一種石油降解瓊氏不動桿菌菌劑的制備方法
【專利摘要】一種石油降解瓊氏不動桿菌菌劑的制備方法，涉及一種石油降解菌劑的制備方法。本發(fā)明為了解決目前直接利用微生物發(fā)酵液降解石油存在運輸和貯存不便，對人傷害較大，傳統(tǒng)微生物菌劑存在成本高的問題。方法：一、挑取瓊氏不動桿菌接種到培養(yǎng)基中，培養(yǎng)得一級種子液；二、將一級種子液加入到發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)得細菌發(fā)酵液；三、將玉米芯粉、米糠和麥麩滅菌后，取玉米芯粉、米糠、麥麩中的任意兩種混合，向混合物中加入細菌發(fā)酵液、氯化鈉和磷酸二氫鉀，混合均勻后烘干密封保存，即得石油降解瓊氏不動桿菌菌劑。本發(fā)明具有價格低廉，易降解，無二次污染，可同時提高土壤肥力的優(yōu)點，用于降解石油。
CGMCC No10054
20141125
【專利說明】 一種石油降解瓊氏不動桿菌菌劑的制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種石油降解菌劑的制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002]石油又稱原油，成分十分復(fù)雜極難降解。近年來隨著石油開采及使用量的增加，石油污染物的降解得到了越來越多的重視。微生物降解因其成本低，效率高，無二次污染的特點成為研究的熱點。但是直接利用微生物發(fā)酵液降解石油存在許多問題。首先，發(fā)酵液體積較大，若直接應(yīng)用會給運輸和貯存帶來極大不便。而且一般微生物發(fā)酵液氣味較重對工作人員傷害較大，不符合“以人為本”的理念。因此，許多科學(xué)提出制備微生物菌劑的方法，傳統(tǒng)微生物菌劑制備包括海藻酸鈉包埋及各種谷物粉包埋等。以上方法雖解決了直接應(yīng)用菌液的一些問題，但是也存在著成本高的缺點，不利于技術(shù)的大面積推廣。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明為了解決目前直接利用微生物發(fā)酵液降解石油存在運輸和貯存不便，對人傷害較大，傳統(tǒng)微生物菌劑存在成本高的問題，提供一種石油降解瓊氏不動桿菌菌劑的制備方法。
[0004]本發(fā)明石油降解瓊氏不動桿菌菌劑的制備方法，按以下步驟進行:
[0005]一、挑取瓊氏不動桿菌(Acinetobacter junii) Z3BS接種到25mL牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，于120r/min、28°C培養(yǎng)16?24h，獲得一級種子液；
[0006]二、將步驟一獲得的一級種子液按體積百分含量0.5%?2.0%的接種量加入到發(fā)酵培養(yǎng)基中，于120?150r/min、28°C培養(yǎng)24?48h，得細菌發(fā)酵液；
[0007]三、將玉米芯粉、米糠和麥麩滅菌后，取玉米芯粉、米糠、麥麩中的任意兩種，按重量比1:1混合，得混合物，向混合物中加入細菌發(fā)酵液、氯化鈉和磷酸二氫鉀，混合均勻后于28°C烘干密封保存，即得到石油降解瓊氏不動桿菌菌劑。
[0008]步驟一所述瓊氏不動桿菌Z3BS保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址是北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，保藏日期為2014年11月25日，保藏編號為CGMCC N0.10054,分類命名:瓊氏不動桿菌Acinetobacter junii。
[0009]本發(fā)明中采用玉米芯，米糠，麥麩作為石油降解菌劑的主要材料，具有價格低廉，易降解，無二次污染，可同時提高土壤肥力的優(yōu)點，菌劑進入土壤后，降解菌可馬上發(fā)揮作用，縮短了降解時間，且此菌劑能夠長期保持瓊氏不動桿菌的活性。因此，具有很高的實用性及推廣價值。本發(fā)明中涉及的石油降解菌發(fā)酵培養(yǎng)基，采用的主要材料是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的副產(chǎn)品，這大大降低了石油降解成本，且可增加農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的附加值，對于石油污染的生物修復(fù)起到了推動作用。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0010]圖1為不接菌的石油氣相色譜圖；
[0011]圖2為瓊氏不動桿囷降解14d后石油氣相色譜圖。

【具體實施方式】
[0012]【具體實施方式】一:本實施方式石油降解瓊氏不動桿菌菌劑的制備方法，按以下步驟進行:
[0013]一、挑取瓊氏不動桿菌(Acinetobacter junii) Z3BS接種到25mL牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，于120r/min、28°C培養(yǎng)16?24h，獲得一級種子液；
[0014]二、將步驟一獲得的一級種子液按體積百分含量0.5%?2.0%的接種量加入到發(fā)酵培養(yǎng)基中，于120?150r/min、28°C培養(yǎng)24?48h，得細菌發(fā)酵液；
[0015]三、將玉米芯粉、米糠和麥麩滅菌后，取玉米芯粉、米糠、麥麩中的任意兩種，按重量比1:1混合，得混合物，向混合物中加入細菌發(fā)酵液、氯化鈉和磷酸二氫鉀，混合均勻后于28°C烘干密封保存，即得到石油降解瓊氏不動桿菌菌劑。
[0016]步驟一所述瓊氏不動桿菌Z3BS保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址是北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，保藏日期為2014年11月25日，保藏編號為CGMCC N0.10054,分類命名:瓊氏不動桿菌Acinetobacter junii。
[0017]瓊氏不動桿菌的石油降解性能測定:
[0018]挑取瓊氏不動桿菌Z3BS接種到25mL牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，于120r/min、28°C培養(yǎng)16?24h。取ImL上述培養(yǎng)液接種到10mL含5% (v/v)石油的無機培養(yǎng)基中，28°C搖床培養(yǎng)14d。培養(yǎng)液每次加入15mL色譜純正已烷超聲離心萃取三次，每次12min，合并萃取液，揮干后加入1mL色譜純正已烷，氣相色譜比面積法測定石油降解率。以不接菌含5%(v/v)石油的無機培養(yǎng)基為空白對照，見圖1。石油萃取方法同上。此瓊氏不動桿菌14d石油降解率為69.3%?72.1%，見圖2。
[0019]無機培養(yǎng)基:硝酸鉀lg/L，磷酸二氫鉀lg/L，硝酸銨lg/L，硫酸鎂0.2g/L，無水氯化鈣 0.02g/L，三氯化鐵 0.05g/L, pH 為 7.2。
[0020]【具體實施方式】二:本實施方式與【具體實施方式】一不同的是:將步驟一獲得的一級種子液按體積百分含量1%?1.5%的接種量加入到發(fā)酵培養(yǎng)基中。其它與【具體實施方式】一相同。
[0021]【具體實施方式】三:本實施方式與【具體實施方式】一或二不同的是:步驟二中發(fā)酵培養(yǎng)基配方為:從玉米芯、米糠、麥麩中的選擇任意兩種，每種物質(zhì)均為5g/L，氯化鈉2g/L，磷酸二氫鉀lg/L,硝酸銨lg/L,無水硫酸鎂0.05g/L,無水氯化韓0.05g/L,加蒸懼水定容至1L, pH為7.2。其它與【具體實施方式】一或二相同。
[0022]【具體實施方式】四:本實施方式與【具體實施方式】一至三之一不同的是:步驟二中于135r/min、28°C培養(yǎng)35h。其它與【具體實施方式】一至三之一相同。
[0023]【具體實施方式】五:本實施方式與【具體實施方式】一至四之一不同的是:步驟三中細菌發(fā)酵液中瓊氏不動桿菌的活菌數(shù)為18?1ltl個/mL。其它與【具體實施方式】一至四之一相同。
[0024]【具體實施方式】六:本實施方式與【具體實施方式】一至五之一不同的是:步驟三中細菌發(fā)酵液的重量為混合物的0.7?1.0倍。其它與【具體實施方式】一至五之一相同。
[0025]【具體實施方式】七:本實施方式與【具體實施方式】一至五之一不同的是:步驟三中細菌發(fā)酵液的重量為混合物的0.8?0.9倍。其它與【具體實施方式】一至五之一相同。
[0026]【具體實施方式】八:本實施方式與【具體實施方式】一至七之一不同的是:步驟三中氯化鈉的質(zhì)量占混合物質(zhì)量的0.2%。其它與【具體實施方式】一至七之一相同。
[0027]【具體實施方式】九:本實施方式與【具體實施方式】一至八之一不同的是:步驟三中磷酸二氫鉀的質(zhì)量占混合物質(zhì)量的0.1%。其它與【具體實施方式】一至八之一相同。
[0028]【具體實施方式】十:本實施方式石油降解瓊氏不動桿菌菌劑的制備方法，按以下步驟進行:
[0029]一、挑取瓊氏不動桿菌Z3BS接種到25mL牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，于120r/min、28°C培養(yǎng)20h，獲得一級種子液；
[0030]二、將步驟一獲得的一級種子液按體積百分含量1.0%的接種量加入到發(fā)酵培養(yǎng)基中，于120r/min、28°C培養(yǎng)32h，得細菌發(fā)酵液；
[0031]三、將玉米芯粉和米糠滅菌后，取玉米芯粉和米糠各20g，裝入滅菌燒杯中，之后加入32g細菌發(fā)酵液、0.09g氯化鈉和0.05g磷酸二氫鉀，用4層紗布密封燒杯，以上步驟在無菌操作臺中進行，之后在28°C烘干后密封保存，即得到石油降解瓊氏不動桿菌菌劑。其中細菌發(fā)酵液中瓊氏不動桿菌的活菌數(shù)為18?101°個/mL。
[0032]15d后菌劑中活菌數(shù)仍可維持在16?18個/g。
[0033]步驟一所述瓊氏不動桿菌Z3BS保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址是北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，保藏日期為2014年11月25日，保藏編號為 CGMCC N0.10054。
[0034]步驟二中發(fā)酵培養(yǎng)基配方為:從玉米芯、米糠、麥麩中的選擇任意兩種，每種物質(zhì)均為5g/L，氯化鈉2g/L，磷酸二氫鉀lg/L，硝酸銨lg/L，無水硫酸鎂0.05g/L,無水氯化鈣0.05g/L，加蒸餾水定容至lL，pH為7.2。
[0035]【具體實施方式】^:本實施方式石油降解瓊氏不動桿菌菌劑的制備方法，按以下步驟進行:
[0036]一、挑取瓊氏不動桿菌Z3BS接種到25mL牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，于120r/min、28°C培養(yǎng)20h，獲得一級種子液；
[0037]二、將步驟一獲得的一級種子液按體積百分含量1.0%的接種量加入到發(fā)酵培養(yǎng)基中，于120r/min、28°C培養(yǎng)32h，得細菌發(fā)酵液；
[0038]三、將玉米芯粉和麥麩滅菌后，取玉米芯粉和麥麩各20g，裝入滅菌燒杯中，之后加入32g細菌發(fā)酵液、0.08g氯化鈉和0.04g磷酸二氫鉀，用4層紗布密封燒杯，以上步驟在無菌操作臺中進行，之后在28°C烘干后密封保存，即得到石油降解瓊氏不動桿菌菌劑。其中細菌發(fā)酵液中瓊氏不動桿菌的活菌數(shù)為18?101°個/mL。
[0039]15d后菌劑中活菌數(shù)仍可維持在16?18個/g。
[0040]步驟一所述瓊氏不動桿菌Z3BS保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址是北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，保藏日期為2014年11月25日，保藏編號為 CGMCC N0.10054。
[0041]步驟二中發(fā)酵培養(yǎng)基配方為:從玉米芯、米糠、麥麩中的選擇任意兩種，每種物質(zhì)均為5g/L，氯化鈉2g/L，磷酸二氫鉀lg/L，硝酸銨lg/L，無水硫酸鎂0.05g/L,無水氯化鈣0.05g/L，加蒸餾水定容至lL，pH為7.2。
[0042]【具體實施方式】十二:本實施方式石油降解瓊氏不動桿菌菌劑的制備方法，按以下步驟進行:
[0043]一、挑取瓊氏不動桿菌Z3BS接種到25mL牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，于120r/min、28°C培養(yǎng)20h，獲得一級種子液；
[0044]二、將步驟一獲得的一級種子液按體積百分含量1.0%的接種量加入到發(fā)酵培養(yǎng)基中，于120r/min、28°C培養(yǎng)32h，得細菌發(fā)酵液；
[0045]三、將米糠和麥麩滅菌后，取米糠和麥麩各20g，裝入滅菌燒杯中，之后加入32g細菌發(fā)酵液、0.1g氯化鈉和0.06g磷酸二氫鉀，用4層紗布密封燒杯，以上步驟在無菌操作臺中進行，之后在28°C烘干后密封保存，即得到石油降解瓊氏不動桿菌菌劑。其中細菌發(fā)酵液中瓊氏不動桿菌的活菌數(shù)為18?101°個/mL。
[0046]15d后菌劑中活菌數(shù)仍可維持在16?18個/g。
[0047]步驟一所述瓊氏不動桿菌Z3BS保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址是北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，保藏日期為2014年11月25日，保藏編號為 CGMCC N0.10054。
[0048]步驟二中發(fā)酵培養(yǎng)基配方為:從玉米芯、米糠、麥麩中的選擇任意兩種，每種物質(zhì)均為5g/L，氯化鈉2g/L，磷酸二氫鉀lg/L，硝酸銨lg/L，無水硫酸鎂0.05g/L,無水氯化鈣0.05g/L，加蒸餾水定容至lL，pH為7.2。
[0049]為驗證本發(fā)明的有益效果，進行以下實驗:
[0050]200克滅菌土壤中加入5% (v/w)滅菌石油后充分拌勻，分別接種實施例1-3制備的菌劑各20g及適量滅菌水，每種設(shè)三個重復(fù)，以不接菌的石油滅菌土壤為空白對照，重量法采用下面的公式計算石油的降解率(μ)。14d三種菌劑的降解率分別為65.9%，68.1%,64.2%。
[0051]μ = (ffo-ffx) /ffo X 100%
[0052]式中:Wo—對照中殘余石油含量；
[0053]Wx—接種菌劑土壤中殘余石油量。
【權(quán)利要求】
1.一種石油降解瓊氏不動桿菌菌劑的制備方法，其特征在于該方法按以下步驟進行: 一、挑取瓊氏不動桿菌(Acinetobacterjunii)Z3BS接種到25mL牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，于120r/min、28°C培養(yǎng)16?24h，獲得一級種子液； 二、將步驟一獲得的一級種子液按體積百分含量0.5%?2.0%的接種量加入到發(fā)酵培養(yǎng)基中，于120?150r/min、28°C培養(yǎng)24?48h，得細菌發(fā)酵液； 三、將玉米芯粉、米糠和麥麩滅菌后，取玉米芯粉、米糠、麥麩中的任意兩種，按重量比1:1混合，得混合物，向混合物中加入細菌發(fā)酵液、氯化鈉和磷酸二氫鉀，混合均勻后于28°C烘干密封保存，即得到石油降解瓊氏不動桿菌菌劑； 步驟一所述瓊氏不動桿菌Z3BS保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址是北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，保藏日期為2014年11月25日，保藏編號為 CGMCC N0.10054。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種石油降解瓊氏不動桿菌菌劑的制備方法，其特征在于將步驟一獲得的一級種子液按體積百分含量1%?1.5%的接種量加入到發(fā)酵培養(yǎng)基中。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種石油降解瓊氏不動桿菌菌劑的制備方法，其特征在于步驟二中發(fā)酵培養(yǎng)基配方為:從玉米芯粉、米糠、麥麩中的選擇任意兩種，每種物質(zhì)均為5g/L，氯化鈉2g/L，磷酸二氫鉀lg/L，硝酸銨lg/L，無水硫酸鎂0.05g/L,無水氯化鈣0.05g/L,加蒸懼水定容至1L, pH為7.2。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種石油降解瓊氏不動桿菌菌劑的制備方法，其特征在于步驟二中于 135r/min、28°C 培養(yǎng) 35h。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種石油降解瓊氏不動桿菌菌劑的制備方法，其特征在于步驟三中細菌發(fā)酵液中瓊氏不動桿菌的活菌數(shù)為18?101°個/mL。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種石油降解瓊氏不動桿菌菌劑的制備方法，其特征在于步驟三中細菌發(fā)酵液的重量為混合物的0.7?1.0倍。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種石油降解瓊氏不動桿菌菌劑的制備方法，其特征在于步驟三中細菌發(fā)酵液的重量為混合物的0.8?0.9倍。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種石油降解瓊氏不動桿菌菌劑的制備方法，其特征在于步驟三中氯化鈉的質(zhì)量占混合物質(zhì)量的0.2%。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的一種石油降解瓊氏不動桿菌菌劑的制備方法，其特征在于步驟三中磷酸二氫鉀的質(zhì)量占混合物質(zhì)量的0.1%。
【文檔編號】C12N1/20GK104450583SQ201410765629
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年12月12日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月12日
【發(fā)明者】楊慶麗, 董艷, 姬妍茹, 劉宇峰, 張正海, 高媛, 王月明, 潘靜 申請人:黑龍江省科學(xué)院大慶分院