一種具有高抗凝活性的透明質(zhì)酸衍生物的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種具有高抗凝活性的透明質(zhì)酸衍生物的制備方法。以透明質(zhì)酸為起始物，首先用化學(xué)法制備得到N-位硫酸化透明質(zhì)酸，在此基礎(chǔ)上采用3’-磷酸腺苷-5’-磷酰硫酸酯(PAPS)再生系統(tǒng)，以6-O-硫酸基轉(zhuǎn)移酶(6-OST)和3-O-硫酸基轉(zhuǎn)移酶(3-OST)對抗凝血活性特定位點(diǎn)進(jìn)行有效的選擇性硫酸化，其次用6-O-脫硫酸基酶(6-O-sulfatase)選擇性去除與抗凝血活性無關(guān)的硫酸基，降低其電荷密度，合成得到具有高抗凝活性的透明質(zhì)酸衍生物。
【專利說明】一種具有高抗凝活性的透明質(zhì)酸衍生物的制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種具有高抗凝活性的透明質(zhì)酸衍生物的制 備方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 肝素是由己糖醛酸（L-艾杜糖醛酸、D-葡萄糖醛酸）和D-硫酸氨基葡萄糖以1-4 糖苷鍵交替形成的多糖，自1935年以來，肝素作為抗凝藥物已廣泛應(yīng)用于臨床。肝素的抗 凝血活性來自于它的一個特殊的戊糖結(jié)構(gòu)順序，這個戊糖結(jié)構(gòu)與抗凝血酶（AT-III)的結(jié) 合可以導(dǎo)致其構(gòu)象改變而被活化。對肝素這個特殊五糖結(jié)構(gòu)的微小改變都會導(dǎo)致與抗凝血 酶結(jié)合力的下降，從而顯著降低其抗凝血活性。現(xiàn)有研究表明，肝素與AT-III結(jié)合發(fā)揮抗 凝血活性取決于其戊糖活性中心的數(shù)量。戊糖結(jié)構(gòu)中N-位，3-0-位及6-0-位硫酸基參與結(jié) 合AT-III，與抗凝血活性有關(guān)；而2-0-位硫酸基和艾杜醛酸的作用尚不清楚，其中3-0-位 硫酸基尤其重要，如果缺少3-0-位硫酸基，肝素的抗凝血活性則會降低1000倍以上。另 有研究發(fā)現(xiàn)，N-位脫硫酸化肝素的抗凝、抗Flla、抗FXa活性分別是未修飾肝素的1.5%、 0. 9%、0. 1 %，說明N-位硫酸基是肝素抗凝活性所必需具有的。
[0003] 國內(nèi)外藥物研究人員嘗試用化學(xué)法對肝素的結(jié)構(gòu)改造?；瘜W(xué)法脫硫酸化可以在一 定的程度上降低肝素的副作用，但由于缺乏選擇性，導(dǎo)致活性中心數(shù)量降低，抗凝血活性大 幅降低?；瘜W(xué)法使肝素過硫酸化，理論上可能提高抗凝血活性中心的數(shù)量，從而提高其抗凝 血活性，但是由于硫酸化程度過高，導(dǎo)致其電荷密度過大，使其與血液蛋白非特異性相互作 用大幅增加，結(jié)果不僅未能增加其抗凝血活性，反而造成了更嚴(yán)重的毒副作用。通過選擇性 酶反應(yīng)則可增加抗凝血活性中心的數(shù)量，大幅度提高肝素的抗凝血活性，同時通過去硫酸 化酶，選擇性去除與抗凝血活性無關(guān)的硫酸基，降低其電荷密度，可以大幅度降低其毒副作 用。
[0004] 透明質(zhì)酸是由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰氨基葡萄糖的雙糖單位反復(fù)交替連接而成 的聚陰離子糖胺聚糖（glycosaminoglycan，GAG)，除了潤滑作用外，透明質(zhì)酸在細(xì)胞增殖、 遷移，血管生成，細(xì)胞信號傳導(dǎo)等過程中發(fā)揮重要作用。一些硫酸化的多糖具有類似肝素的 抗凝血作用，如硫酸乙酰肝素和硫酸皮膚素，且硫酸化程度越高，硫酸化多糖的抗凝血作用 越強(qiáng)，Balazs等較早利用化學(xué)法合成了硫酸化透明質(zhì)酸，并證明了其抗凝血作用。
[0005] 基于目前對肝素選擇性結(jié)構(gòu)改造的經(jīng)驗(yàn)，利用透明質(zhì)酸非硫酸化的特點(diǎn)，采用酶 法特異性的修飾與抗凝活性有關(guān)的位點(diǎn)，如3-0-位硫酸基；選擇性地去掉一些與抗凝無關(guān) 的硫酸基，如6-0-位硫酸基，、2-0-位硫酸基，就有可能合成具有高抗凝活性的透明質(zhì)酸衍 生物。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種具有高抗凝活性的透明質(zhì)酸衍生物的制備方法。
[0007] 本發(fā)明的技術(shù)方案為：以透明質(zhì)酸為起始物，首先用化學(xué)法進(jìn)行脫乙?；该髻|(zhì) 酸的制備，然后在pH9. O的條件下用硫酸化試劑進(jìn)行N-位硫酸化，在此基礎(chǔ)上采用3' -磷 酸腺苷-5' -磷酰硫酸酯（PAPS)再生系統(tǒng)，以6-0-硫酸基轉(zhuǎn)移酶出-OST)和3-0-硫酸基 轉(zhuǎn)移酶（3-0ST)對抗凝血活性特定位點(diǎn)進(jìn)行有效的選擇性硫酸化，其次用6-0-脫硫酸基酶 (6-0-sulfatase)選擇性去除與抗凝血活性無關(guān)的硫酸基，降低其電荷密度，合成得到具有 高抗凝活性的透明質(zhì)酸衍生物。
[0008] 本發(fā)明提出的具有高抗凝活性的透明質(zhì)酸衍生物的具體操作步驟如下：采用化學(xué) 酶法來實(shí)現(xiàn)合成，首先從透明質(zhì)酸出發(fā)，用化學(xué)法進(jìn)行脫乙酰化透明質(zhì)酸的制備，然后在PH 9. 0的條件下用硫酸化試劑進(jìn)行N-位硫酸化，通過AST-IV和6-0ST-1合成N-位，6-0-位 硫酸化的衍生物，并進(jìn)一步通過AST-IV和3-0ST-1合成N-乙酰氨基葡萄糖6位硫酸化的 衍生物，即得N-位，6-0-，3-0-位硫酸化透明質(zhì)酸；最后再利用6-〇-sulfatase進(jìn)行選擇性 的6_0_位脫硫酸化，最終得到3_0_，N-位硫酸化透明質(zhì)酸。
[0009] 本發(fā)明的獨(dú)到之處有兩點(diǎn)：首先從透明質(zhì)酸出發(fā)，用化學(xué)法和酶法組合最大限度 地提高抗凝血活性中心的數(shù)量，從而大幅度提高其抗凝血活性。其次用6-0-sulfatase酶 選擇性脫去與抗凝血活性無關(guān)的硫酸基，降低其活性位點(diǎn)的電荷密度。這種透明質(zhì)酸衍生 物抗凝活性高和毒副作用低，本發(fā)明將有助于拓寬透明質(zhì)酸衍生物類藥物的應(yīng)用范圍，因 此其不僅具有科學(xué)研究價值，而且將具有較大的社會價值和經(jīng)濟(jì)價值。

【具體實(shí)施方式】
[0010] 以下利用實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)說明本發(fā)明，但不能認(rèn)為是限定發(fā)明的范圍。
[0011] 實(shí)施例一：N-脫乙?；该髻|(zhì)酸的制備
[0012] 將透明質(zhì)酸溶解于2mol/L NaOH中，于60°C脫乙酰反應(yīng)18h，反應(yīng)結(jié)束后冷卻至室 溫，用2mol/L HCl調(diào)節(jié)pH至9. 0,防止脫乙?；笥捎跉滏I作用而沉淀，3500Da截留透析 袋透析，收集透析液凍干，即得脫乙?；耐该髻|(zhì)酸。
[0013] 實(shí)施例二：N-位硫酸化透明質(zhì)酸的制備
[0014] 將N位脫乙?；耐该髻|(zhì)酸溶于去離子水，于40°C分四次加入硫酸化試劑三氧化 硫批陡（總投料比為N位脫乙?；该髻|(zhì)酸：三氧化硫批陡=1:2)，每次補(bǔ)料間隔為Ih, 每次加完后用2mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至9. 5,再反應(yīng)36h后，調(diào)節(jié)pH至中性，3500Da截留透 析袋透析，收集透析液凍干，即得N-位硫酸化透明質(zhì)酸。
[0015] 實(shí)施例三：N-位，6-0-位硫酸化透明質(zhì)酸的制備
[0016] 通常酶法硫酸化反應(yīng)條件為Img N-位硫酸化透明質(zhì)酸在20ml反應(yīng)液中于室溫下 震蕩（300rpm)反應(yīng) 6h。反應(yīng)液包含 50mM Tris-HCl(pH 7.2)，1% Triton X-100，1%BSA， ImM MgCl2，lmM MnCl2，lmMPNPS，40yM PAP，8mg 6-0ST-1 及 4mg AST-IV。KKTC下加熱反應(yīng) 液十分鐘終止反應(yīng)，離心分離得到上清液，將此上清液與兩倍體積的2. 0%的NaCl水溶液 混合，對DEAE柱上樣；依次以2. 0%的NaCl水溶液和3. 0%的NaCl水溶液進(jìn)行梯度洗脫， 收集第二次洗脫所得洗脫液。所得溶液用去離子水透析24小時，凍干得N-位，6-0-位硫酸 化透明質(zhì)酸的凍干粉。
[0017] 實(shí)施例四：N-位，6-0-，3-0_位硫酸化透明質(zhì)酸的制備
[0018] 酶法硫酸化反應(yīng)條件為Img N-位，6-0-位硫酸化透明質(zhì)酸在20ml反應(yīng)液中于室 溫下震蕩（300rpm)反應(yīng) 6h。反應(yīng)液包含 50mM Tris-HCKpH 7.2)，1% Triton X-100，l% BSA，lmM MgCl2，lmM MnCl2，lmM PNPS，40yM PAP，8mg 3-0ST-1 及 4mg AST-IV。KKTC 下加 熱反應(yīng)液十分鐘終止反應(yīng)，離心分離得到上清液，將此上清液與兩倍體積的2. O %的NaCl 水溶液混合，對DEAE柱上樣；依次以2. O %的NaCl水溶液和3. O %的NaCl水溶液進(jìn)行梯度 洗脫，收集第二次洗脫所得洗脫液。所得溶液用去離子水透析24小時，凍干得N-位，6-0-， 3-0-位硫酸化透明質(zhì)酸的凍干粉。
[0019] 實(shí)施例五：3-0_，N-位硫酸化透明質(zhì)酸的制備
[0020] 將上述透明質(zhì)酸衍生物在20ml反應(yīng)液中于室溫下震蕩（300rpm)反應(yīng)6h。反應(yīng) 液包含 50mM Tris-HCl(pH 7. 2)，1 % Triton X-100，l % BSA，lmM MgCl2，lmM MnCl2，lmM CaCl2,5mg 6-〇-sulfatase。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)DEAE樹脂分離、透析、凍干得到3-〇-，N-位硫酸化 透明質(zhì)酸。
[0021] 實(shí)施例六：3-0_，N-位硫酸化透明質(zhì)酸體外抗栓和抗凝活性測定
[0022] 用底物顯色法測定。首先，用含lmg/mL BSA的PBS將凝血因子Xa、thrombin及抗 凝血酶AT-III分別稀釋為lU/mL、8U/mL及27 μ M備用。顯色底物S-2765和S-2238分別用 PBS 配成 ImM 的溶液。合成產(chǎn)物用含 50mM Tris-HCl (pH 8. 4)，7. 5mM Na2EDTA, 175mM NaCl 的緩沖液配成系列濃度（1-lOOOng/mL)的溶液。測試時，首先將25 μ L的多糖溶液和25 μ L 的AT-III溶液混合均勻，于37°C保持2分鐘。然后加入25 μ L的凝血因子Xa或thrombin 溶液，混合均勻，于37°C保持4分鐘。最后，加入25 μ L的顯色底物S-2765或S-2238,混合 均勻，并連續(xù)測定10分鐘內(nèi)405nm處的吸光度變化，比較并計(jì)算凝血因子Xa和thrombin 半抑制值IC50 (表1)。結(jié)果證實(shí)，3-0-，N-位硫酸化透明質(zhì)酸體外抗栓和抗凝活性顯著增 力口，制備得到樣品為高抗凝活性物質(zhì)。
[0023] 表1 3-0-，N-位硫酸化透明質(zhì)酸的體外抗栓、抗凝活性
[0024]

【權(quán)利要求】
1. 一種具有高抗凝活性的透明質(zhì)酸衍生物的制備方法，以透明質(zhì)酸為起始物，首先用 化學(xué)法進(jìn)行脫乙?；该髻|(zhì)酸的制備，然后在pH 9. 0的條件下用硫酸化試劑進(jìn)行N-位硫 酸化，在此基礎(chǔ)上采用3' -磷酸腺苷-5' -磷酰硫酸酯（PAPS)再生系統(tǒng)，以6-0-硫酸基轉(zhuǎn) 移酶出-OST)和3-0-硫酸基轉(zhuǎn)移酶（3-0ST)對抗凝血活性特定位點(diǎn)進(jìn)行有效的選擇性硫 酸化，其次用6-0-脫硫酸基酶（6-0-sulfatase)選擇性去除與抗凝血活性無關(guān)的硫酸基， 降低其電荷密度，合成得到具有高抗凝活性的透明質(zhì)酸衍生物。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：將透明質(zhì)酸溶解于2mol/L NaOH中，于 60°C脫乙酰反應(yīng)18h，反應(yīng)結(jié)束后冷卻至室溫，用2mol/L HC1調(diào)節(jié)pH至9. 0, 3500Da截留透 析袋透析，收集透析液凍干，將得到的脫乙?；耐该髻|(zhì)酸溶于去離子水，于40°C分四次加 入硫酸化試劑三氧化硫批陡（總投料比為N位脫乙?；该髻|(zhì)酸：三氧化硫批陡=1:2)， 每次補(bǔ)料間隔為lh，每次加完后用2mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至9. 5,再反應(yīng)36h后，調(diào)節(jié)pH至 中性，3500Da截留透析袋透析，收集透析液凍干。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：通過6-0ST-1和3-0ST-1將PAPS再生系 統(tǒng)中PAPS分子的活性硫酸基轉(zhuǎn)移到透明質(zhì)酸的特定序列位置，生成高抗凝血活性的透明 質(zhì)酸衍生物；所述PAPS再生系統(tǒng)是通過AST-IV(Arylsulfotransferase IV)的酶促反應(yīng)， 由對硝基苯酚磺酸鉀鹽（PNPS)和3' -磷酸腺苷-5' -磷酸（PAP)制備PAPS，PNPS的濃度 為 0? l-10mM，PAP 的濃度為 0? 1-50 ii M，AST-IV 的用量為 0? l-50mg/ml，優(yōu)選為 5-10mg/ml。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的方法，其特征在于：酶法硫酸化反應(yīng)條件為室溫下震 蕩（300rpm)反應(yīng) l-15h，優(yōu)選為 4-8h，反應(yīng)液包含 50mM Tris-HCl (pH 7. 2)，1 % Triton X-100,1 % BSA，lmM MgCl2，lmM MnCl2，lmM PNPS，40iiM PAP，4mg AST-IV，6-0ST-1 或 3-0ST-1的用量為0? l-50mg/mg底物，優(yōu)選為l-20mg/mg底物。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：酶法脫硫酸化反應(yīng)條件為室溫下震蕩 (300rpm)反應(yīng) 6h，反應(yīng)液包含 50mM Tris-HCl(pH 7.2)，1% Triton X-100，l%BSA，lmM MgCl2，lmM MnCl2，lmM CaCl2,5mg 6-〇-sulfatase。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1或3或5所述的方法，其特征在于：所述方法中，按照以下方法純 化酶促反應(yīng)產(chǎn)物：終止反應(yīng)后，離心分離得到上清液，將此上清液與兩倍體積的緩沖液A混 合，對DEAE柱上樣；依次以緩沖液A和緩沖液B進(jìn)行梯度洗脫，收集第二次洗脫所得洗脫 液，得到酶促反應(yīng)產(chǎn)物；所述DEAE柱分離所用的緩沖液A為含質(zhì)量百分含量為0. 5-2. 5% 的NaCl水溶液，緩沖液B為含質(zhì)量百分含量為2. 5-5. 0%的NaCl水溶液。
【文檔編號】C12P19/26GK104404110SQ201410753343
【公開日】2015年3月11日 申請日期:2014年12月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月10日
【發(fā)明者】滕麗萍, 付海田, 王敏, 陳敬華 申請人:江南大學(xué)