一種提取梨花粉管液泡的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種分離純化梨花粉管液泡的方法，主要包括花粉采集、花粉培養(yǎng)、原生質(zhì)體釋放、原生質(zhì)體純化、液泡分離、液泡純化等步驟。該方法用中性紅2次染色方法可在光學(xué)顯微鏡下清楚地區(qū)分花粉粒、液泡、原生質(zhì)體和水泡。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：提取方法快速、簡(jiǎn)單，液泡膜表面光滑，污染程度小，所需材料和藥品極少，不僅可以應(yīng)用于膜片鉗研究，還可以進(jìn)一步應(yīng)用于液泡蛋白質(zhì)組學(xué)研究。
【專利說(shuō)明】 一種提取梨花粉管液泡的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于植物細(xì)胞生物學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體地說(shuō)屬于一種從梨花粉管中提取純化液泡的方法。

【背景技術(shù)】
[0002]植物液泡是植物細(xì)胞中特有的大型細(xì)胞器，在保持和調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透壓，儲(chǔ)存和轉(zhuǎn)運(yùn)各種離子、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和代謝中間物中有重要作用，同時(shí)還具有與溶酶體類似的功能，清除有害物質(zhì)和對(duì)抗逆性進(jìn)行調(diào)節(jié)?；ǚ垡号菰诨ǚ鄣男纬伞⒚劝l(fā)和花粉管生長(zhǎng)中起著重要的作用，但由于花粉液泡提取的困難，目前關(guān)于液泡在花粉萌發(fā)和花粉管生長(zhǎng)中的作用的研究較少。
[0003]植物液泡上有許多離子通道，參與許多生理過(guò)程，花粉管液泡離子通道在花粉的成熟和生長(zhǎng)及維持胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定中發(fā)揮著巨大的作用。目前主要通過(guò)膜片鉗技術(shù)研究液泡離子通道的功能，應(yīng)用膜片鉗技術(shù)可以直接觀察和分辨單離子通道電流及其開(kāi)閉時(shí)程、區(qū)分離子通道的離子選擇性、同時(shí)可發(fā)現(xiàn)新的離子通道及亞型，并能在記錄單細(xì)胞電流和全細(xì)胞電流的基礎(chǔ)上進(jìn)一步計(jì)算出細(xì)胞膜上的通道數(shù)和開(kāi)放概率，還可以用以研究某些胞內(nèi)或胞外物質(zhì)對(duì)離子通道開(kāi)閉及通道電流的影響等。同時(shí)結(jié)合分子克隆和定點(diǎn)突變技術(shù)，膜片鉗技術(shù)可用于離子通道分子結(jié)構(gòu)與生物學(xué)功能關(guān)系的研究，了解細(xì)胞信號(hào)的跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞分泌機(jī)制。因此分離純化出花粉管完整的液泡是膜片鉗技術(shù)研究的前提，更是研究花粉管液泡離子通道的作用的基礎(chǔ)。
[0004]植物成熟液泡分離主要是指中央液泡的分離。液泡在植物細(xì)胞中雖然位置顯著、發(fā)現(xiàn)早，但其分離技術(shù)遠(yuǎn)不如葉綠體、線粒體、細(xì)胞核等細(xì)胞器的技術(shù)成熟。目前植物液泡分離制備主要有原生質(zhì)體裂解、多元堿化合物誘導(dǎo)、機(jī)械破碎等基本方法。 申請(qǐng)人:在試驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，由于不同植物細(xì)胞的細(xì)胞結(jié)構(gòu)差異及液泡膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性不同等問(wèn)題，已有方法在梨花粉管液泡提取中均存在不足，不能達(dá)到預(yù)期效果。
[0005]1、原生質(zhì)體滲透裂解:此種方法對(duì)植物材料有較高要求,對(duì)原生質(zhì)體的數(shù)量和質(zhì)量都要求較高，目前主要在葉片、花瓣和莖的幼嫩組織中進(jìn)行。由于不同植物細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和滲透壓的差異，提取的方法差異較大，目前已經(jīng)報(bào)道的關(guān)于葉片等材料液泡提取的方法在花粉管液泡的提取中未見(jiàn)成功報(bào)道。雖然對(duì)于景天科植物葉片細(xì)胞液泡的提取已有相關(guān)報(bào)道(一種提取景天科植物細(xì)胞液泡的方法，CN 103589678 A)，但由于花粉材料的特殊性，該方法在葉片原生質(zhì)體的提取過(guò)程中采用的方法完全不適合梨花粉管，采用其方法幾乎不能獲得花粉管原生質(zhì)體。在梨花粉管液泡的純化過(guò)程中，采用其方法在10% Ficoll表面發(fā)現(xiàn)較少的液泡和較多的花粉粒，可能由于材料的差異和離心速度不夠?qū)е路蛛x純化不完全。
[0006]2、多元堿化合物誘導(dǎo):此種方法易對(duì)液泡膜造成傷害。
[0007]3、機(jī)械破碎:雖然不通過(guò)原生質(zhì)體，直接由剪切后的薄片組織在質(zhì)壁分離介質(zhì)中釋放液泡，但是此種方法需要大量的材料，對(duì)于取材難度較大的梨花粉不宜應(yīng)用。
[0008]因此，建立一套快速有效的梨花粉管液泡提取純化技術(shù)對(duì)于研究梨花粉管生長(zhǎng)代謝及應(yīng)用膜片鉗技術(shù)研究花粉管液泡的離子通道具有重要的意義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明的發(fā)明目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一種梨花粉管液泡分離純化方法。
[0010]本發(fā)明的目的可通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
[0011]一種提取梨花粉管液泡的方法，該方法包括以下步驟:
[0012]I)花粉培養(yǎng):分離干燥花藥中的花粉，將其加入到花粉培養(yǎng)基中，加入0.005%的中性紅染料，避光條件下，23?27°C，140?200rpm，培養(yǎng)3?4小時(shí)；
[0013]2)原生質(zhì)體的釋放:將培養(yǎng)好的花粉與胞外液按照1:2?5的體積比混合，加入0.5?1.5%的纖維素酶、0.5?1.5%的離析酶，23?27°C，黑暗條件下，60?80rpm，反應(yīng)10?15分鐘；
[0014]3)原生質(zhì)體的純化:將上一步所得含原生質(zhì)體的液體通過(guò)200-250目的細(xì)胞篩以去除未酶解的花粉管，濾液加入到離心管中，靜置2-5分鐘后吸取上清，上清液離心，去除上清液，再用胞外液清洗以去除酶的殘留和花粉管酶解碎片，所得沉淀為花粉管原生質(zhì)體；
[0015]4)液泡的分離:將液泡溶解緩沖液加入到上一步獲得的原生質(zhì)體中，用移液槍吸打3-5次，靜置5-10分鐘，觀察液泡出現(xiàn)情況；
[0016]5)液泡的純化:將出現(xiàn)液泡的緩沖液轉(zhuǎn)移到Ficol 1-400密度梯度工作液頂部離心，在25000?28000rpm、8?I (TC下離心15-30分鐘；離心后，F(xiàn)icoll-400密度梯度工作液12-15%%濃度頂部淡紅色的一層為液泡，將其吸出，顯微鏡下觀察，淡紅色、透明的為所述的梨花粉管液泡。
[0017]本發(fā)明所述的提取梨花粉管液泡的方法，優(yōu)選包括以下步驟:
[0018]I)花粉采集:采集大蕾期花藥，干燥；干燥硅膠陰干，零下80度保存可存放2-3年；
[0019]2)花粉培養(yǎng):分離干燥花藥中的花粉，將其加入到花粉培養(yǎng)基中，加入0.005%的中性紅染料，避光條件下，23?27°C，140?200rpm，培養(yǎng)3?4小時(shí)；
[0020]3)原生質(zhì)體的釋放:將培養(yǎng)好的花粉與胞外液按照1:3的體積比例混合，加入I %的纖維素酶、I %的離析酶，23?27°C，黑暗條件下，60?80rpm，反應(yīng)10?15分鐘；
[0021]4)原生質(zhì)體的純化:將步驟3)所述液體通過(guò)200-250目的細(xì)胞篩以去除未酶解的花粉管，重復(fù)3次,濾液加入到離心管中，靜置2-3分鐘后吸取上清,上清液在lOOXg、10°C下離心10分鐘，去除上清液，再用胞外液清洗3次以去除酶的殘留和花粉管酶解碎片，所得沉淀為花粉管原生質(zhì)體；
[0022]5)液泡的分離:將液泡溶解緩沖液加入到步驟4)獲得的原生質(zhì)體中，用移液槍吸打3-5次，靜置5-10分鐘，顯微鏡下觀察液泡出現(xiàn)情況；
[0023]6)液泡的純化:將出現(xiàn)液泡的緩沖液轉(zhuǎn)移到Ficoll-400密度梯度工作液頂部離心，在26000rpm(100000Xg) 10°C下離心15-30分鐘；離心后，F(xiàn)icoll-400密度梯度工作液12-15%濃度頂部淡紅色的一層為液泡，用剪過(guò)的移液槍頭吸出，顯微鏡下觀察，淡紅色、透明的為液泡。
[0024]其中，所述的花粉培養(yǎng)基配方為:100g/L蔗糖，0.3g/L Ca (N03) 2.4H20, 30mM|^5((1-磺基甲脂磺酸鈉)，0.lg/L硼酸溶于蒸餾水中并定容，用Tris堿(三羥甲基氨基甲烷)調(diào)整pH值至5.9?6.4。
[0025]所述的胞外液配方為:100mM葡萄糖，1mM CaCl2, 5mM MES( α -磺基甲脂磺酸鈉)，0.8-1Μ山梨醇，用Tris (三羥甲基氨基甲烷)將pH調(diào)至5.5?6.0。
[0026]液泡溶解液配方為:0.3-0.35M山梨醇，2_4mM EDTA (乙二胺四乙酸)，2_5mM DTT和0.005%的中性紅，用Tris (三羥甲基氨基甲烷)將pH調(diào)至7.5?8.0。
[0027]Ficoll-400密度梯度工作液的配方為:Ficoll-400密度梯度(質(zhì)量體積比濃度)工作液的配方為:12ml Ficoll-400密度梯度工作液包含2?4% (g/100ml)、6?8%(g/100ml)及12?15% (g/100ml)三個(gè)梯度濃度各4ml，分別將Ficoll 400溶于pH 7.5?8.0的含0.5M的山梨醇，5mM CaCl2和25mM Tris-HCl緩沖液中配成要求的濃度。
[0028]Ficoll-400密度梯度工作液的配方為=Ficol 1-400密度梯度(質(zhì)量體積比濃度)工作液的配方優(yōu)選:12ml Ficoll-400密度梯度工作液包含3% (g/100ml),8% (g/100ml)及13% (g/100ml)三個(gè)梯度濃度各4ml，分別將Ficoll 400溶于含0.5M的山梨醇，，5mMCaCl2和25mM Tris-HCl緩沖液中(pH 7.5?8.0,10°C )配成需要的濃度。
[0029]提取花粉管液泡的關(guān)鍵是將其從細(xì)胞中釋放出來(lái)并能識(shí)別，然后進(jìn)行提純。本發(fā)明采用了酶解法獲得原生質(zhì)體并調(diào)節(jié)滲透壓破壞質(zhì)膜獲得液泡，用中性紅染色方法在光學(xué)顯微鏡下清楚地區(qū)分花粉粒、液泡、原生質(zhì)體和水泡。并通過(guò)梯度及Ficoll-400密度離心得到質(zhì)量較高的梨花粉管液泡。
[0030]由于花粉與葉片的結(jié)構(gòu)差異，使得花粉管原生質(zhì)體中易混合酶解后的花粉粒，因此減少花粉的污染獲得純度較高的原生質(zhì)體對(duì)技術(shù)方案的效果影響較大。用細(xì)胞篩多次過(guò)濾的目的是為了去除未被酶解的花粉管，此方法比用紗布過(guò)濾損失的原生質(zhì)體少很多，之后靜置及用胞外液清洗不但可以去除酶污染還可以減少酶解產(chǎn)生的碎片和花粉粒。本發(fā)明在花粉管萌發(fā)前就加入中性紅染色，此方法對(duì)花粉的萌發(fā)和生長(zhǎng)都無(wú)影響，而且比酶解后加入同樣濃度的中性紅有利于花粉管中液泡的染色，而且有利于Ficoll-400密度梯度分層時(shí)區(qū)分液泡層和花粉粒層，花粉粒顏色較深。
[0031]本發(fā)明的有益效果
[0032](I)該發(fā)明采用酶解法獲得原生質(zhì)體并調(diào)節(jié)滲透壓破壞質(zhì)膜獲得液泡，在酶解前加入中性紅有利于花粉管酶解過(guò)程中液泡的染色(圖2)，兩次使用中性紅有利于液泡的染色并使花粉粒顏色較深。在光學(xué)顯微鏡下可以清楚地區(qū)分花粉粒、液泡、原生質(zhì)體和水泡，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)操作區(qū)分液泡提供幫助。這種液泡提取方法具有方便、快速、簡(jiǎn)單的特點(diǎn)。
[0033](2)該方法采用中性紅染色方法配合Ficoll-400密度梯度離心技術(shù)純化梨花粉管液泡。此方法對(duì)細(xì)胞無(wú)毒害，容易區(qū)分液泡層。而且由于花粉材料的特殊性，花粉管酶解后獲得的原生質(zhì)體中混合較多的花粉粒和花粉管酶解后的碎片，采用多個(gè)密度梯度易于去除碎片和花粉粒的污染，得到較高純度的梨花粉管液泡。
[0034](3)該方法提純后的液泡膜表面光滑，本法的優(yōu)點(diǎn)是在相同的產(chǎn)量時(shí)污染程度較小，不僅可以應(yīng)用于膜片鉗研究，還可以進(jìn)一步提純應(yīng)用于液泡蛋白質(zhì)組學(xué)研究。
[0035](4)該方法不僅適用于梨花粉管液泡的提取純化，同時(shí)還可以為其他特殊植物組織及花粉管液泡提取提供重要參考，解決了目前葉片液泡提取方法不適合花粉管液泡提取的問(wèn)題。
[0036](5)本方法所需要的材料和藥品極少，僅用3_5mg干花粉即可以提取到足夠膜片鉗實(shí)驗(yàn)需要的液泡，遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于目前葉片液泡提取方法的3-5g葉片，而且花粉低溫下易于保存，可以隨時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以葉片為材料一般需要提前I個(gè)月時(shí)間準(zhǔn)備。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0037]圖1梨花粉管液泡提取技術(shù)流程
[0038]圖2花粉管酶解過(guò)程中液泡的染色
[0039]圖3液泡分離過(guò)程
[0040]其中，A-花粉管原生質(zhì)體階段；B-原生質(zhì)體部分液泡化階段；C_原生質(zhì)體膨脹破裂，液泡部分脫離原生質(zhì)體階段；D_液泡逐漸脫離原生質(zhì)，直至完全脫離，出現(xiàn)透明完整的液泡。Bar = 25 μ m。
[0041 ] 圖4提取純化后梨花粉管液泡
[0042]其中，箭頭所指為液泡。
[0043]圖5，采用“一種提取景天科植物細(xì)胞液泡的方法”(CN 103589678 A)，提取的花粉管原生質(zhì)體,基本看不到花粉原生質(zhì)體。
[0044]圖6，采用“一種提取景天科植物細(xì)胞液泡的方法”(CN 103589678 A)，純化的液泡，污染較多，液泡極少。

【具體實(shí)施方式】
[0045]實(shí)施例1
[0046]I)花粉采集:采集大蕾期花藥，用硅膠干燥。
[0047]2)花粉培養(yǎng):分離干燥花藥中的花粉，取3mg花粉，將其加入到2ml花粉培養(yǎng)基中，加入0.005%的中性紅染料。避光條件下，23?27°C，140?180rpm，培養(yǎng)3?4h?；ǚ叟囵B(yǎng)基的配方:100g/L蔗糖，0.3g/L Ca(NO3)2.4H20, 30mM MES ( α -磺基甲脂磺酸鈉)，0.lg/L硼酸溶于蒸餾水中并定容，用Tris (三羥甲基氨基甲烷)調(diào)整pH值至5.9?6.4。
[0048]3)原生質(zhì)體的釋放:將培養(yǎng)好的花粉與胞外液按照1:3的體積比例混合，加入I %的纖維素酶、I %的離析酶，23?27°C，黑暗條件下，60?80rpm，反應(yīng)10-15分鐘。胞外液配方為=10mM葡萄糖，1mM CaCl2, 5mM MES ( α -磺基甲脂磺酸鈉)，0.8-1M山梨醇，用Tris (三羥甲基氨基甲烷)將pH調(diào)至5.5?6.0。
[0049]4)原生質(zhì)體的純化:將步驟3)所述液體通過(guò)200-250目的細(xì)胞篩以去除未酶解的花粉管，重復(fù)3次,濾液加入到離心管中，靜置2-3分鐘后吸取上清,上清液在lOOXg、10°C下離心10分鐘，去除上清液，再用胞外液清洗3次以去除酶的殘留和花粉管酶解后的殘?jiān)贸恋頌榛ǚ酃茉|(zhì)體。液泡溶解液配方為:0.3-0.35M山梨醇，2-4mM EDTA (乙二胺四乙酸)，2-5mM DTT和0.005%的中性紅，用Tris(三羥甲基氨基甲烷)將pH調(diào)至7.5 ?8.0。
[0050]5)液泡的分離:將液泡溶解緩沖液加入到步驟4)獲得的原生質(zhì)體中，用移液槍吸打3-5次，靜置5?10分鐘，觀察液泡出現(xiàn)情況(圖3)。
[0051]6)液泡的純化:將出現(xiàn)液泡的緩沖液轉(zhuǎn)移到Ficol 1-400密度梯度工作液頂部離心，這個(gè)梯度在26000rpm(100000Xg) 10°C下離心15?30分鐘；離心后，F(xiàn)icoll-400密度梯度工作液12-15%濃度頂部淡紅色的一層為液泡，用剪過(guò)的移液槍頭吸出，顯微鏡下觀察(圖4)。Ficoll-400密度梯度工作液的配制:Ficoll-400密度梯度(質(zhì)量體積比濃度)工作液的配方為:12ml Ficoll-400密度梯度工作液包含及13%三個(gè)梯度濃度各4ml，分別將 Ficoll 400 溶于含 0.5M 的山梨醇，，5mM CaCldP25mM Tris-HCl 緩沖液中(pH7.5?8.0，10°C )配成需要的濃度。
【權(quán)利要求】
1.一種提取梨花粉管液泡的方法，其特征在于該方法包括以下步驟: 1)花粉培養(yǎng):分離干燥花藥中的花粉，將其加入到花粉培養(yǎng)基中，加入0.005%的中性紅染料，避光條件下，23?27°C，140?200rpm，培養(yǎng)3?4小時(shí)； 2)原生質(zhì)體的釋放:將培養(yǎng)好的花粉與胞外液按照1:2?5的體積比混合，加入0.5?1.5%的纖維素酶、0.5?L 5%的離析酶，23?27°C，黑暗條件下，60?80rpm，反應(yīng)10?15分鐘； 3)原生質(zhì)體的純化:將上一步所得含原生質(zhì)體的液體通過(guò)200-250目的細(xì)胞篩去除未酶解的花粉管，濾液加入到離心管中，靜置2-5分鐘后吸取上清，上清液離心，去除上清液，再用胞外液清洗沉淀去除酶的殘留和花粉管酶解碎片，所得沉淀為花粉管原生質(zhì)體； 4)液泡的分離:將液泡溶解緩沖液加入到上一步獲得的花粉管原生質(zhì)體中，用移液槍吸打3-5次，靜置5-10分鐘，觀察液泡出現(xiàn)情況； 5)液泡的純化:將出現(xiàn)液泡的緩沖液轉(zhuǎn)移到Ficoll-400密度梯度工作液頂部離心，在25000?28000rpm、8?10°C下離心15-30分鐘；離心后，F(xiàn)icoll-400密度梯度工作液12?15%濃度頂部淡紅色的一層為液泡，將其吸出，顯微鏡下觀察，淡紅色、透明的為所述的梨花粉管液泡；所述的Ficoll-400密度梯度工作液濃度分別為:2?4%、6?8%及12?15%。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取梨花粉管液泡的方法，其特征在于該方法包括以下步驟: 1)花粉采集:采集大蕾期花藥，干燥，干燥硅膠陰干； 2)花粉培養(yǎng):分離干燥花藥中的花粉，將其加入到花粉培養(yǎng)基中，加入0.005%的中性紅染料，避光條件下，23?27°C，140?200rpm，培養(yǎng)3?4小時(shí)； 3)原生質(zhì)體的釋放:將培養(yǎng)好的花粉與胞外液按照1:3的體積比混合，加入1%的纖維素酶、I %的離析酶，23?27°C，黑暗條件下，60?80rpm，反應(yīng)10?15分鐘； 4)原生質(zhì)體的純化:將步驟3)所述液體通過(guò)200-250目的細(xì)胞篩以去除未酶解的花粉管，重復(fù)3次，濾液加入到離心管中，，靜置2-3分鐘后吸取上清，上清液在100X g、10°C下離心10分鐘，去除上清液，再用胞外液清洗3次以去除酶的殘留和花粉管酶解碎片，所得沉淀為花粉管原生質(zhì)體； 5)液泡的分離:將液泡溶解緩沖液加入到步驟4)獲得的原生質(zhì)體中，用移液槍吸打3-5次，靜置5-10分鐘，顯微鏡下觀察液泡出現(xiàn)情況； 6)液泡的純化:將出現(xiàn)液泡的緩沖液轉(zhuǎn)移到Ficoll-400密度梯度工作液頂部離心，在26000rpm、10°C下離心15-30分鐘；離心后，F(xiàn)icoll-400密度梯度工作液12?15%濃度頂部淡紅色的一層為液泡，用剪過(guò)的移液槍頭吸出，顯微鏡下觀察，淡紅色、透明的為液泡。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的提取梨花粉管液泡的方法，其特征在于所述的花粉培養(yǎng)基配方為:100g/L蔗糖，0.3g/L Ca(N03)2.4H20, 30mM MES，0.lg/L硼酸溶于蒸餾水中并定容，用Tris堿調(diào)整pH值至5.9?6.4。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的提取梨花粉管液泡的方法，其特征在于所述的胞外液配方為:10mM 葡萄糖，1mM CaCl2, 5mM MES, 0.8-1M 山梨醇，用 Tris 將 pH 調(diào)至 5.5 ?6.0。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的提取梨花粉管液泡的方法，其特征在于液泡溶解液配方為:0.3-0.35M山梨醇，2-4mM EDTA, 2-5mM DTT和0.005%的中性紅，用Tris將pH調(diào)至7.5 ?8.0。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取梨花粉管液泡的方法，其特征在于Ficoll-400密度梯度工作液的配方為:12ml Ficoll-400密度梯度工作液包含2?4%、6?8%及12?15%三個(gè)梯度濃度各4ml，分別將Ficoll 400溶于pH 7.5?8.0的含0.5M的山梨醇，5mM CaCl2和25mM Tris-HCl緩沖液中配成要求的濃度。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的提取梨花粉管液泡的方法，其特征在于Ficoll-400密度梯度工作液的配方為:12ml Ficoll-400密度梯度工作液包含及13%三個(gè)梯度濃度各4ml，分別將Ficoll 400溶于pH 7.5?8.0的含0.5M的山梨醇，5mM CaCl2和25mMTris-HCl緩沖液中配成要求的濃度。
【文檔編號(hào)】C12N5/04GK104388380SQ201410757802
【公開(kāi)日】2015年3月4日 申請(qǐng)日期:2014年12月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月10日
【發(fā)明者】張紹鈴, 周宏勝, 吳巨友, 高永彬, 陶書(shū)田, 齊開(kāi)杰, 陳建清 申請(qǐng)人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)