一種基于磁珠與超聲分離發(fā)光標(biāo)記物的核酸檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種基于磁珠與超聲分離發(fā)光標(biāo)記物的核酸檢測方法：該方法是在磁珠表面修飾功能化手臂分子；設(shè)計用于檢測靶核酸片段的功能化探針，將功能化探針修飾于結(jié)合有功能化手臂分子的磁珠表面；通過雜交將靶核酸片段及其發(fā)光標(biāo)記物捕獲至磁珠表面；磁分離，清洗，得到已獲取發(fā)光標(biāo)記物的磁珠；通過超聲波處理等物理方法將發(fā)光標(biāo)記物從磁珠表面分離下來，對不含磁珠的發(fā)光標(biāo)記物溶液進行發(fā)光檢測，獲取靶核酸信息。本發(fā)明不僅能克服磁珠對發(fā)光信號的遮蔽效應(yīng)導(dǎo)致的發(fā)光信號損失，而且使用超聲波處理等物理方式，可以避免化學(xué)或生物方法可能導(dǎo)致的試劑失活或其他干擾，在20μL體積中能夠檢測出最少50amol核酸片段，檢測靈敏度高。
【專利說明】一種基于磁珠與超聲分離發(fā)光標(biāo)記物的核酸檢測方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生化檢測和分子診斷領(lǐng)域，尤其涉及一種基于磁珠與超聲分離發(fā)光標(biāo) 記物的核酸檢測方法。本發(fā)明可應(yīng)用于涉及超靈敏核酸分子檢測的領(lǐng)域。

【背景技術(shù)】
[0002] 近年來，由于惡性公共衛(wèi)生事件頻發(fā)，如1996年日本發(fā)生的大腸桿菌（E. coli) 0157:H7食物中毒的暴發(fā)流行，引起數(shù)人死亡，超過萬人感染，造成巨大的社會恐慌；2003 年SARS病毒在我國的肆虐；2005年豬鏈球菌的危害；近來禽流感病毒及2009年全世界范 圍內(nèi)流行的甲型HlNl流感病毒等，都對人們的健康和生命造成了嚴(yán)重的威脅。另外，致病 微生物污染也是影響我國食品衛(wèi)生和安全的最主要因素，微生物性食物中毒導(dǎo)致的中毒人 數(shù)最多，在2003年和2004年全國報告的重大食物中毒事故中，微生物性重大食物中毒起 數(shù)和人數(shù)均有增加，分別占當(dāng)年總起數(shù)和總?cè)藬?shù)的26%、43. 8%和34%、58. 1 %。食品在加 工、運輸、貯藏、銷售等過程中極易受到致病微生物污染。有害致病微生物不僅影響人們的 健康，危及人們的生命，而且引起全社會的恐慌，影響正常的社會運行。為了能快速準(zhǔn)確地 鑒定病原體，力求將病原體對人的危害降到最低，科學(xué)家們使用了很多種鑒定方法。傳統(tǒng)的 微生物特征信息檢測方法有病原體的培養(yǎng)、生化分析、毒素測定、血清學(xué)（抗原或抗體）檢 測等，但這些檢測方法不僅不適合快速偵檢，而且難以檢測和鑒定病原體中所含的多種信 息，如致病基因、毒力基因、抗性基因等。雖然近年來也發(fā)展了 PCR技術(shù)及核酸探針雜交技 術(shù)，但不能對微生物特征信息進行快速檢測、更不具備高通量篩查的能力。
[0003] 惡性腫瘤是嚴(yán)重危害人類健康的疾病之一。世界衛(wèi)生組織和國際抗癌聯(lián)盟的相 關(guān)資料顯示，如果不能有效控制惡性腫瘤的發(fā)病率，預(yù)計癌癥發(fā)病例在2020年將達到1600 萬，近1000萬人死亡。我國每年新增癌癥患者約160萬人，其中因癌癥死亡人數(shù)約130萬 人。導(dǎo)致癌癥患者死亡主要是因為無法及早發(fā)現(xiàn)從而貽誤治療時機以及腫瘤治愈率低，而 早期發(fā)現(xiàn)與有效治療是預(yù)防和治療癌癥的關(guān)鍵手段。幾十年來，研宄者們發(fā)現(xiàn)，生物標(biāo)志 物可以用來進行腫瘤早期診斷，使得癌癥的治愈率、生存率大大提高。近年來，隨著微小 RNAOnicro RNA，miRNA)的發(fā)現(xiàn)和進一步研宄，使其有可能作為新的生物標(biāo)志物。已證實， miRNA在外周血中的表達具有腫瘤相關(guān)性、組織特異性以及表達穩(wěn)定性，外周血miRNA很可 能是一種理想的腫瘤標(biāo)志物，為癌癥的早期診斷開辟了新途徑。目前，外周血miRNA的檢測 手段主要有miRNA芯片技術(shù)與實時熒光定量PCR技術(shù)。但二維的芯片技術(shù)使得核酸雜交效 率低下，使得其檢測靈敏度相對偏低。而熒光定量PCR檢測miRNA需要設(shè)計復(fù)雜的莖環(huán)探 針，以及進行擴增反應(yīng)，使得其檢測成較高，亦無法實現(xiàn)自動化。
[0004] 隨著納米技術(shù)的迅速發(fā)展，納米材料逐漸被應(yīng)用到生命科學(xué)領(lǐng)域，納米磁珠 (magneticbeads, MBs)因具有分離速度快、效率高、可重復(fù)使用、操作簡單、易功能化、易實 現(xiàn)自動化以及不影響分離物質(zhì)的活性等特殊的物理化學(xué)性質(zhì)和生物相容性，目前已應(yīng)用于 細(xì)胞分離、免疫測定、蛋白質(zhì)和酶的固定以及核酸檢測等方面。
[0005] 近年來，發(fā)光標(biāo)記類檢測方法，如熒光標(biāo)記、酶標(biāo)化學(xué)發(fā)光等已廣泛應(yīng)用于生物分 子檢測來放大檢測信號以提高檢測靈敏度。操作安全，方法簡便、快速，具有巨大的潛力，正 成為生物分析研宄與發(fā)展的最重要領(lǐng)域。因此，結(jié)合核酸探針雜交技術(shù)，通過標(biāo)記能夠產(chǎn)生 發(fā)光信號的分子而獲取目靶核酸信息，可實現(xiàn)靶核酸的快速檢測與高通量篩查。
[0006] 目前，已報道各種基于固相雜交與發(fā)光標(biāo)記的核酸檢測方法。其基本思路為：在固 相載體表面修飾核酸探針，通過捕獲標(biāo)記有發(fā)光信號分子的待測特異核酸片段，再檢測發(fā) 光信號，經(jīng)分析后，即可快速確認(rèn)靶核酸的特性。
[0007] 但隨著研宄深入發(fā)現(xiàn)，影響基于磁珠與發(fā)光標(biāo)記核酸檢測方法靈敏度的一個重要 因素為：發(fā)光信號會由于磁珠的遮蔽作用而大大減弱一一靈敏度降低最高可達90%。但現(xiàn) 有技術(shù)僅有熒光檢測法采用高溫使雙鏈核酸變性解鏈的方法分離熒光標(biāo)記物，因為熒光標(biāo) 記物如熒光素（Cy3，Cy5)等可耐受高溫。但化學(xué)發(fā)光檢測法等的發(fā)光標(biāo)記物無法通過高溫 的方式達到此目的，因為化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物等無法耐受高溫，當(dāng)高溫時會失活而無法繼續(xù)進 行發(fā)光檢測。因此，研制出一種通用的基于磁珠與分離發(fā)光標(biāo)記物的核酸檢測方法，能夠極 大地提高熒光、尤其是化學(xué)發(fā)光的檢測靈敏度，這對于疾病分子診斷、食品微生物監(jiān)測等具 有重大意義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明所要解決的主要技術(shù)問題是克服現(xiàn)有的基于磁珠與發(fā)光標(biāo)記物的核酸檢 測方法存在的檢測靈敏度受限問題，其原因是磁珠對光信號產(chǎn)生遮蔽效應(yīng)，極大地減弱了 發(fā)光信號強度。因此，提出一種基于磁珠與超聲分離發(fā)光標(biāo)記物的核酸檢測方法。
[0009] 一種基于磁珠與超聲分離發(fā)光標(biāo)記物的核酸檢測方法（圖1)，包括如下步驟：（1) 在磁珠表面修飾適合連接核酸探針的功能化手臂分子；(2)設(shè)計用于檢測靶核酸片段的功 能化探針，將功能化探針修飾于結(jié)合有功能化手臂分子的磁珠表面；（3)通過雜交，將靶核 酸片段及其發(fā)光標(biāo)記物捕獲至磁珠表面；(4)磁分離，清洗，即得到已獲取發(fā)光標(biāo)記物的磁 珠；（5)通過超聲波處理等物理方法將發(fā)光標(biāo)記物從磁珠表面分離下來，即得到不含磁珠 的發(fā)光標(biāo)記物溶液；(6)對該溶液進行發(fā)光檢測，即可獲取靶核酸信息。該方法通過超聲波 分離發(fā)光標(biāo)記物，去除磁珠，單獨檢測發(fā)光標(biāo)記物，完全克服了磁珠對發(fā)光信號的遮蔽效應(yīng) 導(dǎo)致的發(fā)光信號損失，而且使用超聲波處理等物理方式，可以避免化學(xué)或生物方法可能導(dǎo) 致的試劑失活或其他干擾等。另外，手臂分子的修飾可以提高磁珠的懸浮性，減小空間位 阻，提高雜交自由度，增加探針結(jié)合位點，從而提高磁珠表面的核酸雜交效率。因此，本發(fā)明 可顯著提高基于磁珠與發(fā)光標(biāo)記物的核酸檢測靈敏度。
[0010] 所述表面修飾，包括但不限于在磁珠表面以共價鍵、非共價鍵或物理吸附方式修 飾功能化手臂分子。
[0011] 所述功能化手臂分子，能夠同時與磁珠及功能化探針以共價鍵、非共價鍵或物理 吸附方式結(jié)合的多聚物，包括但不限于葡聚糖、殼聚糖、纖維素、聚乙二醇及其衍生物。
[0012] 所述靶核酸片段為：非擴增或經(jīng)擴增后的核酸片段。
[0013] 所述功能化探針為：能夠與手臂分子共價、非共價結(jié)合或物理吸附式結(jié)合，并與靶 核酸片段序列互補的寡核苷酸。
[0014] 所述發(fā)光標(biāo)記物，（1)該標(biāo)記物為適用于分子檢測的能夠產(chǎn)生發(fā)光信號的分子，包 括但不限于熒光標(biāo)記物、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物等；（2)發(fā)光標(biāo)記物標(biāo)記靶核酸的方式，包括但不 限于通過靶核酸擴增進行標(biāo)記、通過報告探針與靶核酸片段雜交進行標(biāo)記等。
[0015] 所述物理方法，包括超聲波處理等物理方法。
[0016] 所述發(fā)光檢測為：基于分子標(biāo)記的發(fā)光檢測體系，包括但不限于熒光、化學(xué)發(fā)光或 其他波長光等。
[0017] -種基于磁珠與超聲分離發(fā)光標(biāo)記物的核酸檢測方法，其步驟如下：
[0018] 1.在磁珠表面修飾功能化手臂分子：（1)磁珠氨基化修飾：將30mgFe30 4@Si02· 珠磁分離，加入6mL乙醇/水混合液并超聲分散，然后取12 μ L氨丙基三乙氧基硅烷（amin opropyltriethoxysilane，APTES)加入上述混合液中，室溫振蕩攪拌7h。利用外加磁場將 APTES修飾的磁性顆粒分離出來，用乙醇和磷酸鹽緩沖溶液（0. 1M，pH 7. 4, PB)分別清洗數(shù) 次，分散在PB溶液中，備用；（2)羧基化多聚物修飾磁珠 （carboxylated polymer-modified magnetic beads, CP-MBs)的制備：將氨基化磁珠（lOmg/mL)磁分離，用等體積2-N-嗎啉代 乙橫酸水合物溶液（2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid hydrate, MES，25mM，pH6)清 洗數(shù)次，磁分離，加入5mg/mL MES溶液溶解的羧基化多聚物（CP)溶液至清洗過的磁珠中， 混勻后室溫旋轉(zhuǎn)孵育30min，立刻加入冷的用MES溶液溶解的lOmg/mL 1-(3-二甲基氨基丙 基）_3_ 乙基碳二亞胺（l-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide，EDC)至磁珠 混合液中混勻，4°C下旋轉(zhuǎn)孵育2h以上。磁分離棄上清，用PB溶液清洗數(shù)次，分散在PB溶 液中，即得到CP-MBs。
[0019] 2.設(shè)計用于檢測靶核酸片段的特異性引物及功能化探針，探針以3'端氨基修飾。 探針修飾CP-MBs :將CP-MBs (10mg/mL)用等體積MES溶液清洗數(shù)次，磁分離棄上清，加入 MES稀釋的探針（2 μ M)到洗過的CP-MBs中，混勻后室溫旋轉(zhuǎn)孵育30min，立刻加入冷的用 MES溶液溶解的EDC(10mg/mL)，至磁珠混合液中混勻，4°C下旋轉(zhuǎn)孵育2h以上。磁分離棄上 清，加入Tris溶液（50mM，含0. 1 % Tween-20, pH 7. 4)溶液孵育15min中和未反應(yīng)羧基，再 用Tris溶液清洗數(shù)次，最后分散在PB溶液中，即得到連有特異探針的功能化磁珠。
[0020] 3.對靶核酸片段進行PCR擴增：反應(yīng)體系為IOXBuffer 2 μ L、Mg2+L 2 μ L、dNTP Mix 1 μ L、上下游引物各1 μ L、DNA模板1 μ L、Taq酶0. 5 μ L、加入去離子水補足體積至 20 μ L ;反應(yīng)條件為 95°C 5min、95°C 30s、60°C 30s 72°C 30s，35 個循環(huán)。
[0021] 4.核酸雜交：取30 μ L探針修飾磁珠（lOmg/mL)于PCR管，磁分離棄上清，加入 雜交液10 μ L、靶核酸片段PCR產(chǎn)物1 μ L，加去離子水補足體積至20 μ L ;雜交反應(yīng)條件為 95°C 5min、60°C IOmin ;然后磁分離，對磁珠清洗數(shù)次，即得到已獲取靶核酸片段的磁珠。
[0022] 5.發(fā)光標(biāo)記物標(biāo)記靶核酸片段：（1)通過PCR擴增進行標(biāo)記：在步驟3中所述dNTP Mix中加入biotin-11-dUTP，其他同步驟3,然后進行步驟4 ; (2)通過核酸雜交標(biāo)記：設(shè)計 與靶核酸片段序列互補的報告探針，該報告探針末端修飾有發(fā)光標(biāo)記物；步驟4完成后，進 行第二次核酸雜交：將步驟4的雜交產(chǎn)物磁分離，棄上清，加入雜交液10 μ L、報告探針溶液 1 μ L，加入去離子水補足體積至20 μ L ;雜交反應(yīng)條件為95°C 5min、60°C IOmin ;然后磁分 離，對磁珠清洗數(shù)次，即得到已獲取帶發(fā)光標(biāo)記物的靶核酸片段的磁珠。
[0023] 6.對已獲取帶發(fā)光標(biāo)記物的靶核酸片段的磁珠，調(diào)頻超聲波至500kHz (100W)， 處理20min，磁分離，用移液器獲取上清液，即得到不含磁珠的發(fā)光標(biāo)記物溶液。其中， 500kHz (100W)為一個較佳的超聲波條件，意在解釋本發(fā)明，不得以改變超聲波條件的形式 來理解為限制本發(fā)明的范圍。
[0024] 7.對發(fā)光標(biāo)記物溶液進行發(fā)光檢測，獲取靶核酸信息。
[0025] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下特點： 大分子多聚物作為分子手臂將功能化探針連接于磁珠表面，提高了顆粒懸浮性、減小 了空間位阻、增加了探針結(jié)合位點以及增加了雜交自由度，從而提高了雜交效率。將對應(yīng)靶 核酸片段的發(fā)光標(biāo)記物從磁珠表面分離下來進行檢測，避免了磁珠遮蔽效應(yīng)，提高了發(fā)光 信號強度。同時，使用超聲等物理方式，可以避免化學(xué)或生物方法可能導(dǎo)致的試劑失活或其 他干擾等。因此，本發(fā)明極大地提高了檢測靈敏度。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0026] 以下結(jié)合附圖及實施例對本發(fā)明作進一步描述：
[0027] 圖1為一種基于磁珠與超聲分離發(fā)光標(biāo)記物的核酸檢測方法流程示意圖。
[0028] 圖2為HBV核酸PCR擴增產(chǎn)物電泳圖。
[0029] 圖3為HBV核酸的化學(xué)發(fā)光檢測動力曲線。

【具體實施方式】
[0030] 以下結(jié)合實例對本發(fā)明作進一步描述： 本發(fā)明公布了一種利用磁珠易于磁分離的特性結(jié)合雜交以及超聲分離發(fā)光標(biāo)記物的 策略，對不含磁珠的發(fā)光標(biāo)記物溶液進行發(fā)光檢測，獲取靶核酸信息的方法。在本發(fā)明的一 個較佳的實例中，以Fe3O 4OSiO2磁珠作為載體，在其表面修飾功能化手臂分子，連接上功能 化探針，以生物素標(biāo)記靶核酸片段，通過核酸雜交將帶生物素標(biāo)記的靶核酸片段捕獲至磁 珠表面，通過與親和素標(biāo)記酶孵育使磁珠獲取對應(yīng)靶核酸片段的酶分子，然后利用超聲波 將對應(yīng)靶核酸片段的酶分子從磁珠表面分離下來，最后進行化學(xué)發(fā)光檢測，獲取靶核酸信 息。
[0031] 實施例1 :以羧甲基葡聚糖為功能化手臂分子在磁珠表面進行修飾
[0032] 1.磁珠的氨基化修飾：將ImLFe3O4OSiOJlt珠懸液（30mg/mL)磁分離，加入6mL乙 醇/水（99/1)混合液中并超聲分散，然后取12yL氨丙基三乙氧基娃燒（aminopropyltri ethoxysilane, APTES)加入上述混合液中，室溫振蕩攪拌7h。利用外加磁場將APTES修飾 的磁性顆粒分離出來，用乙醇和磷酸鹽緩沖溶液（PB，0. 1M，pH 7. 4)分別清洗數(shù)次，分散在 3mL PB 溶液中，獲得氨基化磁珠 （aminated MBs，AMBs, 10mg/mL)。
[0033] 2.羧甲基葡聚糖修飾磁珠 （carboxymethylated dextran-modified magnetic beadS，CMD-MBs)的制備：將氨基化磁珠（lOmg/mL)磁分離，用等體積2-N-嗎啉代乙磺酸水 合物溶液（2-(N_morpholino)ethanesulfonic acid hydrate，MES，25mM，pH 6)清洗數(shù)次， 磁分離，加入2mg/mLMES溶液溶解的羧甲基葡聚糖（CMD)溶液至清洗過的磁珠中，混勻后室 溫旋轉(zhuǎn)孵育30min，立刻加入冷的用MES溶液溶解的1-(3-二甲基氨基丙基）-3-乙基碳二 亞胺（l _(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide，EDC, 10mg/mL)至磁珠混合液 中混勻，4°C下旋轉(zhuǎn)孵育2h以上。磁分離棄上清，用PB溶液清洗數(shù)次，分散在PB溶液中，即 得到 CMD-MBs。
[0034] 3.通過動態(tài)光散射測定磁珠的水和半徑可得！CMD-MBs和MBs的平均水和半徑分 別為657. 9nm和738. 5nm，表明CMD的修飾增加了 MBs的水和半徑；同時，通過動態(tài)光散射 測定磁珠的zeta電位可得：AMBs和CMD-MBs的zeta電位分別為+13. 7mV和-12. 6mV，表 明AMBs經(jīng)CMD修飾后，CMD上的羧基使得磁珠表面由正電荷的轉(zhuǎn)變?yōu)樨?fù)電荷。上述實驗結(jié) 果說明CMD成功修飾在磁珠表面。
[0035] 實施例2 :以羧甲基纖維素為功能化手臂分子在磁珠表面進行修飾
[0036] 1.磁珠的氨基化修飾：同實施例1中所述磁珠的氨基化修飾的方法。
[0037] 2.羧甲基纖維素修飾磁珠（carboxymethylcellulose-modified magnetic beadS，CMC-MBs)的制備：將氨基化磁珠（lOmg/mL)磁分離，用等體積2-N-嗎啉代乙磺酸水 合物溶液（2-(N_morpholino)ethanesulfonic acid hydrate，MES，25mM，pH 6)清洗數(shù)次， 磁分離，加入lmg/mL MES溶液溶解的羧甲基纖維素（CMC)溶液至清洗過的磁珠中，混勻后 室溫旋轉(zhuǎn)孵育40min，立刻加入冷的用MES溶液溶解的1-(3-二甲基氨基丙基）-3-乙基碳 二亞胺（l _(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide，EDC, 10mg/mL)至磁珠混合 液中混勻，4°C下旋轉(zhuǎn)孵育2h以上。磁分離棄上清，用PB溶液清洗數(shù)次，分散在PB溶液中， 即得到CMC-MBs。
[0038] 3.通過動態(tài)光散射測定磁珠的水和半徑可得！CMC-MBs和MBs的平均水和半徑分 別為678. 2nm和765. 7nm，表明CMC的修飾增加了 MBs的水和半徑；同時，通過動態(tài)光散射 測定磁珠的zeta電位可得：AMBs和CMC-MBs的zeta電位分別為+14. ImV和-15. 7mV，表 明AMBs經(jīng)CMC修飾后，CMC上的羧基使得磁珠表面由正電荷的轉(zhuǎn)變?yōu)樨?fù)電荷。上述實驗結(jié) 果說明CMC成功修飾在磁珠表面。
[0039] 實施例3 :以乙肝病毒Ofepatitis B virus, HBV)DNA為對象進行檢測
[0032] 1.設(shè)計一對能夠特異擴增HBV X基因片段的引物和與該序列互補配對的功能 化探針，探針3'端以氨基修飾。引物序列如下：5'-CCTCTACCGTCCCCTTCTTCA-3'（SEQ ID N0.1)、5'-ACGTGCAGAGGTGAAGCGAAG-3'（SEQ ID N0.2);探針序列如下：5 '-CACTTCGCTTCAC CTCTGCACGTA-(T)15-NH2-3'（SEQ ID N0.3)。
[0040] 2.探針修飾羧甲基葡聚糖修飾磁珠（CMD-MBs):將CMD-MBs (10mg/mL)用等體積 MES溶液清洗數(shù)次，磁分離棄上清，加入MES稀釋的探針（2 μ M)到洗過的CMD-MBs中，混勻 后室溫旋轉(zhuǎn)孵育30min，立刻加入冷的用MES溶液溶解的EDC (10mg/mL)，至磁珠混合液中混 勻，4°C下旋轉(zhuǎn)孵育2h以上。磁分離，棄上清，加入Tris溶液（50mM，含0. 1% Tween-20, pH 7. 4)孵育15min中和未反應(yīng)羧基，再用Tris溶液清洗數(shù)次，最后分散在PB溶液中，即得到 連有捕獲探針的功能化磁珠。
[0041] 3.對靶核酸片段進行PCR擴增：反應(yīng)體系為IOXBuffer 2 μ L、Mg2+L 2 μ L、dNTP Mix(dATP:dCTP:dGTP:dTTP:biotin-ll-dUTP = 25:25:25:23:2) I yL、上下游引物各 I yL、 DNA模板lyL、Taq酶0. 5yL、加去離子水補足體積至20yL;反應(yīng)條件為95°C 5min、 95°C30s、60°C30s 72°C30s，35個循環(huán)。圖3為HBV核酸PCR擴增產(chǎn)物電泳圖，靶核酸片 段條帶單一，證明擴增成功。
[0042] 4.核酸雜交：取30 μ L探針修飾磁珠（10mg/mL)于PCR管，磁分離，棄上清，加入 雜交液10 μ L、PCR產(chǎn)物1 μ L，加去離子水補足體積至20 μ L ;雜交反應(yīng)條件為95°C 5min、 60°C 20min ;然后磁分離，對磁珠清洗數(shù)次，即得到已獲取帶發(fā)光標(biāo)記的靶核酸片段的磁 珠。
[0043] 5.化學(xué)發(fā)光檢測：磁珠液磁分離后吸去上清，加入封閉液混勻后室溫放置30min， 期間不斷混勻。磁分離后吸去上清，加入封閉液稀釋堿性磷酸酶標(biāo)記鏈霉親和素 （alkaline phosphatase labeled streptavidin，ALP_SA)，混勾后室溫孵育 30min。磁分離后清洗數(shù) 次，然后調(diào)頻超聲波為500kHz (100W)，處理20min，用移液器轉(zhuǎn)移上清液，將上清液與磁珠 分開，然后在上清液與磁珠中分別加入0. 25mM化學(xué)發(fā)光底物3-(2'-螺旋金剛烷）-4-甲氧 基-4-(3"_ 輕基）苯 _1，2_ 二氧雜環(huán)丁燒磷酸（3_ (2'_spiroadamantane)-4_methoxy-4-( 3"_phosphoryloxy) phenyl-1, 2-dioxetane, AMPF1D)。充分混勾后測定化學(xué)發(fā)光強度值至其 穩(wěn)定，平行測定3次。以未用超聲波處理的發(fā)光檢測結(jié)果作為對照。
[0044] 化學(xué)發(fā)光檢測結(jié)果如圖3所示。測得的發(fā)光值說明去除磁珠遮蔽效應(yīng)后，化學(xué)發(fā) 光信號顯著提升，相對于未超聲對照組提高到7倍左右。在20 μ L微體積中能夠檢測出最 少50amol核酸片段。重復(fù)三次實驗，結(jié)果穩(wěn)定。即通過超聲分離酶分子的化學(xué)發(fā)光檢測獲 取的HBV核酸信息靈敏度顯著高于未超聲對照組的檢測結(jié)果。
[0045] 實施例4 :以血清miR-21為對象進彳丁檢測
[0046] 1.設(shè)計與miR-21序列互補配對的功能化捕獲探針與報告探針，捕獲探針3'端以 氨基修飾，報告探針5'端以生物素修飾。探針序列如下：5'-CTGATAAGCTA-(T) 15-NH2-3'（SEQ ID N0.4)、5'-Biotin-(T)15-TCAACATCAG-3'（SEQ ID N0.5)。
[0047] 2.捕獲探針修飾羧甲基纖維素修飾磁珠（CMC-MBs):將CMC-MBs (5mg/mL)用等體 積MES溶液清洗數(shù)次，磁分離棄上清，加入MES稀釋的探針（2 μ M)到洗過的CMC-MBs中，混 勻后室溫旋轉(zhuǎn)孵育30min，立刻加入冷的用MES溶液溶解的EDC (10mg/mL)，至磁珠混合液中 混勻，4°C下旋轉(zhuǎn)孵育2h以上。磁分離，棄上清，加入Tris溶液（50mM，含0. 1% Tween-20, pH 7. 4)孵育15min中和未反應(yīng)羧基，再用Tris溶液清洗數(shù)次，最后分散在PB溶液中，即得到 連有捕獲探針的功能化磁珠。
[0048] 3.第一次核酸雜交：（1)取30 μ L捕獲探針修飾磁珠（lOmg/mL)于PCR管，磁分離， 棄上清，加入雜交液10 μ L、PCR產(chǎn)物1 μ L，加去離子水補足體積至20 μ L ;雜交反應(yīng)條件為 95°C 5min、60°C 20min ;然后磁分離，對磁珠清洗數(shù)次，即得到已獲取miR-21片段的磁珠。
[0049] 4.第二次核酸雜交：磁分離，棄上清，加入雜交液10 μ L、報告探針溶液1 μ L，加入 去離子水補足體積至20 yL ;雜交反應(yīng)條件為95°C 5min、60°C IOmin ;然后磁分離，對磁珠 清洗數(shù)次，即得到已獲取帶發(fā)光標(biāo)記物的miR-21片段的磁珠。
[0050] 5.化學(xué)發(fā)光檢測：同實施例3所述化學(xué)發(fā)光檢測的方法。
[0051] 化學(xué)發(fā)光檢測結(jié)果表明，miR-21檢測的有益效果同實施例3,故不贅述。
【權(quán)利要求】
1. 一種基于磁珠與超聲分離發(fā)光標(biāo)記物的核酸檢測方法，其特征在于包括以下步驟： (1)在磁珠表面修飾適合連接核酸探針的功能化手臂分子；（2)設(shè)計用于檢測靶核酸片段 的功能化探針，將功能化探針修飾于結(jié)合有功能化手臂分子的磁珠表面；(3)通過雜交，將 靶核酸片段及其發(fā)光標(biāo)記物捕獲至磁珠表面；(4)磁分離，清洗，即得到已獲取發(fā)光標(biāo)記物 的磁珠；（5)通過超聲波處理等物理方法將發(fā)光標(biāo)記物從磁珠表面分離下來，即得到不含 磁珠的發(fā)光標(biāo)記物溶液；(6)對該溶液進行發(fā)光檢測，即可獲取靶核酸信息。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，其中（1)所述表面修飾，是指在磁珠表面 以共價鍵、非共價鍵或物理吸附方式修飾功能化手臂分子。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，其中（1)所述功能化手臂分子，是能夠同 時與磁珠及功能化探針以共價鍵、非共價鍵或物理吸附方式結(jié)合的多聚物。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述功能化手臂分子是適合連接功能化 探針的葡聚糖、殼聚糖、纖維素或聚乙二醇及其衍生物。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，其中（2)所述靶核酸片段，是非擴增或經(jīng) 擴增后的核酸片段。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，其中（2)所述功能化探針，是能夠與手臂 分子以共價鍵、非共價鍵或物理吸附方式結(jié)合，并與靶核酸片段序列互補的寡核苷酸。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，其中（3)所述發(fā)光標(biāo)記物為適用于分子 檢測的能夠產(chǎn)生發(fā)光信號的分子，包括熒光標(biāo)記物、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物；步驟（3)中發(fā)光標(biāo)記 物標(biāo)記靶核酸的方式為通過靶核酸擴增進行標(biāo)記、通過報告探針與靶核酸片段雜交進行標(biāo) 記。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，其中步驟（5)所述物理方法為超聲波處 理。
【文檔編號】C12Q1/68GK104498602SQ201410757736
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2014年12月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月11日
【發(fā)明者】李智洋, 楊淏文, 何農(nóng)躍 申請人:南京醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院