一種天然二硫鍵與阿魏酸酯酶a功能相關(guān)性的驗證方法
【專利摘要】本發(fā)明的目的是提供一種天然二硫鍵與阿魏酸酯酶A功能相關(guān)性的驗證方法，以及突變阿魏酸酯酶A工程菌構(gòu)建、突變酶異源表達(dá)的方法。根據(jù)來源于A.usamii E001阿魏酸酯酶A(AuFaeA)的模擬空間結(jié)構(gòu)設(shè)計單突變C29T、C91T和C234T，得到突變阿魏酸酯酶A：AuFaeAC29T、AuFaeAC91T和AuFaeAC234T，其成熟肽基因序列為SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5。突變后該酶的酶活性和最適溫度都有大幅下降，證明了二硫鍵是影響阿魏酸酯酶A功能發(fā)揮的關(guān)鍵因素，為其它與AuFaeA一級結(jié)構(gòu)相似的A類阿魏酸酯酶的耐熱性改造奠定了基礎(chǔ)。
【專利說明】一種天然二硫鍵與阿魏酸酯酶A功能相關(guān)性的驗證方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及宇佐美曲霉（Aspergillus usamii)E001菌株阿魏酸酯酶A(AuFaeA) 結(jié)構(gòu)的同源建模，突變阿魏酸酯酶AuFaeAG29T、AuFaeA G91T和AuFaeAG234T工程菌的構(gòu)建及重組 突變阿魏酸酯酶的異源表達(dá)，屬于生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002] 阿魏酸酯酶（EC 3. I. 1. 73)又稱為肉桂酸酯酶或肉桂酰酯酶，從屬于羧酸酯酶 (EC 3. I. 1-)亞家族。該酶能夠水解植物細(xì)胞壁中肉桂酸與阿拉伯木聚糖之間及其與一些 果膠之間相連的酯鍵，從而釋放出阿魏酸或二聚體阿魏酸。根據(jù)阿魏酸酯酶一級結(jié)構(gòu)相似 性和對4種模式底物阿魏酸甲酯（MFA)、咖啡酸甲酯（MCA)、對香豆酸甲酯（MpCA)和芥子酸 甲酯（MSA)的特異性等因素，將阿魏酸酯酶進(jìn)一步分為A、B、C、D四類。至今，僅有源于黑 曲霉的A類阿魏酸酯酶的晶體結(jié)構(gòu)得到解析，且該類酶結(jié)構(gòu)中存在3個天然的二硫鍵。
[0003] 據(jù)報道，一個二硫鍵的形成可以為蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性貢獻(xiàn)2. 3-5. 2kcal/mol的能 量，有時二硫鍵還對蛋白質(zhì)的功能發(fā)揮起到促進(jìn)或抑制的作用。Le等將二硫鍵C162-C308 引入源于Candida antarctica的脂肪酶B，使得該酶在5(TC的半衰期提高了 4. 5倍。Wang 等將二硫鍵C1-C24引入源于Thermomyces Ianuginosus的木聚糖酶TLX，使得該酶的最適 作用溫度提高了 1(TC。相反的，源于Pseudomonas fragi的脂肪酶PFL由于二硫鍵的缺失 而導(dǎo)致該酶的熱穩(wěn)定性等性質(zhì)明顯下降。因此，驗證二硫鍵與蛋白質(zhì)功能的相關(guān)性可以從 兩個方面驗證，其中之一即將蛋白質(zhì)中的天然二硫鍵打斷，但是對于A類阿魏酸酯酶在這 方面的研究還鮮有報道。隨著基因工程技術(shù)等的快速發(fā)展，運用該手段對阿魏酸酯酶A分 子進(jìn)行改造即可驗證改造位點對酶蛋白功能的影響，為分子生物學(xué)的發(fā)展及其它酶類的改 造提供理論基礎(chǔ)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種天然二硫鍵與阿魏酸酯酶A功能相關(guān)性的驗證方法，以 及突變阿魏酸酯酶A工程菌構(gòu)建、突變酶異源表達(dá)的方法。
[0005] 本發(fā)明的技術(shù)方案：根據(jù)來源于A. usamii EOOl阿魏酸酯酶A(AuFaeA)的模擬空 間結(jié)構(gòu)分別設(shè)計單突變C29T、C91T和C234T，得到突變阿魏酸酯酶A :AuFaeAG29T、AuFaeAe9n 和AuFaeAG234T，分別驗證單個二硫鍵的缺失對酶功能的影響，其成熟肽基因 AufaeAG29T、 AufaeAran 和六11^^六。2341 序列分別為 SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 3 和 SEQ ID NO: 5。
[0006] 所述的由成熟肽基因編碼得到的AuFaeAG29T、AuFaeAran和AuFaeA G234T氨基酸序列 分別為 SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO:4 和 SEQ ID NO:6。
[0007] 所述的重組阿魏酸酯酶A的活性測定方法：
[0008] 以MFA為底物，高效液相（HPLC)分析阿魏酸的釋放量。具體操作為：移取900 μ L MFA(lmM，pH6.0)于2mLEP管中，45°C保溫10min，加入100μL適當(dāng)稀釋的酶液，反應(yīng) IOmin后加入400 μ L冰乙酸終止反應(yīng)，立即混勻進(jìn)行高效液相分析。以先在酶溶液中加入 400 μ L冰乙酸，再加底物溶液為對照。色譜條件：以甲醇、I %乙酸一步梯度洗脫，在IOmin 內(nèi)，甲醇濃度由50%上升至80%，流速lmL/min，柱溫30°C，檢測波長320nm，上樣量20 μ L。 根據(jù)峰面積，從標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的阿魏酸量，從而計算酶活。酶活單位定義：在測定條件 下（45°C、pH 6. 0)每分鐘產(chǎn)生1 μ mol阿魏酸所需的酶量為一個酶活單位（U)。
[0009] 所述的突變阿魏酸酯酶A基因的設(shè)計、克隆及表達(dá)：
[0010] ⑴氨基酸殘基突變位點的選定：以黑曲霉阿魏酸酯酶A的三維結(jié)構(gòu)（IUWC)為模 板，用Modeller 9. 9軟件模擬出AuFaeA的三維結(jié)構(gòu)。由其三維結(jié)構(gòu)觀察天然二硫鍵的位 置確定突變氨基酸位點以打斷單一天然二硫鍵。
[0011] ⑵突變基因 AufaeAG29T、AufaeAc9n和AufaeAG234T及其表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建：根據(jù)已 申請發(fā)明專利（申請?zhí)?：201210181372.X)中核苷酸序列及突變位點特點設(shè)計突變引物 C29T-R，C91T-R，C234T-F :
[0012] C29T-R : 5，-AGTCGATGGAATATTAGTTAGGTCGGCGT-3，，
[0013] C9IT-R : 5，-CGCAATCGTTAGTTTGAGGTAGAGT-3，，
[0014] C234T-F : 5 ' -ACTGGGGATGAACTACAGACTTGTGAGGCA-3 '，
[0015] C29T單突變：以本實驗室保存的pUCm-T-AufaeA為模板（申請?zhí)枺?01210181372. X)，用已申請發(fā)明專利（申請?zhí)枺?01210181372.X)中特異性引物FAE-F和C29T-R進(jìn)行第 一輪PCR，獲得基因片段AufaeA 29 ;以pUCm-T-AufaeA為模板，以第一輪PCR產(chǎn)物AufaeA29為 引物與已申請發(fā)明專利（申請?zhí)?：201210181372.X)中特異性引物FAE-R進(jìn)行第二輪大引 物 PCR。
[0016] C91T單突變：以pUCm-T-AufaeA為模板，用引物FAE-F和C91T-R進(jìn)行第一輪PCR， 獲得基因片段AufaeA 91 ;以pUCm-T-AufaeA為模板，以第一輪PCR產(chǎn)物AufaeA91為引物與 FAE-R進(jìn)行第二輪大引物PCR。
[0017] C234T單突變：以pUCm-T-AufaeA為模板，用引物C234T-F和FAE-R進(jìn)行第一輪 PCR，獲得基因片段AufaeA234 ;以pUCm-T-AufaeA為模板，以第一輪PCR產(chǎn)物AufaeA234為引 物與FAE-F進(jìn)行第二輪大引物PCR。
[0018] 分別將三個單突變的第二輪 PCR 產(chǎn)物（AufaeAG29T、AufaeAG91T 和 AufaeAG234T)用 1 % 瓊脂糖凝膠電泳分析，割膠回收目的條帶并與pUCm-T連接（pUCm-T-AufaeAe29T、-AufaeA ran 、-AufaeAe234T)。轉(zhuǎn)化JM109,經(jīng)酶切鑒定正確后送上海生工測序。
[0019] (3)重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建：將測序結(jié)果正確的pUCm-T-AufaeAe29T、-AufaeA raiT、-Auf aeAG234T和pPIC9K質(zhì)粒均用EcoR I和Not I進(jìn)行雙酶切，割膠回收的酶切產(chǎn)物在T4DNA連 接酶的作用下進(jìn)行連接，得到重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K_AufaeAG29T、-AufaeA G91T、-AufaeAG234T，并 對重組表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行序列測定。
[0020] (4)GS115/AufaeAG29T、/AufaeAraiT、/AufaeA G234T 重組子的構(gòu)建、表達(dá)及酶學(xué)特性的 測定：用Sal I對重組表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行線性化，按照畢赤酵母表達(dá)手冊進(jìn)行電轉(zhuǎn)、篩選，得到 高拷貝的畢赤酵母重組子GSl 15/AufaeAG29T、/AufaeAG91T、/AufaeAG234T ;按照手冊上的標(biāo)準(zhǔn)流 程進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)；發(fā)酵液經(jīng)初步純化后使用SDS-PAGE檢測目的蛋白分子量，并測定該酶的 溫度特性等。
[0021] 本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明提供了一種天然二硫鍵與阿魏酸酯酶A功能相關(guān)性的 驗證方法。通過構(gòu)建二硫鍵單缺失的阿魏酸酯酶A工程菌并誘導(dǎo)其表達(dá)，得到的重組突變 酶AUfaeAG29T、AUfaeAG91T和AufaeA G234T的酶活性和最適溫度都明顯下降，證明每個天然二硫 鍵對阿魏酸酯酶A的功能發(fā)揮有及其重要的作用，為其它與AuFaeA -級結(jié)構(gòu)相似的A類阿 魏酸酯酶的耐熱性改造奠定了基礎(chǔ)。

【具體實施方式】
[0022] 以下結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明的操作方法。但是這些實施例僅用于詳 細(xì)說明本發(fā)明，而不用于限制本發(fā)明的范圍。
[0023] 實施例1突變基因 AufaeAG29T、AufaeAG91T和AufaeAG234T及其表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
[0024] (1)采用大引物PCR技術(shù)構(gòu)造突變基因，主要分為兩步：以pUCm-T-AufaeA為模 板，以FAE-F，C29T-R為引物進(jìn)行第一輪PCR(94°C5min ;30個循環(huán)，94°C30s，53°C30s， 72°C 15s ;72°C IOmin ;KTC保存），獲得基因片段 AufaeA29 ;以 pUCm-T-AufaeA 為模板，以第 一輪PCR產(chǎn)物AufaeA29為引物與特異性引物FAE-R進(jìn)行第二輪大引物PCR(94°C 5min ;2個 循環(huán)，94°C 30s，45°C 30s，72°C 60s ;28 個循環(huán)，94°C 30s，53°C 30s，72°C ,60s ;72°C IOmin ; KTC保存）；將第二輪PCR產(chǎn)物I %瓊脂糖凝膠電泳分析，割膠回收目的條帶 并與pUCm-T連接（pUCm-T-AufaeAe29T)，轉(zhuǎn)化JM109,經(jīng)酶切鑒定正確后送上海生工測序。
[0025] (2)以pUCm-T-AufaeA為模板，以FAE-F，C9IT-R為引物進(jìn)行第一輪 PCR(94°C 5min ;30 個循環(huán)，94°C 30s，53°C 30s，72°C 15s ;72°C IOmin ;10°C保存），獲得基因 片段AufaeA91 ;以pUCm-T-AufaeA為模板，以第一輪PCR產(chǎn)物AufaeA91為引物與FAE-R進(jìn)行 第二輪大引物 PCR(94°C 5min ;2 個循環(huán)，94°C 30s，45°C 30s，72°C 60s ;28 個循環(huán)，94°C 30s， 53°〇308,721：，608;721：101^11;101：保存）；將第二輪？〇?產(chǎn)物411^記4-用1%瓊脂糖 凝膠電泳分析，割膠回收目的條帶并與PUCm-T連接（pUCm-T-AufaeA raiT)，轉(zhuǎn)化JM109,經(jīng)酶 切鑒定正確后送上海生工測序。
[0026] (3)以 pUCm-T-AufaeA 為模板，以 C234T-F，F(xiàn)AE-R 為引物進(jìn)行第一輪 PCR(94°C 5min ;30 個循環(huán)，94°C 30s，53°C 30s，72°C 15s ;72°C IOmin ;10°C保存），獲得基因 片段AufaeA234 ;以pUCm-T-AufaeA為模板，以第一輪PCR產(chǎn)物AufaeA234為引物與FAE-F進(jìn)行 第二輪大引物 PCR(94°C 5min ;2 個循環(huán)，94°C 30s，45°C 30s，72°C 60s ;28 個循環(huán)，94°C 30s， 53°〇308,721：，608;721：101^11;101：保存）；將第二輪？〇?產(chǎn)物411^記4。 2341用1%瓊脂糖 凝膠電泳分析，割膠回收目的條帶并與PUCm-T連接（pUCm-T-AufaeAe234T)，轉(zhuǎn)化JM109,經(jīng)酶 切鑒定正確后送上海生工測序。
[0027] ⑷將測序結(jié)果正確的 pUCm-T-AufaeAG29T、-AufaeA·、-AufaeAG234T 和 pPIC9K 質(zhì) 粒均用EcoR I和Not I進(jìn)行雙酶切，回收的酶切產(chǎn)物在T4DNA連接酶的作用下進(jìn)行連接， 得到重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K-AufaeAG29T、-AufaeA raiT、-AufaeAG234T，并對重組表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行序 列測定。
[0028] 實施例 2 GS115/AufaeAG29T、/AufaeAraiT、/AufaeAG234T 重組子的構(gòu)建、表達(dá)及性質(zhì)的 測定
[0029] 用 Sal I 對 pPIC9K_AufaeAG29T、_AufaeAG91T、_AufaeAG234T 進(jìn)行線性化，按照畢赤酵 母表達(dá)手冊進(jìn)行電轉(zhuǎn)化、篩選，得到高拷貝的畢赤酵母重組子GS115/AufaeAe29T。該工程菌 用1. 0%甲醇誘導(dǎo)72h。離心上清液為重組阿魏酸酯酶A粗酶液，它們的酶活性分別為0. 84、 0. 42和0. 45U/mL，經(jīng)SDS-PAGE檢測均為單一條帶，改造后重組AuFaeAG29T、AuFaeAG91T和 AuFaeAG234T的最適反應(yīng)溫度為25、25和35°C。突變酶的酶活性和最適溫度較原酶（11. 03U/ mL、45°C )都大幅下降。
【權(quán)利要求】
1?一種改造后的源自宇佐美曲霉（Aspergillus usamii)E001的阿魏酸酯酶A基因 AufaeAG29T、AufaeAG91T和AufaeAG234T，其對應(yīng)的核苷酸和蛋白質(zhì)序列分別為SEQ ID NO: 1和 SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3 和 SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5 和 SEQ ID N0:6。
2.突變阿魏酸酯酶A工程菌的構(gòu)建和表達(dá)方法： (1)突變殘基位點的選定：以黑曲霉阿魏酸酯酶A的三維結(jié)構(gòu)（1UWC)為模板，用 Modeller 9. 9軟件模擬出AuFaeA的三維結(jié)構(gòu)。由其三維結(jié)構(gòu)觀察天然二硫鍵的位置確定 突變氨基酸位點以打斷單一天然二硫鍵； ⑵突變基因AufaeAG29T、AufaeAG91T和AufaeAG234T及其表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建：根據(jù)已申請發(fā) 明專利（申請?zhí)枺?01210181372.X)中核苷酸序列及突變位點特點設(shè)計突變引物C29T-R， C91T-R, C234T-F ： C29T-R :5' -AGTCGATGGAATATTAGTTAGGTCGGCGT-3'， C91T-R :5' -CGCAATCGTTAGTTTGAGGTAGAGT-3'， C234T-F :5' -ACTGGGGATGAACTACAGACTTGTGAGGCA-3'， C29T單突變：以本實驗室保存的pUCm-T-AufaeA為模板（申請?zhí)枺?01210181372. X)， 用已申請發(fā)明專利（申請?zhí)枺?01210181372.X)中特異性引物FAE-F和C29T-R進(jìn)行第一輪 PCR，獲得基因片段AufaeA29 ;以pUCm-T-AufaeA為模板，以第一輪PCR產(chǎn)物AufaeA29為引 物與已申請發(fā)明專利（申請?zhí)枺?01210181372.X)中特異性引物FAE-R進(jìn)行第二輪大引物 PCR ； C91T單突變：以pUCm-T-AufaeA為模板，用引物FAE-F和C91T-R進(jìn)行第一輪PCR，獲得 基因片段AufaeA91 ;以pUCm-T-AufaeA為模板，以第一輪PCR產(chǎn)物AufaeA91為引物與FAE-R 進(jìn)行第二輪大引物PCR; C234T單突變：以pUCm-T-AufaeA為模板，用引物C234T-F和FAE-R進(jìn)行第一輪PCR， 獲得基因片段AufaeA234 ;以pUCm-T-AufaeA為模板，以第一輪PCR產(chǎn)物AufaeA234為引物與 FAE-F進(jìn)行第二輪大引物PCR ; 分別將三個單突變的第二輪PCR產(chǎn)物（AufaeAG29T、AufaeAG91T和AufaeA G234T)用1%瓊脂 糖凝膠電泳分析，割膠回收目的條帶并與pUCm-T連接（pUCm-T-AufaeAe29T、-AufaeA e91T、-Au faeAe234T)。轉(zhuǎn)化JM109,經(jīng)酶切鑒定正確后送上海生工測序； (3) 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建：將測序結(jié)果正確的PUCm-T-AufaeAe29T、-AufaeA e91T、-AufaeAe 2341和PPIC9K質(zhì)粒均用EcoR I和Not I進(jìn)行雙酶切，割膠回收的酶切產(chǎn)物在T4DNA連接酶 的作用下進(jìn)行連接，得到重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K_AufaeAG29T、-AufaeAG91T、-AufaeA G234T，并對重 組表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行序列測定； (4) GS115/AufaeAG29T、/AufaeAG91T、/AufaeA G234T重組子的構(gòu)建、表達(dá)及酶學(xué)特性的測定： 用Sal I對pPIC9K_AufaeAG29T、_AufaeAG91T、_AufaeAG234T進(jìn)行線性化,按照畢赤酵母表達(dá)手 冊進(jìn)行電轉(zhuǎn)化、篩選，得到高拷貝的畢赤酵母重組子GS115/AufaeAe29T。該工程菌用1.0%甲 醇誘導(dǎo)72h。離心上清液為重組阿魏酸酯酶A粗酶液，它們的酶活性分別為0. 84、0. 42和 0. 45U/mL，經(jīng) SDS-PAGE 檢測均為單一條帶，改造后重組 AuFaeAG29T、AuFaeAG91T 和 AuFaeAG234T的最適反應(yīng)溫度為25、25和35°C。突變酶的酶活性和最適溫度較原酶（11. 03U/mL、45°C ) 都大幅下降。
【文檔編號】C12N15/81GK104404066SQ201410758070
【公開日】2015年3月11日 申請日期:2014年12月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月10日
【發(fā)明者】鄔敏辰, 殷欣, 姚瑤, 李劍芳, 胡蝶, 吳芹 申請人:江南大學(xué)