一種應(yīng)用大腸桿菌高效合成聚3-羥基丙酸的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種應(yīng)用大腸桿菌高效合成聚3-羥基丙酸的方法，包括(1)將工程大腸桿菌按1∶100的比例接種到含有20g/L甘油的M9液體培養(yǎng)基，加入誘導(dǎo)劑IPTG；(2)在搖瓶中添加IPTG；(3)用氯仿萃取細胞中的聚3-羥基丙酸，在氯仿溶液中加入10倍體積的冰乙醇沉淀聚3-羥基丙酸，沉淀用乙醇清洗后干燥稱重。通過本發(fā)明制得的聚3-羥基丙酸具有成本低、操作簡單、條件溫和、綠色環(huán)保等優(yōu)點；其合成工藝簡單，成本低廉，具有廣闊的應(yīng)用前景。
【專利說明】一種應(yīng)用大腸桿菌高效合成聚3-羥基丙酸的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物新材料【技術(shù)領(lǐng)域】，特別是涉及一種應(yīng)用大腸桿菌高效合成聚3-羥基丙酸的方法。

【背景技術(shù)】
[0002]3-輕基丙酸(3-hydroxyprop1nic acid，縮寫為 3-HP)分子式 C3H6O3，一種糖楽狀物質(zhì)，易溶于水、乙醇、乙醚，一般用于有機合成。從化學(xué)結(jié)構(gòu)上看，3-HP與乳酸互為同分異構(gòu)體，該分子帶有兩個官能團羥基和羧基，是很多光學(xué)活性物質(zhì)的前體。能夠作為生物源聚合物的單體，而受到各國科學(xué)家的關(guān)注。工業(yè)上，3-HP是近年來興起的一種重要的化學(xué)中間體，如3-HP可作為合成生物可降解熱塑性聚酯(PHA)的原料，合成聚3-羥基丙酸的單體及殺蟲劑。還可用于生產(chǎn)涂料、膠黏劑、水處理化學(xué)品和個人護理用品。另外，與醇酯化作用生成酯，氧化生成丙二酸，脫水生成丙烯酸，還可通過還原作用生成1，3_丙二醇等。其中1，3-丙二醇可用作溶劑、抗凍劑或保護劑以及新型聚酯-聚對苯二甲酸丙二醇酯(PTT)的單體。該聚酯具有優(yōu)良的特性，如抗紫外，抗內(nèi)應(yīng)力、低水吸附、低靜電及生物可降解，可循環(huán)利用。基于3-HP的這些優(yōu)良特性，其在商業(yè)上具有重大的開發(fā)價值。2004年8月的美國能源部報告將3-HP列為當(dāng)前世界上12種最具開發(fā)潛力的化工產(chǎn)品之一。
[0003]目前，國際上具有工業(yè)應(yīng)用前景的3-HP的合成方法主要有化學(xué)合成法和微生物發(fā)酵法。化學(xué)合成法生產(chǎn)3-HP主要有丙烯酸水合法，3-羥基丙醛氧化法，3-羥基丙腈水解法及雷福爾馬斯基(Reformatsky)反應(yīng)。
[0004]微生物發(fā)酵法的代表是美國卡吉爾(Cargill)公司和Code公司共同合作研宄了“以谷物類碳水化合物”生產(chǎn)3-HP的發(fā)酵新工藝，于2002年申請了專利。專利中論述了生產(chǎn)3-HP的兩種方法:一種是構(gòu)建基因工程菌，發(fā)酵后在胞內(nèi)或胞外得到3-HP ;另一種是直接利用酶在無細胞體系中生產(chǎn)3-HP。
[0005]微生物發(fā)酵法雖綠色環(huán)保，但設(shè)備及生產(chǎn)過程復(fù)雜且國內(nèi)發(fā)酵生產(chǎn)工藝不成熟，發(fā)酵時間較長，由于菌種的原因，生產(chǎn)出的產(chǎn)物提純過程繁瑣，產(chǎn)率也低，所得水溶液中
3-HP的含量較低。此外生物法制備得到3-HP價格昂貴且來源不足，滿足不了市場的需求，只有少量合成供實驗室使用，應(yīng)用前景有限。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)缺陷，而提供一種產(chǎn)率更高的應(yīng)用大腸桿菌高效合成聚3-羥基丙酸的方法。
[0007]為實現(xiàn)本發(fā)明的目的所采用的技術(shù)方案是:一種應(yīng)用大腸桿菌高效合成聚3-羥基丙酸的方法，包括下述步驟:
[0008](I)將工程大腸桿菌按1: 100的比例接種到含有20g/L甘油的M9液體培養(yǎng)基，并置于250ml搖瓶中，氨芐青霉素的濃度為50 μ g.ιΛ_1，37°C，225rpm條件下振蕩培養(yǎng)，當(dāng)OD6tltlnm為0.6時，在菌液中加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度0.2mmol.L-1 ；
[0009](2)然后每隔 12h，在搖瓶中添加 IPTG (0.2mM) ,b1tin (40mgL_1)和 NaHCO3 (2OmM)，誘導(dǎo)后60h終止發(fā)酵；
[0010](3)離心收集菌體，用去離子水洗滌兩次，真空干燥，用氯仿萃取細胞中的聚3-羥基丙酸。在氯仿溶液中加入10倍體積的冰乙醇沉淀聚3-羥基丙酸，沉淀用乙醇清洗后干燥稱重。
[0011]所述液體培養(yǎng)基每IL中含有20g的Glucose、6g的Na2HP04、3g的KH2P04、2g的(NH4) 2S04、0.5g 的 yeastextract、0.2g 的 MgSO4.7H20 和 30mM 的磷酸鉀緩沖液(pH7.0)。
[0012]所述液體培養(yǎng)基需要置于121°C高壓蒸汽滅菌15min。
[0013]本發(fā)明的有益效果是:通過本發(fā)明提供的生物合成方法能制得聚3-羥基丙酸具有成本低、操作簡單、條件溫和、綠色環(huán)保等優(yōu)點；其合成工藝簡單，成本低廉，具有廣闊的應(yīng)用前景。

【具體實施方式】
[0014]以下結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步詳細說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0015]實施例:
[0016]一種應(yīng)用大腸桿菌高效合成聚3-羥基丙酸的方法，包括下述步驟:
[0017](I)將活化后的工程大腸桿菌按1: 100的比例接種到含有20g/L甘油的M9液體培養(yǎng)基，并置于250ml搖瓶中，氨芐青霉素的濃度為50 μ g.ιΛ_1，37°C，225rpm條件下振蕩培養(yǎng)，當(dāng)OD6ticini^ 0.6時，在菌液中加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度0.2mmol.L-1 ；
[0018](2)然后每隔 1此，在搖瓶中添加 IPTG (0.2mM) ,b1tin (40mgL_1)和 NaHCO3 (2OmM)，誘導(dǎo)后60h終止發(fā)酵；
[0019](3)離心收集菌體，用去離子水洗滌兩次，真空干燥，用氯仿萃取，在氯仿溶液中加入10倍體積的冰乙醇沉淀聚3-羥基丙酸，得到的沉淀用乙醇清洗后干燥，即得聚3-羥基丙酸。
[0020]經(jīng)過測量，聚3-羥基丙酸產(chǎn)量為10.lg/L。
[0021]所述液體培養(yǎng)基每IL中含有20g的Glucose、6g的Na2HP04、3g的KH2P04、2g的(NH4) 2S04、0.5g 的 yeastextract、0.2g 的 MgSO4.7H20 和 30mM 的磷酸鉀緩沖液(pH7.0)。
[0022]所述液體培養(yǎng)基需要置于121°C高壓蒸汽滅菌15min。
[0023]以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當(dāng)指出的是，對于本【技術(shù)領(lǐng)域】的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種應(yīng)用大腸桿菌高效合成聚3-羥基丙酸的方法，包括下述步驟: (1)將工程大腸桿菌按1: 100的比例接種到含有20g/L甘油的M9液體培養(yǎng)基，并置于250ml搖瓶中，氨芐青霉素的濃度為50yg.mL-1，37°C，225rpm條件下振蕩培養(yǎng)，當(dāng)OD6tltol為0.6時，在菌液中加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度0.2mmol.L-1 ； (2)然后每隔12h，在搖瓶中添加 IPTG(0.2mM)、b1t in (40mgL_1)和 NaHCO3(2OmM)，誘導(dǎo)后60h終止發(fā)酵； (3)離心收集菌體，用去離子水洗滌兩次，真空干燥，用氯仿萃??；在氯仿溶液中加入10倍體積的冰乙醇沉淀聚3-羥基丙酸，得到的沉淀用乙醇清洗后干燥，即得聚3-羥基丙酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種應(yīng)用大腸桿菌高效合成聚3-羥基丙酸的方法，其特征在于所述液體培養(yǎng)基每IL中含有20g的Glucose、6g的Na2HP04、3g的KH2P04、2g的(NH4) 2S04、0.5g 的 yeastextract、0.2g 的 MgSO4.7H20 和 30mM 的磷酸鉀緩沖液(pH7.0)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種應(yīng)用大腸桿菌高效合成聚3-羥基丙酸的方法，其特征在于所述液體培養(yǎng)基需要置于121°C高壓蒸汽滅菌15min。
【文檔編號】C12R1/19GK104450807SQ201410755887
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年12月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月10日
【發(fā)明者】李申 申請人:燃點科技（天津）有限公司