所需的特點，包括親和力、選擇性、表位等鑒定和選擇抗體。用合乎需要的人 恒定區(qū)取代小鼠恒定區(qū)，W產(chǎn)生本發(fā)明之完全人抗體，例如野生型的或經(jīng)修飾的IgGl或 IgG4(例如SEQ ID N0:751、752、753)。所選擇的恒定區(qū)可根據(jù)特定的用途而改變，而高親 和力抗原結(jié)合特性和祀標(biāo)特異性特性則存在于可變區(qū)中。 表位作圖和相關(guān)技術(shù)
[0083] 為篩選能與特定表位結(jié)合的抗體（例如能阻斷I班與其高親和力受體結(jié)合的抗 體），可進(jìn)行常規(guī)的交聯(lián)-阻斷分析，如 Antibodies, Harlow and Lane (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harb.，NY)中所述。其它方法包括丙氨酸掃描突變體分析、膚印跡分析 巧eineke(2004)Methods Mol Biol 248:443-63)或膚切割分析。另外，還可采用諸如抗原 的表位切除、表位提取和化學(xué)修飾的方法（Tomer (2000)Protein Sciences ;487-496)。
[0084] 術(shù)語"表位"是指抗原上B細(xì)胞和/或T細(xì)胞對其作出響應(yīng)的位點。B細(xì)胞表位可 由她連的氨基酸形成，或者由通過蛋白質(zhì)的H級折迭而并列在一起的非她連氨基酸形成。 由她連氨基酸形成的表位在接觸變性溶劑時通?？傻肳保留，而通過H級折迭形成的表位 在用變性溶劑處理時通常會失去。表位通常包括至少3個、更經(jīng)常是至少5個或8-10個W 獨特空間構(gòu)象出現(xiàn)的氨基酸。
[0085] 修飾輔助概況分析（Modification-Assisted Profiling, MAP)，也被稱為基于抗原 結(jié)構(gòu)的抗體譜分析（Antigen Struc1:ure-based Antibody Profiling, ASAP)，是一種根據(jù) 每種抗體與經(jīng)化學(xué)或酶學(xué)修飾的抗原表面的結(jié)合狀況的相似性對大量的抗同一抗原的單 克隆抗體（mAbs)進(jìn)行分類的方法（美國專利2004/0101920號）。每一類均可反映與另一 類所代表的表位截然不同或部分重迭的獨特表位。該種技術(shù)可W快速過濾遺傳上相同的 mAbs,從而可使鑒定工作集中在遺傳上不同的mAbs上。當(dāng)應(yīng)用于雜交瘤篩選時，MAP有助 于鑒定某些罕見雜交瘤克隆，后者能產(chǎn)生具有所需特性的mAbs。MAP可用來將本發(fā)明的抗 PCSK9mAbs抗體分類成結(jié)合不同表位的mAbs抗體組。
[0086] 在各種各樣的實施方案中，抗hPCSK9抗體或抗體的抗原結(jié)合片段與催化域（SEQ ID NO: 755的約153至425)內(nèi)的一個表位結(jié)合；更具體的是，與從約153至約250或從約 250至約425的片段內(nèi)的一個表位結(jié)合；更具體的是，本發(fā)明之抗體或抗體片段與從約153 至約208、從約200至約260、從約250至約300、從約275至約325、從約300至約360、從約 350至約400,和/或從約375至約425的片段內(nèi)一個表位結(jié)合。
[0087] 在各種各樣的實施方案中，抗hPCSK9抗體或抗體的抗原結(jié)合片段與前膚域（SEQ ID NO: 755的31至152殘基）內(nèi)的一個表位結(jié)合；更具體的是，與從約31殘基至約90殘 基或從約90殘基至約152殘基內(nèi)一個表位結(jié)合；更具體的是，本發(fā)明之抗體或抗體片段與 從約31殘基至約60殘基、從約60殘基至約90殘基、從約85殘基至約110殘基、從約100 殘基至約130殘基、從約125殘基至約150殘基、從約135殘基至約152殘基，和/或從約 140殘基至約152殘基的片段內(nèi)的一個表位結(jié)合。
[0088] 在某些實施方案中，抗hPCSK9抗體或抗體的抗原結(jié)合片段與C端域（SEQ ID NO: 755的426至692殘基）內(nèi)的一個表位結(jié)合；更具體的是，與從約426殘基至約570殘 基或從約570殘基至約692殘基內(nèi)一個表位結(jié)合；更具體的是，本發(fā)明之抗體或抗體片段與 從約450殘基至約500殘基、從約500殘基至約550殘基、從約550殘基至約600殘基，和 /或從約600殘基至約692殘基的片段內(nèi)的一個表位結(jié)合。
[0089] 在某些實施方案中，抗體或抗體片段與一個表位結(jié)合，該表位包括催化域、前膚域 或C端域內(nèi)和/或兩個或H個不同域內(nèi)的一個W上所列舉表位（例如催化域和C端域內(nèi)， 或前膚域和催化域內(nèi)，或前膚域、催化域和C端域內(nèi)的表位）。
[0090] 在某些實施方案中，該抗體或抗原結(jié)合片段與包含hPCSK9(SEQ ID NO:755)的氨 基酸殘基238的hPCSK9上的一個表位結(jié)合。實驗結(jié)果（表27)顯示，當(dāng)D238發(fā)生突變時， mAb 316P的Kd顯示結(jié)合親和力下降>400倍（?1x10-^9M至?410x1(T9M)且Ti/2下降>30 倍（從?37至?Imin)。在一個特殊的實施方案中，該突變是D238R。在某些實施方案中， 本發(fā)明之抗體或抗原結(jié)合片段與在153、159、238和343位置上含有兩個或兩個W上氨基酸 殘基的hPCSK9的一個表位結(jié)合。
[0091] 如下所示，氨基酸殘基153、159或343的突變導(dǎo)致了親和力下降約5至10倍或Ti/2 類似的縮短。在一些特殊的實施方案中，突變?yōu)镾153R、E159R和/或D343R。
[0092] 在某些實施方案中，該抗體或抗原結(jié)合片段與包含hPCSK9(SEQ ID NO:755)的氨 基酸殘基366的hPCSK9上的一個表位結(jié)合。實驗結(jié)果（表27)顯示，當(dāng)E366發(fā)生突變時， mAb 300N的親和力顯示約50倍的下降（?.7x10-^9M至?36x1(T9M)且Ti/2也類似地縮短 (從?120至?2min)。在一個特殊的實施方案中，該突變是E366K。
[0093] 本發(fā)明包括與本文所述的任何特殊代表性抗體一樣與表位結(jié)合的抗PCSK9抗體。 類似地，本發(fā)明還包括與本文所述的任何特殊代表性抗體在與PCSK9或PCSK9片段結(jié)合過 程中競爭的抗PCSK9抗體。
[0094] 使用本領(lǐng)域內(nèi)已知的常規(guī)方法，可W容易地確定一種抗體是否與本發(fā)明之對照抗 PCSK9抗體一樣與同樣的表位結(jié)合，或在結(jié)合過程中競爭。例如，為了確定一種試驗抗體是 否與本發(fā)明之對照抗PCSK9抗體一樣與同樣的表位結(jié)合，讓該對照抗體與PCSK9蛋白或膚 在飽和條件下結(jié)合。然后，評估試驗抗體與該PCSK9分子結(jié)合的能力。如果該試驗抗體在 與對照抗PCSK9抗體飽和結(jié)合之后能夠與PCSK9結(jié)合，就可得出結(jié)論，該試驗抗體和對照抗 PCSK9抗體與不同的表位結(jié)合。在另一方面，如果該試驗抗體在與對照抗PCSK9抗體飽和結(jié) 合之后不能與PCSK9分子結(jié)合，那么該試驗抗體就可與本發(fā)明之對照抗PCSK9抗體所結(jié)合 的同一表位結(jié)合。
[0095] 為了確定一種抗體是否與對照抗PCSK9抗體在結(jié)合過程中競爭，在兩個方向?qū)嵤?上述結(jié)合方法；在第一個方向，讓對照抗體與PCSK9分子在飽和條件下結(jié)合，然后評估試驗 抗體與該PCSK9分子的結(jié)合。在第二個方向，讓試驗抗體與PCSK9分子在飽和條件下結(jié)合， 然后評估對照抗體與該PCSK9分子的結(jié)合。如果在該兩個方向只有第一個（飽和）抗體能 夠與PCSK9分子結(jié)合，那就可W得出結(jié)論，該試驗抗體與對照抗體在與PCSK9結(jié)合的過程中 競爭。如同本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員所能理解的，與對照抗體在結(jié)合過程中競爭的抗體未必與對照 抗體所結(jié)合的同一表位結(jié)合，但可與一個重迭或鄰近的表位結(jié)合而在空間上阻斷該對照抗 體。
[0096] 如果每個抗體競爭性地抑制（阻斷）另一抗體與抗原的結(jié)合，兩個抗體就會與同 一或重迭的表位結(jié)合。換言之，一種1倍、5倍、10倍、20倍或100倍過量的抗體將抑制另一 抗體的結(jié)合達(dá)至少50%，但較佳的是75%，90%或甚至99%，如競爭結(jié)合分析所測量（參閱 例如Jun曲ans et al. , Cancer Res. 199050 ; 1495-1502)。或者，如果抗原中降低或消除一 種抗體結(jié)合的幾乎所有的氨基酸突變能降低或消除另一種抗體的結(jié)合，則兩種抗體具有相 同的表位。如果降低或消除一種抗體結(jié)合的某些氨基酸突變也能降低或消除另一種抗體的 結(jié)合，則兩種抗體具有重迭的表位。
[0097] 然后可進(jìn)行其它常規(guī)實驗（例如膚突變和結(jié)合分析）W確定是否觀察到的試驗抗 體的結(jié)合不足實際上是由于與對照抗體所結(jié)合的同一表位結(jié)合，或是否空間阻斷（或另一 現(xiàn)象）是觀察到的結(jié)合不足的原因。該類實驗可采用ELISA、RIA、表面等離子體共振技術(shù)、 流式細(xì)胞計量法或本領(lǐng)域內(nèi)所具備的任何其它定量或定性的抗體結(jié)合分析。
[0098] 在一個特殊的實施方案中，本發(fā)明包括一種抗PCSK9抗體或抗體的抗原結(jié)合片 段，它與序列號為SEQ ID NO: 755的PCSK9蛋白結(jié)合，其中該抗體或其片段與PCS腳和PCS腳 蛋白變體之間的結(jié)合低于該抗體或片段與序列號為SEQ ID N0:755的PCSK9蛋白之間的結(jié) 合的50%。在一個特殊的實施方案中，該PCSK9蛋白變體在153、159、238和343位置包含 至少一個殘基突變。在一個更特殊的實施方案中，至少一個突變是S153R、E159R、D238R和 D343R。在另一個特殊的實施方案中，該PCSK9蛋白變體包含至少一個位于366的突變。在 一個特殊的實施方案中，該PCSK9蛋白變體在147、366和380位置包含至少一個殘基突變。 在一個更特殊的實施方案中，該突變是S147F、E36服和/或V380M。 免疫偶聯(lián)物
[0099] 本發(fā)明包括一種與治療基團（"免疫偶聯(lián)物"）如細(xì)胞毒素、化療藥物、免疫抑制 劑或放射性同位素等偶聯(lián)的人抗PCSK9單克隆抗體。細(xì)胞毒素包括任何損害細(xì)胞的試劑。 適宜于形成免疫偶聯(lián)物的細(xì)胞毒素和化療劑的例子是本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知的。參閱如wo 05/103081。 雙特異性
[0100] 本發(fā)明之抗體可W是單特異性的、雙特異性的，或多特異性的。多特異性mAbs抗 體可W針對同一目標(biāo)多膚的不同表位，或可含有針對一個W上目標(biāo)多膚的抗原結(jié)合域。參 閱，如 l\itt et al. (1991) J. Immunol. 147:60-69。人抗 PCS腳mAb,抗體可連接到另一個功 能分子，如另一個膚或蛋白質(zhì)上，或與之共同表達(dá)。例如，一種抗體或其片段可與一種或多 種其它分子實體如另一種抗體或抗體片段實現(xiàn)功能性（例如W化學(xué)偶聯(lián)、基因融合、非共 價鍵連接或其它方式）連接，W產(chǎn)生具有第二種結(jié)合特異性的雙特異性或多特異性抗體。
[0101] 可用于本發(fā)明的代表性雙特異性抗體形式涉及使用第一個免疫球蛋白（Ig)c冊 結(jié)構(gòu)域和第二個Ig C冊結(jié)構(gòu)域，其中第一個和第二個Ig C冊結(jié)構(gòu)域相互之間相差至少一 個氨基酸，且與無氨基酸差別的雙特異性抗體相比，其中至少一個氨基酸的差別降低了雙 特異性抗體與蛋白A的結(jié)合力。在一個實施方案中，第一個Ig CH3結(jié)構(gòu)域與蛋白A結(jié)合， 第二個Ig C冊結(jié)構(gòu)域含有一個降低或消除與蛋白A結(jié)合的突變，例如一個H95R修飾（按 照IMGT表現(xiàn)序列編號法；按照歐盟編號法則為H435R)。第二個C冊結(jié)構(gòu)域可進(jìn)一步包含 一個Y96F修飾（按照IMGT編號法；按照歐盟編號法則為Y436巧?？稍诘诙€C冊域內(nèi)找 到的其它修飾包括；在IgGl抗體的情況下為D16E、L18M、M4S、K52N、V57M和V82I (按照 IMGT 編號法；按照歐盟編號法則為 D356E、L358M、N384S、K392N、V397M 和 V422I);在 IgG2 抗體的情況下為N44S、K52N和V82I (按照IMGT編號法；按照歐盟編號法則為N384S、K392N 和 V422I) ; W及在 IgG4 抗體的情況下為 Q15R、M4S、K52N、V57M、R69K、E79Q 和 V82I (按照 IMGT 編號法；按照歐盟編號法則為 Q355R、N384S、K392N、V397M、R409K、E419Q 和 V422I)。 上述雙特異性抗體的各種變化形式均被認(rèn)為是在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。 生物等效物
[0102] 本發(fā)明之抗PCSK9抗體和抗體片段包括某些蛋白，該些蛋白含有不同于所述mAbs 抗體的氨基酸序列的氨基酸序列，但保留了與人PCSK9結(jié)合的能力。當(dāng)與母體序列比較時， 該類變異的mAbs抗體和抗體片段包含一個或多個氨基酸的添加、缺失或取代，但顯示了與 所述mAbs抗體的生物活性基本上相當(dāng)?shù)纳锘钚?。類似地，?dāng)與所披露序列比較時，本發(fā) 明之編碼抗PCSK9抗體的DNA序列含有的序列包含一個或多個核巧酸的添加、缺失或取代， 但可編碼與本發(fā)明之抗PCSK9抗體或抗體片段基本上生物等效的抗PCSK9抗體或抗體片 段。該類變異氨基酸和DNA序列的實例已在上面討論。
[0103] 如果兩種抗原結(jié)合蛋白或抗體是醫(yī)藥等效物或醫(yī)藥替代物，當(dāng)在相似實驗條件下 無論W單劑或W多劑方式W相同摩爾劑量給藥時，其吸收速率和程度均未顯示顯著差別， 則它們被認(rèn)為是生物等效的。某些抗體如果它們的吸收程度相當(dāng)?shù)账俾什幌喈?dāng)，它們 將被認(rèn)為是等效物或藥物替代物，并仍可被認(rèn)為是生物等效的，因為該種吸收速率的差別 是有意設(shè)計的并反映在標(biāo)簽上，該種差別對于達(dá)到有效的體內(nèi)藥物濃度是非關(guān)鍵性的（例 如對于慢性用途），并被認(rèn)為對于所研究的特定醫(yī)藥產(chǎn)品在醫(yī)學(xué)上是無關(guān)重要的。在一個實 施方案中，如果兩種抗原結(jié)合蛋白在安全性、純度和藥效方面沒有臨床意義上的差別，則它 們是生物等效的。
[0104] 在一個實施方案中，如果一名患者可W在對照產(chǎn)品和生物產(chǎn)品之間轉(zhuǎn)換一次或多 次而不良副作用的風(fēng)險并未如預(yù)期那樣增加，包括與無該種轉(zhuǎn)換的連續(xù)治療相比在免疫原 性方面無顯著的臨床變化或效率降低，則兩種抗原結(jié)合蛋白就是生物等效的。
[0105] 在一個實施方案中，如果兩種抗原結(jié)合蛋白在使用條件下都W-種或多種共同的 作用機制起作用，且該類機制是眾所周知的，則它們就是生物等效的。
[0106] 生物等效性可W體內(nèi)和體外的方法演示。生物等效性的測量包括，例如，（a) -種 在人類或其它哺乳類動物體內(nèi)的試驗，其中血液、血漿、血清或其它生物體液中抗體或其代 謝物的濃度是作為時間的函數(shù)測定的；化）一種體外試驗，該試驗已與人的體內(nèi)試驗生物 利用率數(shù)據(jù)建立相關(guān)聯(lián)系并可根據(jù)人的體內(nèi)試驗生物利用率數(shù)據(jù)合理預(yù)測；（C) 一種人類 或其它哺乳類動物的體內(nèi)試驗，其中抗體（或其目標(biāo)）適當(dāng)?shù)募毙运幚碜饔檬亲鳛闀r間的 函數(shù)測定的；W及（d) -種控制良好的臨床試驗，該試驗確定抗體的安全性、有效性，或生 物利用率或生物等效性。
[0107] 本發(fā)明抗PCSK9抗體的生物等效變體可通過例如取代生物活性不需要的各種殘 基或序列或刪除生物活性不需要的端部或內(nèi)部殘基或序列而構(gòu)建。例如，對于生物活性并 非必需的半脫氨酸殘基可被刪除或被其它氨基酸取代，W防在復(fù)原時形成不必要或不正確 的分子內(nèi)二硫化物橋。 治療群體
[0108] 本發(fā)明提供了一些治療方法W治療需要使用本發(fā)明組合物的人類患者。盡管改 變生活方式和常規(guī)藥物治療往往能成功地降低膽固醇水平，但并非所有患者都能用該些手 段達(dá)到推薦的目標(biāo)膽固醇水平。盡管積極地采用常規(guī)治療，但各種各樣的癥狀，如家族性 高膽固醇血癥（FH)，似乎會抵制降低LDL-C水平的措施。純合和雜合家族性高膽固醇血 癥患者化oFH、he即）是與過早出現(xiàn)的動脈粥樣硬化血管疾病相關(guān)的癥狀。但是，診斷為 hoFH的患者在很大程度上對常規(guī)的藥物治療無反應(yīng)且只有有限的治療選擇。具體來說，采 用抑制膽固醇合成和上調(diào)肝臟LDL受體而降低LDL-C的抑制素進(jìn)行治療，對LDL受體不存 在或有缺陷的患者效果甚小。據(jù)最近報道，在用最高劑量抑制素治療的基因型確定的hoFH 患者中，平均LDkC下降還不到20%。在此治療方案基礎(chǔ)上增加lOmg/日的依澤替米貝 (ezetimibe)導(dǎo)致LDL-C水平總共下降了 27%，但離最佳效果仍然相距甚遠(yuǎn)。類似地，許 多患者對抑制素?zé)o反應(yīng)、用抑制素治療對病情的控制較差，或不能耐受抑制素治療；一般來 說，該些患者用其它治療方式不能達(dá)到對膽固醇的控制。對于能克服現(xiàn)有治療措施之缺點 的新治療方法有著很大的尚未滿足的需要。
[0109] 可W本發(fā)明之方法治療的具體人群包括需要LDL血漿置換的患者、PCSK9激活 佑0巧突變的患者、雜合家族性高膽固醇血癥患者化eFH);不耐受抑制素或抑制素?zé)o法控 制的原發(fā)性高膽固醇血癥患者；W及具有患高膽固醇血癥的危險但可進(jìn)行預(yù)防性治療的患 者。 治療給藥和配方
[0110] 本發(fā)明提供了一些含有本發(fā)明之抗PCSK9抗體或其抗原結(jié)合片段的治療組合物。 本發(fā)明之治療組合物將與適宜的載體、賦形劑W及其它加入配方中改善轉(zhuǎn)移、遞送、耐受性 等的制劑一起施用。在藥劑化學(xué)師所熟知的處方集里可W找到大量的適宜配方。雷氏藥學(xué) 大全：Remington'S Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA.。該 些配方包括，如粉劑、糊劑、油膏、凝膠、蠟劑、油劑、脂類、含有脂（陽離子或陰離子）的泡囊 (如LIPO陽CTIN?)、DNA偶聯(lián)物、無水吸收性糊劑、水包油或油包水乳劑、乳膠狀碳蠟（各種 分子量的聚己二醇）、半固體狀凝膠W及含有聚己二醇的半固體狀混合物。還可參閱化well et al. Compendium of Excipients for Parenteral Formulations (非腸道用配方口武形齊 概論），PDA (1998) J Wiarm Sci Technol 52:238-311。
[0111] 其劑量可根據(jù)即將受藥的受試者的年齡和體形大小、目標(biāo)疾病、病癥、給藥途徑等 因素而改變。當(dāng)本發(fā)明之抗體用于治療與PCSK9相關(guān)的各種病癥和疾病，包括高膽固醇血 癥、與LDL和載脂蛋白B相關(guān)的疾病，W及脂質(zhì)代謝疾病等時，對于一名成年患者來說W靜 脈輸入本發(fā)明之抗體是有利的。通常是按照約0. 01至約20mg/kg體重，較佳的是按照約 0. 02至7、約0. 03至約5,或約0. 05至約3mg/kg體重的單一劑量輸入。取決于病癥的嚴(yán)重 程度，治療的頻率和持續(xù)時間可W調(diào)節(jié)。
[0112] 各種給藥系統(tǒng)是眾所周知的并可用于本發(fā)明之醫(yī)藥組合物的給藥，例如封裝于脂 質(zhì)體、微粒、微膠囊中、能表達(dá)突變體病毒的重組細(xì)胞、受體介導(dǎo)的胞吞作用（參閱例如Wu et al. (1987) J. Biol. Chem. 262:4429-4432)。給藥方法包括但不限于皮內(nèi)、肌內(nèi)、腹腔內(nèi)、 靜脈、皮下、經(jīng)鼻、硬膜外W及經(jīng)口給藥。該組合物可W任何方便的途徑給藥，例如，輸注或 快速注射，經(jīng)上皮或粘膜（例如口腔黏膜、直腸和腸黏膜等）吸收，并可與其它生物活性劑 一起給藥。給藥方式可W是全身性或局部性的。
[0113] 該醫(yī)藥組合物也可W微囊尤其是脂質(zhì)體形式給藥（參閱Langer(1990)Science 249:1527-1533 ;Treat et al. (1989)in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer(脂質(zhì)體用于傳染病和癌癥治療），Lopez-Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, pp. 353-365 ;Lopez-Berestein, ibid. , pp. 317-327 ;-般參 閱同上）。
[0114] 在某些情況下，該醫(yī)藥組合物可W-種控制性釋放系統(tǒng)給藥。在一個實施方案中， 可使用一個粟（參閱 Sefton (1987) CRC Grit. Ref. Biomed. E；ng. 14:201)。在另一個實施方 案中，可采用聚合物材料；參閱 Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds. ), CRC Pres. , Boca Raton, Florida (1974)。在又一個實施方案中，可將一 種控制釋放系統(tǒng)置于該組合物目標(biāo)的附件，從而只需要全身性劑量的一部分（參閱例如， Goodson, in Medical Applications of Controlled Release (控制釋放的醫(yī)學(xué)應(yīng)用），出 處同上，vol. 2, pp. 115-138, 1984)。
[0115] 可注射制劑可包括靜脈注射、皮下、皮內(nèi)和肌內(nèi)注射、滴注輸液等劑型。該些可注 射制劑可W公知的方法制備。例如，可W將上述抗體或其鹽溶解、息浮或乳化在無菌水介質(zhì) 或通常用于注射的油性介質(zhì)中，W此方式制備該可注射制劑。作為注射用的水介質(zhì)有例如 生理鹽水、含葡萄糖和其它助劑的等滲溶液等，可結(jié)合使用適當(dāng)?shù)脑鋈軇?，如醇（如己醇）?多元醇（如丙二醇、聚己二醇），非離子型表面活性劑[例如聚山梨醇醋80、肥0-50 (氨化 當(dāng)麻油的聚氧己帰（50摩爾）加合物）]等。作為油性介質(zhì)，可采用例如芝麻油、豆油等，可 結(jié)合使用增溶劑，如苯甲酸苯甲醋、苯甲醇等。如此制備的注射液最好是裝入一種適當(dāng)?shù)陌?流瓶中。本發(fā)明之醫(yī)藥組合物可用標(biāo)準(zhǔn)的針頭和針筒經(jīng)皮下或靜脈注射。此外，對于皮下 給藥，一種筆型給藥裝置可方便地用于本發(fā)明之醫(yī)藥組合物的給藥。該種筆型給藥裝置可 W重復(fù)使用或一次性使用?？芍貜?fù)使用的筆型給藥裝置一般采用一種可更換的含醫(yī)藥組合 物的藥筒。一旦藥筒內(nèi)所有醫(yī)藥組合物均已輸出、藥筒變空，則可方便地丟棄空藥筒，并用 一個含醫(yī)藥組合物的新藥筒取代。該筆型給藥裝置就可重復(fù)使用。在一次性使用的筆型給 藥裝置中，沒有可更換的藥筒。而是，該一次性使用的筆型給藥裝置有一個預(yù)先充滿醫(yī)藥組 合物的膽液器。一旦該膽液器內(nèi)藥物組合物用完，整個裝置則被丟棄。
[0116] 許多可重復(fù)使用的筆型和自動注射給藥裝置已用于本發(fā)明之醫(yī)藥組合物的皮 下給藥。其例子包括但當(dāng)然不限于AUT0PEN?(Owen Mumford, Inc. , Woodstock,英國）、 DISETRONIC? 筆值isetronic Medical Systems, Bur曲dorf?，瑞±)、HUMAL0G MIX 75/25? 筆、HUMALOG?筆、HUMALIN 70/30?筆巧li Lilly and Co.，印第安納州印第安納波利 斯）、NOVO陽N?I、II 和 III 型（Novo Nordisk，哥本哈根，丹麥）、NOVO陽N JUNI0R?(Novo Nordisk,哥本哈根，丹麥）、抓?筆炬ecton Dickinson,新澤西州富蘭克林湖）、0PTI陽N?、 0PTI陽N PRO?、0PTI陽N STARLET?, W及 0PTI化IK?(sanofi-aventis，德國法蘭克福），此 處僅列舉幾個品牌。用于本發(fā)明之醫(yī)藥組合物皮下給藥的一次性使用的筆型給藥裝置的 例子包括但當(dāng)然不限于 S0L0STAR? 筆（sanofi-aventis)，F(xiàn)LEXPEN?(Novo Nordisk)，W及 KWIKPEN?巧li Lilly)。
[0117] 有利的是，上述口服或注射用醫(yī)藥組合物是制備成單位劑量的劑型，W包含一定 劑量的活性成分。該種單位劑量的劑型包括例如片劑、丸劑、膠囊、注射液（安流）、栓劑等。 單位劑量的上述抗體含量一般為每劑約5至約500mg ;尤其是注射劑型，首選的是上述抗體 含量為約5至約lOOmg，其它劑型中抗體含量為約10至約250mg。
[0118] 本發(fā)明提供了一些治療方法，其中將本發(fā)明之抗體或抗體片段用于治療各種涉 及hPCSK9的高膽固醇血癥。本發(fā)明之抗PCSK9抗體或抗體片段對于高膽固醇血癥及類似 病癥的治療是尤其有用的。復(fù)合療法可包括本發(fā)明之抗PCSK9抗體與例如一種或多種藥 劑結(jié)合，該藥劑（1)通過抑制3-輕基-3-甲基戊二醜（HMG)-輔酶A(CoA)還原酶能夠誘 導(dǎo)膽固醇合成的細(xì)胞清除，如西利維司?。╟erivastatin)、阿巧伐他?。╝torvastatin)、 辛伐他?。╯imvastatin)、匹伐他?。╬itavastatin)、瑞舒伐它?。╮osuvastatin)、氣伐 他?。╢luvastatin)、洛伐他?。╨ovastatin)、普伐他?。╬ravastatin);似能夠抑制膽 固醇吸收和/或膽汁酸再吸收；（3)能夠增加脂蛋白分解代謝（如煙酸）及在膽固醇 如22-輕基膽固醇的清除過程中起作用的LXR轉(zhuǎn)錄因子的活化劑，或一種固定的結(jié)合如 依澤替米貝（ezetimibe)加辛伐他汀（simvastatin); -種抑制素加膽汁樹脂（如消膽胺 (cholestyramine)、降脂樹脂 II (colestipol)、考來維侖（colesevelam)，煙酸與一種抑制 素的固定結(jié)合（如煙酸加洛伐他汀）；或與其它降脂質(zhì)藥劑如歐米加-3-脂肪酸己醋（如 omacor)的固定結(jié)合。 實施例
[0119] 舉出W下實施例是為了向本領(lǐng)域一般技術(shù)人員就如何利用本發(fā)明之方法和組合 物提供一個完整的披露和說明，并非是為了限制被
【發(fā)明者】視為其發(fā)明的范圍。已作出許多 努力W確保所用數(shù)字的準(zhǔn)確性，但也應(yīng)考慮到某些實驗誤差和偏差。除非另有說明，分子量 是指平均分子量，溫度是指攝氏度，壓力是指大氣壓或接近大氣壓。 實施例1 ;抗人PCSK9的人抗體的產(chǎn)生
[0120] 將VEL0CIMMUNE?小鼠用人PCSK9免疫，并W抗原特異免疫測定法用該些小鼠的血 清W監(jiān)測抗原免疫反應(yīng)。從顯示較高抗hPCSK9抗體效價的免疫小鼠的脾臟收獲表達(dá)B細(xì) 胞的抗hPCSK9,并與小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合W形成雜交瘤。使用如下所述的分析法篩選該雜 交瘤W鑒定表達(dá)hPCSK9特異性抗體的細(xì)胞系。該分析法鑒定了幾種產(chǎn)生嵌合的抗hPCSK9 抗體的細(xì)胞系，該些抗體分別 W 化M300、H1M504、H1M505、H1M500、H1M497、H1M498、H1M494、 H1M309、H1M312、H1M499、H1M493、H1M496、H1M503、H1M502、H1M508、H1M495 U及 H1M492 表 7J\ 〇
[0121] 如美國專利2007/0280945A1中所述，人PCSK9特異性抗體還可從經(jīng)抗原免疫的B 細(xì)胞直接分離而不與骨髓瘤細(xì)胞融合?？寺≈劓満洼p鏈可變域W產(chǎn)生完全人抗hPCSK9抗 體，分別 W H1H313、H1H314、H1H315、H1H316、H1H317、H1H318、H1H320、化冊21 W及 H1H334 表示。表達(dá)該些抗體的穩(wěn)定的重組CK)細(xì)胞系得W確定。 實施例2 ;基因利用分析
[0122] 為了分析所產(chǎn)生mAbs的結(jié)構(gòu)，對編碼抗體可變區(qū)的核酸進(jìn)行了克隆和測序。經(jīng) N-端氨基酸測序證實了預(yù)測的可變區(qū)氨基酸序列。從mAbs的核酸序列和預(yù)測的氨基酸序 列出發(fā)，為每種抗體鏈鑒定了基因的用途。 表1
【權(quán)利要求】
1. 一種與人類前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草溶菌素9(hPCSK9)特異性結(jié)合的人抗體或人抗體的 抗原結(jié)合片段，其中所述抗體或抗原結(jié)合片段與參考抗體結(jié)合相同的表位或與參考抗體競 爭結(jié)合hPCSK9,所述參考抗體包含輕鏈和重鏈⑶R序列，所述輕鏈和重鏈⑶R序列是SEQ ID N0:76、78、80、84、86、88。
2. -種編碼權(quán)利要求1所述抗體或抗原結(jié)合片段的分離的核酸分子。
3. -種包含如權(quán)利要求2所述核酸分子的表達(dá)載體。
4. 一種產(chǎn)生抗人PCSK9抗體或抗體的抗原結(jié)合片段的方法，其步驟包括將權(quán)利要求3 所述之表達(dá)載體引入一個分離的宿主細(xì)胞，在允許抗體或其片段產(chǎn)生和收集所產(chǎn)生抗體或 其片段的條件下培養(yǎng)該細(xì)胞。
5. -種含有如權(quán)利要求1所述之抗體或抗原結(jié)合片段以及一種藥學(xué)上可接受載體的 藥物組合物。
6. 如權(quán)利要求5所述之藥物組合物，其進(jìn)一步包含第二種治療劑，該第二種治療劑選 自一種3-羥基-3-甲基戊二酰（HMG)-輔酶A(C〇A)還原酶的抑制劑、一種抑制素、一種膽 固醇吸收和/或膽汁酸再吸收的抑制劑、一種增加脂蛋白分解代謝的藥劑，或一種LXR轉(zhuǎn)錄 因子活化劑。
7. 如權(quán)利要求5或6所述的藥物組合物在制備用于治療可用PCSK9拮抗劑減輕、改善、 抑制或預(yù)防的疾病或癥狀的藥物中的用途。
8. 如權(quán)利要求7所述之應(yīng)用，其中PCSK9介導(dǎo)的疾病或癥狀選自高膽固醇血癥、高血 脂癥、需要LDL血漿置換、雜合家族性高膽固醇血癥、抑制素不耐受癥、抑制素?zé)o法控制、具 有患高膽固醇血癥的危險、血脂異常、膽汁郁積型肝病、腎病綜合征、甲狀腺機能減退、肥胖 癥、動脈粥樣硬化以及心血管疾病。
【文檔編號】C12P21/02GK104447997SQ201410749251
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2009年12月15日 優(yōu)先權(quán)日:2008年12月15日
【發(fā)明者】M·W·斯利曼, J·H·馬丁, T·T·黃, D·麥克唐納 申請人:瑞澤恩制藥公司