一種三葉青基因組dna提取純化的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種三葉青基因組DNA提取純化的方法，包括如下步驟：將三葉青葉片純化后加入細(xì)胞核裂解緩沖液，于65℃水浴后采用萃取液進(jìn)行萃取，取上清液，加入等體積的異丙醇沉淀，得到DNA沉淀物；依次用70％乙醇、75％乙醇洗滌DNA沉淀物，干燥，加入TE緩沖液，待DNA沉淀物溶解后加入RNA消化酶、于37℃水浴消化，得到三葉青基因組DNA。本發(fā)明制備得到的三葉青基因組DNA的質(zhì)量好，其葉綠素DNA和線粒體DNA含量低，所含多糖、多酚、色素、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)少，純化后DNA的OD260/OD280達(dá)到了1.954，濃度為866ng/μL，可以用于構(gòu)建遺傳圖譜和基因組測序等方面研究。
【專利說明】一種三葉青基因組DNA提取純化的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于DNA提取純化【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及一種三葉青基因組DNA提取純化的方法。

【背景技術(shù)】
[0002]三葉青又名金線吊葫蘆、絲線吊金鐘、三葉扁藤、石老鼠等，系葡萄科崖爬藤屬植物三葉青Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg.，以塊根或全草入藥，具有清熱解毒、祛風(fēng)化痰、活血止痛等功效，主治小兒高熱驚厥、百日咳、疔瘡癰疽、淋巴結(jié)結(jié)核、痢疾、支氣管炎、肺炎、咽喉炎、肝炎及病毒性腦膜炎，外用治毒蛇咬傷，扁桃體炎，蜂窩織炎，跌打損傷，主要分布于浙江、江西、福建、湖北、湖南、廣東、四川等地區(qū)。
[0003]二葉青的提取制劑對(duì)食道癌、胃癌、肺癌、肝癌、腎癌、胰腺癌、膽囊癌、乳腺癌、宮頸癌、白血病、淋巴癌、卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌等多種原發(fā)癌、轉(zhuǎn)移癌等均具有很好的治療作用。對(duì)腫瘤化療帶來的種種不良反應(yīng)，如食欲低下、嘔吐、惡心、頭發(fā)脫落以及白細(xì)胞減少等都有明顯的改善作用，對(duì)晚期患者有緩解疼痛作用，還能有效地提高人體的免疫功能。三十年前，中國的三葉青資源極為豐富，野生三葉青除作藥用外，還常做菜肴食用。隨著社會(huì)的發(fā)展、自然環(huán)境的惡化、以及人們無節(jié)制地亂采濫挖，致使野生三葉青野生資源枯竭，瀕臨滅絕。三葉青為多年生植物，次生代謝產(chǎn)物多，DNA提取純化難，如何有效地利用三葉青資源，提取純化其DNA，成為大家關(guān)注的一個(gè)難題。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺點(diǎn)與不足，提供一種三葉青基因組DNA提取純化的方法。
[0005]本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):一種三葉青基因組DNA提取純化的方法，包括如下步驟:將三葉青葉片純化后加入細(xì)胞核裂解緩沖液，于65°C水浴40min后采用萃取液進(jìn)行萃取，取上清液，加入等體積的異丙醇沉淀，得到DNA沉淀物；依次用70%乙醇、75%乙醇洗滌DNA沉淀物，干燥，加入TE緩沖液(Tris-EDTA緩沖液)，待DNA沉淀物溶解后加入RNA消化酶、于37°C水浴消化30min，得到三葉青基因組DNA，于_20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0006]所述的三葉青葉片優(yōu)選為研磨成顆粒狀的三葉青葉片；
[0007]所述的三葉青葉片優(yōu)選采用如下方法研磨成顆粒狀的三葉青葉片:剪取三葉青當(dāng)年生新鮮葉片，去離子水清洗三遍，晾干后放入研缽中，加入pvp (聚乙烯吡咯烷酮)，液氮中研磨至顆粒狀的三葉青葉片。
[0008]所述的純化優(yōu)選采用如下方法進(jìn)行:將三葉青葉片置于盛有細(xì)胞核純化液的離心管中進(jìn)行純化，離心，取沉淀，得到純化后的三葉青葉片；
[0009]所述的細(xì)胞核純化液由如下成分組成:100mM Tris-HCl pH 8.0、20mM EDTA、0.25MNaCl以及2wt% β -巰基乙醇。
[0010]所述的細(xì)胞核裂解緩沖液由如下成分組成:2wt % CTAB、2wt % PVP, 10mMTris-HCl pH8.0、25mM EDTA 及 2.0M NaCl。
[0011]所述的萃取液為體積比為24:1的氯仿-異戊醇。
[0012]所述的萃取的次數(shù)優(yōu)選為兩次。
[0013]所述的沉淀采用如下方法進(jìn)行:-20°C冰箱放置30min。
[0014]本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果:本發(fā)明通過將三葉青葉片純化后加入細(xì)胞核裂解緩沖液進(jìn)行裂解，然后通過TE緩沖液溶解和RNA消化酶消化，得到三葉青基因組DNA。該三葉青基因組DNA的質(zhì)量好，其葉綠素DNA和線粒體DNA含量低，所含多糖、多酚、色素、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)少，純化后DNA的0D260/0D280達(dá)到了 1.954，濃度為866ng/ μ L，可以用于構(gòu)建遺傳圖譜和基因組測序等方面研宄。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1為實(shí)施例1的三葉青基因組DNA提取純化的流程示意圖。

【具體實(shí)施方式】
[0016]下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。
[0017]實(shí)施例1
[0018]如圖1所示，本發(fā)明提供了一種三葉青基因組DNA提取純化的方法，包括如下步驟:
[0019]剪取三葉青當(dāng)年生新鮮葉片，去離子水清洗三遍，瞭干后放入研缽中，加入pvp，液氮中研磨至粉末；將粉末轉(zhuǎn)入盛有細(xì)胞核純化液的離心管中進(jìn)行純化(細(xì)胞核純化液由如下成分組成:100mMTris-HCl pH 8.0、20mM EDTA、0.25M NaCl 以及 2wt% β-巰基乙醇)，將得到的細(xì)胞核純化液離心，取沉淀，加入預(yù)熱好的細(xì)胞核裂解緩沖液，65°C水浴進(jìn)行裂解消化60min(細(xì)胞核裂解緩沖液由如下成分組成:2wt% CTAB,2wt% PVPUOOmMTris-HCl (pH8.0)、25mM EDTA、2.0M NaCl)，取上清，加入等體積的氯仿-異戊醇(V:V =24:1)進(jìn)行萃取，離心，取上清，重復(fù)萃取I次，合并上清，加入等體積的異丙醇，輕緩顛倒混勻，-20°C冰箱放置30min，離心，取沉淀，依次用70%與75%乙醇漂洗各I次，室溫微干，加入Tris-EDTA緩沖液溶解，再加入RNA消化酶，37°C水浴消化RNA 30min，得到三葉青基因組DNA，于-20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0020]得到的三葉青基因組DNA的質(zhì)量好，其葉綠素DNA和線粒體DNA含量低，所含多糖、多酚、色素、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)少，純化后DNA的0D260/0D280達(dá)到了 1.954，濃度為866ng/μ L，可以用于構(gòu)建遺傳圖譜和基因組測序等方面。
[0021]上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)。
【權(quán)利要求】
1.一種三葉青基因組DNA提取純化的方法，其特征在于，包括如下步驟:將三葉青葉片純化后加入細(xì)胞核裂解緩沖液，于65°C水浴40min后采用萃取液進(jìn)行萃取，取上清液，加入等體積的異丙醇沉淀，得到DNA沉淀物；依次用70%乙醇、75%乙醇洗滌DNA沉淀物，干燥，加入TE緩沖液，待DNA沉淀物溶解后加入RNA消化酶、于37°C水浴消化30min，得到三葉青基因組DNA。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的三葉青基因組DNA提取純化的方法，其特征在于，所述的三葉青葉片為研磨成顆粒狀的三葉青葉片。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的三葉青基因組DNA提取純化的方法，其特征在于，所述的三葉青葉片采用如下方法研磨成顆粒狀的三葉青葉片:剪取三葉青當(dāng)年生新鮮葉片，去離子水清洗三遍，瞭干后放入研缽中，加入pvp，液氮中研磨至顆粒狀的三葉青葉片。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的三葉青基因組DNA提取純化的方法，其特征在于，所述的純化采用如下方法進(jìn)行:將三葉青葉片置于盛有細(xì)胞核純化液的離心管中進(jìn)行純化，離心，取沉淀，得到純化后的三葉青葉片。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的三葉青基因組DNA提取純化的方法，其特征在于，所述的細(xì)胞核純化液由如下成分組成:10mM Tris-HCl pH 8.0、20mM EDTA、0.25MNaCl以及2wt%β-巰基乙醇。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的三葉青基因組DNA提取純化的方法，其特征在于，所述的細(xì)胞核裂解緩沖液由如下成分組成:2wt% CTAB、2wt% PVP、100mM Tris-HCl ρΗ8.0、25mM EDTA及 2.0M NaCl。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的三葉青基因組DNA提取純化的方法，其特征在于，所述的萃取液為體積比為24:1的氯仿-異戊醇。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的三葉青基因組DNA提取純化的方法，其特征在于，所述的沉淀采用如下方法進(jìn)行:-20°C冰箱放置30min。
【文檔編號(hào)】C12N15/10GK104450681SQ201410763362
【公開日】2015年3月25日 申請(qǐng)日期:2014年12月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月11日
【發(fā)明者】華金渭, 朱波, 吉慶勇, 程文亮 申請(qǐng)人:麗水市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院